Cuantificación de la producción de biomasa y del consumo de sustrato,

recuento de levaduras viables

RESUMEN
Para la cuantificación de la producción de biomasa y del consumo de sustrato, se
realizaron curvas de calibración. Se tomó un cultivo y centrifugo durante 30 minutos
a 4000 rpm para poder separar del medio de cultivo la biomasa, posteriormente se
descartó el sobrenadante y se disolvió en la solución isotónica para obtener una
suspensión concentrada de biomasa. En seis tubos de ensayo se adiciono 6 ml de
la solución isotónica a cada uno y de 0.2 -1.0 mL de solución concentrada de
biomasa. Luego, se midió la absorbancia de cada dilución en el espectrofotómetro
a una longitud de onda de 540 nm, después se pasó el contenido de cada dilución
a 6 tubos previamente pesados y se llevaron al horno durante 48 horas, para
determinar finalmente el peso de biomasa presente en cada tubo, obteniendo
valores entre los 12.02 de gramos biomasa seca por Litro.
En la cuantificación del consumo de sustrato (azúcares reductores), se preparó una
dilución de 10-1 partiendo de la solución Stock (0.2 mg/L de Glucosa). Luego en seis
tubos de ensayo se adicionaron diferentes cantidades de la solución concentrada
de glucosa y de agua destilada, para posteriormente colocarlos en agua a ebullición
y adicionar 2 mL del reactivo DNS, se enfriaron los tubos en un baño de hielo
durante otros 5 minutos. Se realizó la lectura de la absorbancia por medio del
espectrofotómetro y poder relacionar la absorbancia con la concentración del
sustrato.
Se realizaron 6 cultivos en los cuales se sembró en 75 mL de caldo Saboraud 0.15
g de levadura liofilizada (concentración de biomasa 2g/L). Luego, se incubaron a
30°C y 100 rpm durante 4 a 1 días. Otra serie de cultivos con 72 h de incubación
fueron expuestos durante 24 h a diferentes concentraciones de etanol.
Posteriormente a cada grupo le fue asignada una muestra (3 días de incubación) y
se realizaron diluciones en serie de 10-1,10-2 y 10-3 con la solución salina al 0.85%.
En un tubo Eppendorff se tomo1.5 mL de las diluciones, se adiciono una gota de
azul de metileno y mezclo vigorosamente. Luego, se realizó el montaje en la cámara
de Neubauer y se hizo el recuento total de células con ayuda del microscopio. Se
obtuvieron valores de 0-81.3 % Viabilidad.
Palabras claves: biomasa, sustrato, curva de calibración, azucares reductores.

OBJETIVOS
 Realizar una curva de calibración de biomasa, que permita relacionar la
concentración celular (g/L) con la absorbancia de la muestra.
  Realizar una curva de calibración de azúcares, relacionando la concentración
de azúcares reductores con la absorbancia.
 Realizar conteo de células de levadura en Cámara de Neubauer.
 Determinar el porcentaje de viabilidad de células de levadura, en cultivos bajo
distintas condiciones.
 Determinar los tipos de estrés a los que se puede ver sometida la masa
celular de levaduras dentro de un proceso de un cultivo discontinuo.

INTRODUCCION
La determinación de la biomasa es una de las variables más importantes en un
bioproceso, porque su determinación nos lleva a la comprensión de la eficiencia del
mismo. Muy útil para establecer las tazas de producción, de consumo de nutrientes
y el cálculo de los balances demás de cualquier proceso biológico

MARCO TEORICO

Determinación de concentración celular por peso seco

La determinación de peso seco es una medida directa de crecimiento microbiano y
representa el 20% de los valores de peso húmedo, este porcentaje es aceptado
como estándar para la mayoría de bacterias (Niño, 2007).
La cantidad total de biomasa presente en la muestra se puede medir en términos
de peso seco por unidad de volumen, ya sea en sólidos en suspensión totales o en
sólidos en suspensión volátiles; las células se separan del líquido ya sea por
filtración o centrifugación (Arnaiz, 200).
Una de las desventajas es que para su determinación no solo incluye
microorganismos activos, sino que también microorganismos muertos, material
inerte, materia orgánica y polímeros extracelulares, otra Este método es simple
aunque consume mucho tiempo y casi no se pueden reproducir (Arnaiz, 2000). Otra
desventaja es que los componentes volátiles de la célula se pierden en el secado
o sufren alguna degradación (Niño, 2007).
Métodos microscópicos de recuento celular en cámaras
Existen diversos tipos de cámaras para el recuento de microorganismos tales como
la cámara de Neubauer. Thoma, Bürker, Türk, Fuchs-Rosenthal, Malassez, Petroff
Hauser, entre otros.
El recuento de microorganismos se realiza en la cuadrícula central de la cámara y
se multiplica por la profundidad, obteniéndose el número de microorganismos por
unidad de volumen, ecuación 1.
∑ 𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 ∗ 1⁄𝑓𝑑
𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠⁄
𝑚𝐿 = 1𝑚𝑚 ∗ 1𝑚𝑚 ∗ 0.1𝑚𝑚 ∗ 5⁄
25
 Ecuación 1
El recuento de microorganismos en cámaras no es un método muy exacto debido a
las irregularidades en la distribución de la muestra. Además, pueden confundirse
las células con otras formas orgánicas e inorgánicas existentes en el medio y no
permite distinguir células vivas de células muertas (Arnaiz, 200).
Las ventajas de este tipo de recuentos son el equipo sencillo y escaso que se
requiere, la rapidez para obtener los resultados y la facilidad para observar la
morfología de los microorganismos presentes. Sus desventajas se dan porque no
se diferencian los microorganismos vivos de los muertos, no es útil para recuento
de poblaciones con baja concentración de microorganismo (Arnaiz, 200).
Una cámara de recuento está constituida por una placa base de vidrio de tamaño
especial parecida a un portaobjetos, su parte central se encuentra separada de los
extremos por unas ranuras. En dichas ranuras de encuentran las cuadriculas de
recuento cuya forma y disposición dependen de la estructura de fabricación, siendo
lo normal que exista una ranura de 0.1 mm entre el campo central y un portaobjetos
situado encima (Arnaiz, 200).

Determinación de azúcares reductores

Una de las técnicas más usadas para la identificación de azucares reductores es la

denominada DNS; técnica colorimétrica que emplea ácido dinitrasalicílico para la
hidrolisis de polisacáridos que se encuentran en la muestra, esto se evidencia por
medio de la lectura de absorbancias en el espectrofotómetro lo que implica la
aplicación de la ley de Beer Lambert. Con este método se puede calcular los
azucares reductores generados en la fermentación o para calcular los productos de
una reacción enzimática. La curva de calibración es la representación gráfica de la
absorbancia (eje y) vs la concentración (eje x). Se ensayan varias soluciones de
concentraciones conocidas y se calcula la absorbancias, construyendo la curva de
calibración que es una recta. La concentración de una solución se averigua por
interpolación de la absorbancia de la solución en la curva de calibración o a través
de la recta y=mx+b; absorbancia (y)= constante (m) x concentración + absorbancia
del blanco (Rodríguez 2014).

El método DNS solo se utiliza para las azucares reductores. La sacarosa es un

disacárido no reductor, pero tras su hidrólisis en medio acido liberan glucosa y
fructosa que si son reductores y reaccionan con el DNS produciendo un producto
coloreado, la intensidad del color, que se puede medir por métodos
espectrofotométricos es proporcional a la concentración de la sacarosa (Rodríguez
2014).

ANALISIS Y RESULTADOS

Curva de calibración para determinación de biomasa por peso seco

En la realización de la curva de calibración para la determinación de biomasa en
peso seco, se preparan las muestras de biomasa en tubos de ensayo que son
pesados y posteriormente secados para obtener la cantidad de biomasa.

Por otra parte se tomaron mediciones de absorbancia a 540 nm de las soluciones

preparadas como se indicó anteriormente de lo cual se obtuvieron los siguientes
datos en relación con la variación de biomasa:

Tabla 1. Absorbancia de las disoluciones.

Muestra Absorbancia
1 0.23329241
2 0.40218315
3 0.66851492
4 0.7488284
5 0.88267428

Con los pesos obtenidos se pueden determinar las concentraciones de las

soluciones y se calcula el promedio de las concentraciones de la biomasa en peso
seco para luego calcular las concentraciones por litro.

Tabla 2. Concentración de biomasa seca contra la absorbancia de cada muestra

[ ] g/L Absorbancia
0 0
0.24419444 0.23329241
0.36629167 0.40218315
0.48838889 0.66851492
0.61048611 0.7488284
0.73258333 0.88267428
 Concentracion de biomasa vs Absorbancia
1
0.9 y = 0.8895x + 0.0445
0.8 R² = 0.9772

0.7
Absorbancia 0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Concentracion (g/L)

Grafico 1. Concentración de biomasa en peso seco vs absorbancia

Concentracion de biomasa vs Absorbancia

1
y = 1.2645x - 0.0254
0.8 R² = 0.9813

0.6
Absorbancia

0.4

0.2

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
-0.2
Concentracion g/ L

Grafico 2. Concentración de biomasa en peso seco vs absorbancia

La graficas presentan una regresión lineal con un r2 0.9772 y r2 0.9813 se puede

decir que la curva es admisible pese a los errores presentados en la preparación de
las soluciones, también es necesario reportar que los tubos de ensayo empleados
adquirieron humedad lo que afecto la considerablemente la medición. Con las
ecuaciones presentadas es posible calcular la absorbancia, dentro lo de los límites
de las concentraciones usadas con las que se hizo la regresión.
Rutas metabólicas por las cuales se logra la fermentación alcohólica.
La fermentación ocurre mediante reacciones que implican la glucolisis, que es la
ruta metabólica en la que la se transforma la glucosa en dos moléculas de Piruvato,
que sufren procesos de descarboxilación del cual se produce CO2 y reducción
generado por la enzima alcohol deshidrogenasa generando una molécula de etanol
por cada molécula de piruvato. La reacción se presenta a continuación:
𝐶6 𝐻12 𝑂6 → 2𝐶𝑂2 + 2𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻 + 𝐸𝑛𝑒𝑟𝑔𝑖𝑎

Curva de calibración para consumo de sustrato (azucares reductores)

Al realizar las diluciones para cada tubo y al agregar el reactivo DNS se evidencio
que para todos los tubos se presentó una coloración amarilla, lo que no debía ser
así ya que en cada tubo debería presentar una coloración más intensa a medida
que aumentaba la concentración, ya que la coloración se presenta por la reducción
del reactivo dando una coloración la cual es proporcional a la concentración de
azucares reductores (Buitrago, 2007 ); por tal motivo no se pudo realizar la lectura
de absorbancias para la muestra.

Para la construcción de la curva de calibración es necesario conocer las

concentraciones con la que realmente se está trabajando se realiza una relación
(ecuación 2), con lo cual el volumen uno es igual a la cantidad de solución stock de
glucosa adicionada en cada soluciones correspondientes, la concentración uno
está dada a la cantidad de muestra preparada lo cual fue 2 g/L de glucosa y el
volumen dos es el total de muestra preparada en cada tubo de ensayo en cual es
de 11mL.
De la ecuación 2 se despeja para tener la concentración dos (ecuación 3)

C1*V1=C2*V2
Ecuación 2

𝐶1 ∗ 𝑉1
𝐶2 =
𝑉2
Ecuación 3
A partir de esta relación los valores a graficar se exponen en la tabla 1:

Tabla 3. Concentración de glucosa con su respectiva absorbancia

 Absorbancia 540 Concentración de Glucosa g/L
nm (aprox)
0,095380415 0,03636
0,32168097 0,05455
0,560797663 0,07273
0,84819783 0,09091
1,044029358 0,10909
1,19800367 0,12727
1,392063398 0,14545
1,639619804 0,16364
1,845972102 0,18182

Para construir la curva de calibración que relaciona las concentraciones de las

diferentes disoluciones y las absorbancia medida datos (tabla1) se obtiene el
siguiente gráfico.

Curva de calibración método DNS

2
1.8
1.6
y = 11.888x - 0.3029
1.4
Absrobancia

R² = 0.9962
1.2
1
0.8 Series1
0.6 Linear (Series1)
0.4
0.2
0
0.00000 0.05000 0.10000 0.15000 0.20000
concentración (g/L)

Gráfica 3. Curva de calibración para el consumo de sustrato

La ecuación obtenida es: A = 11,888*C - 0,3029, donde A es la absorbancia de la

muestra y C es la concentración de glucosa presente en g/L, como se muestra en
la gráfica el coeficiente de correlación es de 0.9962 lo cual evidencia la presencia
de azucares reductores totales, mostrando una relación directa entre la absorbancia
y la presencia de los mismos por lo tanto estos datos son aceptables.

Al tener gráfica, se esperaba que los datos que nos hubieran dado en el ensayo se
comportaran de la misma manera, dichos datos no se obtuvieron debido a que la
coloración siempre fue la misma para todos los tubos esto pudo ocasionarse por
diferentes factores ya sea mal preparación de las diluciones, contaminación del
DNS.

Recuento de levaduras

El objetivo de hacer un recuento de células viables, en este caso de levaduras,

practicando diluciones de 10-1 y 10-2 de la muestra, nos permite conocer el número
de colonias que crecen en un medio y determinar las células/mL de muestra inicial.
Para el recuento de levaduras totales: viables + muertas (teñidas de azul), se utilizó
la cámara de Neubauer que tiene una capacidad de 0.3 mm 3 y permite realizar el
conteo con ayuda del microscopio (ver Imagen 1)

Imagen 1. Células viables y muertas en Cámara de Neubauer

Tabla 4. Datos del conteo de células de levadura en Cámara de Neubauer para la
muestra con 3 días de incubación.
Cuadrantes
Células Total
1 2 3 4 5
Viables 31 34 36 27 20 148
Muertas 20 22 35 17 17 111
259

∑ 𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 ∗ 1⁄𝑓𝑑
𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠⁄ (Ec. 1)
𝑚𝐿 = 1𝑚𝑚 ∗ 1𝑚𝑚 ∗ 0.1𝑚𝑚 ∗ 5⁄
25
259 ∗ 1⁄ 1
𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠⁄ 100 1 𝑚𝑚3 9 𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
𝑚𝐿 = 1𝑚𝑚 ∗ 1𝑚𝑚 ∗ 0.1𝑚𝑚 ∗ 5⁄ ∗ 0.001 𝑚𝐿 = 1.295𝑥10 ⁄𝑚𝐿
25
∑ 𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 − ∑ 𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠𝑀𝑢𝑒𝑟𝑡𝑎𝑠
% 𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 = 𝑥100
∑ 𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠
 (Ec. 2)

259 − 111
% 𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 = 𝑥100 = 57.4 %
259

Con el conteo de células en la cámara de Neubauer (ver Tabla 1), se determinó la

cantidad de células por mL de muestra inicial (Ec.1) y el porcentaje de viabilidad
(Ec. 2).
Siguiendo el mismo procedimiento para los cultivos incubados durante los 4,2 y 1
días a 30°C para la dilución de 10-1 se obtuvo los siguientes resultados:
Tabla 5. Datos de Cel/mL y % viabilidad para la serie de cultivos incubados a 30°C.
T (h) Cel/mL % Viabilidad fd
96 9.35E+07 81.3
1.00E+07 55.0
72
1.26E+09 57.4 1/10
48 7.70E+07 52.6
24 9.60E+07 37.8

Para la segunda serie de cultivos con 17 horas de incubación expuestas durante 24

horas a concentraciones de etanol se obtuvieron los siguientes resultados:

Tabla 6. Datos de Cel/mL y % viabilidad para la serie de cultivos expuesta a

diferentes concentraciones de etanol

% (v/v) %
Etanol Cel/mL Viabilidad
1.5 2.37E+08 68.1
3.5 1.84E+08 50.7
5.5 9.65E+05 0.0

La fermentación alcohólica es un proceso anaerobio en el que las levaduras,

descarboxilan el piruvato obtenido de la ruta Embden-Meyerhof-Parnas (Glicólisis)
dando acetaldehído, y éste se reduce a etanol por la acción del NADH 2. La
conversión se representa mediante la siguiente ecuación conocida como la
ecuación de Gay-Lussac:
𝐶6 𝐻12 𝑂6 → 2𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻 + 2𝐶𝑂2
La levadura Saccharomyces cerevisiae, es la especie de levadura usada con mayor
frecuencia en la fermentación. (Vázquez & Dacosta, 2007)
Las fases de crecimiento de la levadura son cuatro. La primera, es la fase latente,
etapa en la cual la levadura se adapta al medio donde se está desarrollando, en ella
se presenta un mínimo crecimiento en la población de la levadura. En la segunda
fase, etapa de crecimiento, las células presentan una alta velocidad de reproducción
por lo que se incrementa notablemente la población. En la tercera, fase estacionaria,
igual que en la primera no se presenta aumento en la población, solos alcanza un
estado de supervivencia. En la cuarta y última fase se presenta la muerte de la
levadura. (Gallego, 2007)
Las levaduras presentan diferentes tipos de estrés durante el proceso de
fermentación uno de ellos, es el estrés por calor, un incremento de 10 a 15°C por
arriba de la temperatura óptima de crecimiento de la levadura induce la síntesis de
un grupo de proteínas llamadas HSP (de las siglas en inglés por Heat Shock
Proteins). La mayoría de las proteínas de este grupo son proteasas que están
involucradas en impedir la desnaturalización o inducir la naturalización de proteínas.
Otro es el estrés hiperosmótico, que es la disminución en el potencial hídrico del
ambiente en el que se esté desarrollando. Ante esto, la respuesta es inmediata,
mediante una salida del agua intracelular y un proceso adaptativo más largo para
tratar de llevar a cabo un ajuste osmótico. Una vez que el organismo se adaptó, se
retoma el crecimiento. La levadura también puede presentar estrés oxidativo, que
ocurre cuando hay un desequilibrio en las células debido a un aumento en los
radicales libres y/o una disminución en los antioxidantes; y estrés por sales,
generando dos tipos de estrés; por un lado, condición de estrés osmótico que
depende de la concentración de sal usada y, por otro lado, hay una toxicidad
provocada por los diferentes iones. (Folch, Garay, & Lledías, 2004)
Para la primera serie de cultivos incubados durante 4,3,2 y 1 días, se puede
observar en la Tabla 2 que el % de viabilidad aumenta a medida que también
aumenta el tiempo de incubación debido a que el número de células presentes en
el medio aumentan además de otros metabolitos, lo que hace que las células de
levadura presenten varios tipos de estrés como los mencionados anteriormente, por
lo tanto, es de esperarse una disminución de los nutrientes y por lo tanto es posible
que se presenten más muertes y deficiencias en su crecimiento. (Garzon &
Hernandez, 2009)
Según los resultados obtenidos para la serie de cultivos expuestos a diferentes
concentraciones de etanol, a medida que aumenta la concentración de etanol
disminuye la cantidad de células/mL y el % de viabilidad, esto debido a que, las
concentraciones de etanol en la levadura afectan negativamente la pared celular y
algunas de las enzimas citoplasmáticas de la levadura como la hexoquinona, puesto
que, a concentraciones críticas de etanol, dan lugar a la muerte de levaduras y, en
consecuencia, a una disminución de la viabilidad celular. (Tomasso, 2004)
CONCLUSIONES
 Para lograr una eficiencia en el método de DNS se debe tener cuidado a la
hora de preparar las diluciones ya que este método es muy sensible a las
variaciones de concentración, generando cambios en la absorbancia.
 El recuento de células es importante para determinar la viabilidad que tienen
las células de levadura y para el control de la fermentación alcohólica.
 La concentración de etanol en células de levadura debe ser menor al 5.5 %
para que sean viables.
  El tiempo de fermentación total para las células de levadura es de 96 h (4
días), ya que tienen un % de viabilidad del 81.3%, cuanto mayor es el número
de células vivas, mejor será el rendimiento del proceso.

REFERENCIAS
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