LABORATORIO DE QUIMICA ANALITICA II
PRACTICA No. 2
CROMATOGRAFIA CAPA FINA:
SEPARACION DE LOS COMPONENTES DE UNA MUESTRA DE DIFERENTES AMINOÁCIDOS
INTRODUCCIÓN. La cromatografía se define como la separación de una mezcla de dos o mas
compuestos por distribución entre dos fases, una de las cuales es estacionaria y la otra una fase móvil.
Varios tipos de cromatografía son posibles, dependiendo de la naturaleza de las dos fases
involucradas: sólido-liquido (capa fina, papel o columna), liquido-liquido y gases-liquido (fase vapor).
Todas las técnicas cromatográficas dependen de la distribución de los componentes de la mezcla
entre dos fases inmiscibles: una fase móvil, llamada también activa, que transporta las sustancias que
se separan y que progresa en relación con la otra, denominada fase estacionaria. La fase móvil
puede ser un líquido o un gas y la estacionaria puede ser un sólido o un líquido. Todos los sólidos
finamente pulverizados tienen el poder de adsorber en mayor o menor grado otras sustancias sobre
su superficie; y, similarmente, todas las sustancias pueden ser adsorbidas, unas con más facilidad que
otras. Este fenómeno de adsorción selectiva es el principio fundamental de la cromatografía. En este
caso se utiliza una placa recubierta con fase estacionaria manteniendo un pequeño espesor
constante a lo largo de la placa. El eluyente ascenderá, por capilaridad, por la placa y arrastrará los
componentes a lo largo de ésta produciendo “manchas” de los componentes.
OBJETIVO: Que el alumno comprenda los efectos de la separación de los componentes de una
muestra de aminoácidos previamente eluída en una columna empacada, a través de la técnica de
cromatografía en capa fina.
MATERIALES
1 cromatoplaca de cromatografía de capa fina
de 20x20 cm DC Kieselgel 60 F254. REACTIVOS
1 Burbuja Niveladora (profesor) Agua Destilada
2 Cámaras de Corrimiento para Cromatoplacas Ácido Acético
1 Lámpara UV-Visible butano
1 Gradilla Ninhidrina en Etanol-Agua al 50%
1 Mechero Bunsen Alumnos:
5 Capilares de Vidrio Muestras Obtenidas en la Practica 1
1 Piceta con Agua 1 Par de guantes por alumno
1 Vaso de Precipitados de 250 mL 1 Regla
4 Vaso de precipitado de 100 mL 1 Lápiz
1 Pliego de Papel Filtro 1 Secadora para el Cabello
1 Pliego de papel amarillo
METODOLOGÍA
Colocar la cromatoplaca previamente en una estufa a 40ºC durante 30 min. Lavar y secar la cámara
de cromatográfica y ubicarla nivelada en un lugar donde se realizará el corrimiento. Posteriormente,
cubrir con un pliego de papel filtro una de las paredes interiores de la cámara cromatográfica y
adicionar dentro de la cámara una mezcla butano : agua :ácido acético([Link] respectivamente),
hasta un nivel menor a 0.5cm de altura y tapar para que el ambiente interior se sature. Tomar un
capilar por los extremos y a través de la llama de un mechero Bunsen en llama azul, se calienta el
capilar por la parte media, al mismo tiempo se jala por los extremos, obteniendo dos micropuntas de
un capilar, quebrando la punta para obtener Por otro lado, la placa se tomará siempre con los
guantes y se marcan en forma tenue y con un lápiz, carriles paralelos de 1cm de ancho. La cantidad
de carriles debe ser igual al número de muestras colectadas en la practica No 1. De la misma forma
se marca suavemente el origen a 1cm del borde inferior, que servirá para colocar las muestras. Cada
una de las muestras que previamente deben ser redisueltas en metanoly son absorbidas por el capilar
y se debe aplicar puntualmente en la cromatoplaca, dejando secar en cada aplicación. Efectuar
este ultimo proceso 6 veces, evitando que la mancha crezca en tamaño. Posteriormente colocar con
cuidado la cromatoplaca en el interior de la cámara y cerrar. Esperar que el corrimiento se realice
hasta que el frente del solvente llegue a 1cm antes del borde de superior, evitar movimientos en la
cámara. Marcar este nivel con el lápiz; dejar secar la cromatoplaca y proceder a marcar la manchas
cromóforas. En caso contrario, seguir con los métodos de revelado químicos o físicos.
Revelado
1. Ultravioleta (UV): Colocar la cromatoplaca en una cámara UV y observar si se presenta alguna
mancha cuando ésta se exponga ésta a la luz. Marcar tenuemente con un lápiz las manchas.
2. Ninhidrina 10%: la cromatoplaca es rociada con una solución de Ninhidrina (10% p/v en
metanol al 70% en agua) y colocarla en una estufa a 60ºC. Marcar las manchas que
aparezcan.
3. Yodo: Colocar una cantidad pequeña de Yodo solidó en la cámara y dejar que los vapores la
saturen. La cromatoplaca es colocada, vigilando la aparición de las manchas, evitando
sobreexponerla, ya que puede haber un oscurecimiento total.
4. Ácido Sulfúrico concentrado: Colocar la cromatoplaca en la campana de extracción de
vapores Rociar la cromatoplaca uniformemente y con extremo cuidado, a través de un
atomizador con H2SO4 conc, previamente se deberá cubrir con papel amarillo la zona donde se
efectué este proceso. Colocar la cromatoplaca en una estufa a 60ºC y esperar a que
aparezcan las manchas.
5.
Informe:
El registro de resultados se efectuará en un cuadro, presentando cuantas muestras se colocaron,
cuantos compuestos (manchas) se separaron por muestra y con que método de revelado fue
encontrado el compuesto, la distancia del origen y su Rf, indique la polaridad de cada uno de los
componentes separados respecto a los demás componentes encontrados.
Rf es el registro y se define como:
Distancia Recorrida por la muestra
Rf
Distancia que Recorre el Disolvente
Dependiendo del tipo de muestra separada en la práctica 1 y de los métodos de revelado, predecir
el tipo de compuesto separado por cromatografía en capa fina. Efectuar una justificación
bibliográfica de los resultados obtenidos en la práctica.
CUESTIONARIO
1. ¿De que depende el valor de Rf en un cromatograma?
2. ¿Cómo son la precisión y exactitud del método de cromatografía en capa fina?
3. ¿Qué criterios se deben tomar para la selección de un adsorbente colocado en la
cromatografía en capa fina?
4. ¿Qué factores fisicoquímicos influyen en la separación por cromatografía en capa fina?
5. ¿Qué significa que una sustancia tenga:
a) rf < 0.5 ?
b) rf = 0.5 ?
c) rf > 0.5 ?
6. ¿Por qué la cromatografía en capa fina es un criterio parcial y no total de identificación?
7. Una serie de colorantes es separada por cromatografía en capa fina. Calcular los valores de
Rf de cada colorante de acuerdo a la siguiente tabla.
Colorantes Distancia Recorrida (mm)
Eluyente 66.0
Rojo de metilo 56.0
Rodamina B 38.0
Rojo Congo 0.5
8. ¿Qué ventajas y desventajas tiene el método de cromatografía en capa fina?
BIBLIOGRAFIA
Harris, D. C. 2001. Análisis Químico Cuantitativo. Ed. Reverté S. A., España. Ed. Mac Graw Hill
Interamericana.
Luna-Rangel, R. 1981. Fundamentos de Química Analítica. Vol. I. Ed. Limusa México
Zweig, G. and Sherma, J. (eds). 1978. Handbook series in chromatography. CRC Handbook Series
in Chromatography. Section A: General data and principles. Vol II. CRC Press, USA.
Abbot D. y Andrews R. S. Introducción a la Cromatografía. 3a. Ed. Alhambra, Madrid, 1970.
