Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
NOMBRE DE LA MATERIA:
Laboratorio de métodos de análisis
NOMBRE DEL ALUMNO:
Avila Bello Pioquinto
NOMBRE DE LA PRÁCTICA:
DETERMINACION DEL PESO MOLECULAR DE UNA
PROTEINA USANDO CROMATOGRAFIA POR
EXCLUSION MOLECULAR
GRUPO: 4IV1 SECCION: II
NOMBRE DEL PROFESOR: Víctor Manuel Macías
Martínez
1.-OBJETIVOS:
Entenderemos el fundamento de la cromatografía por
exclusión molecular.
2.-FUNDAMENTO:
Es un tamiz molecular, cuyo principio de separación se basa en la
diferencia de tamaño molecular de los solutos y como factor
secundario la forma de estos.
3.-DATOS EXPERIMENTALES E INFORME:
DETERMINACION DEL VOLUMEN VACIO(V0) DE LA COLUMNA:
Tabla 1. Determinación de volumen vacío (V0)
No. de fracción Volumen de A615
elución(mL)
1 3 0.005
2 6 0.003
3 9 0.011
4 12 0.659
5 15 0.839
6 18 0.120
7 21 0.018
8 24 0
9 27 0
10 30 0
Perfil de elucion de la dextrana azul 2000
1
0.9 0.839
0.8
0.7
Absorbancia a 615nm
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 5 10 15 20 25 30 35
-0.1
Volumen de elucion (mL)
Observando la gráfica anterior podemos concluir que el Volumen
vacío es el volumen a la cual tiene la mayor absorbancia, por lo
tanto, el V0 fue en el tubo 5 con un volumen de elución de 15 mL.
DETERMINACION DEL VOLUMEN DE ELUCION (Ve), DE LAS
PROTEINAS PATRON Y PROBLEMA:
Tabla 2. Determinación del volumen de elución de las proteínas.
Volumen de Absorbancia
elución Hemoglobina Lisozima Problema(pepsina)
3 0.034 0.044 0.032
6 0 0.029 0.025
9 0 0.041 0.025
12 0 0.027 0.034
15 2.879 0.021 0.278
18 3.023 0.025 0.846
21 1.872 0.232 0.582
24 1.139 0.738 0.397
27 0.597 1.265 0.277
30 0.287 1.440 0.229
33 0.113 1.227 0.187
36 0.045 0.840 0.186
39 0.514 0.226
42 0.282 0.210
45 0.203 0.160
48 0.01 0.117
51 0.053 0.064
54 0.036 0.034
57 0.048 0.036
60 0.074 0.033
63 0.097 0.030
PERFIL DE ELUCION DE PROTEINAS
3.5
2.5
2
ABSORBANCIA
HEMOGLOBINA
1.5
LISOZIMA
PROBLEMA(PEPSINA)
1
0.5
0
0 10 20 30 40 50 60 70
-0.5
VOLUMEN DE ELUCION
Mediante la observación podemos concluir que hay una relación
inversamente proporcional entre el peso molecular y el volumen de
elución. A mayor peso molecular, menor volumen de elución y
viceversa; esto debido a que las moléculas más grandes no entran
por el poro, lo rodean ahorrando así tiempo y volumen de elución.
En cambio al tener moléculas de menor peso molecular fácilmente
entran al poro de la F.E y tardan mucho más en salir, teniendo
como resultado un volumen de elución mucho mayor .
DETERMINACION DE LA RELACION Ve/V0
Tabla 3. Relación de Ve/V0 y el logaritmo del peso molecular de las
proteínas patrón y problema.
Proteínas V0(mL) Ve(mL) Ve/V0 PM Log PM
Hemoglobina 18 18 1 64000 4.8061
Lisozima 18 30 1.6667 14400 4.1583
Problema(pepsina) 15 18 1.2 ¿? ¿?
Curva tipo de proteinas
1.8
Volumen de elucion relativo (Ve/V0)
1.6
1.4
1.2
0.8
y = -1.0292x + 5.9463
0.6 R² = 1
0.4
0.2
0
4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9
Log PM
a) Mediante la ecuación de la recta despejamos X
𝑌 − 5.9463
𝑋=
−1.0292
Sustituimos nuestro valor de volumen de elución relativo de la
proteína problema para conocer el Logaritmo del peso molecular
(LogPM).
1.2−5.9463
𝑋= =4.6116
−1.0292
Teniendo el Log(PM) obtenemos el inverso y así podemos saber el
Peso molecular de la proteína problema:
Log(PM)=4.6116
Aplicando el inverso:
10^4.6116= 40892.16
Tenemos que el peso molecular de la sustancia problema es de
40892.16 g/mol.
Según la bibliografía podemos comparar el PM encontrado para
saber la proteína, en este caso encontramos que es la pepsina, que
tiene un PM similar al encontrado.
b) Método osmótico, método de la dispersión de luz, método por
ultra centrifugación, método por análisis de grupos terminales,
cromatografía por exclusión molecular.
c)
Ventajas: No hay perdida de muestra porque los solutos no
interaccionan con la F.E, tiempos de separación cortos bien
definidos.
Desventajas: La manera en que se empaca la columna puede
afectar, los geles utilizados como F.E son caros, se requiere que los
solutos tengan una diferencia del 10% entre sus pesos moleculares.
d) Epiclorhidrina:
Es un compuesto quimico usado como insectisida, fumigante y
disolvente de pinturas, barnices, uñas y lacas. Tambien utilizado
como polímero de recubrimiento de las redes de abastecimiento de
agua y como materia prima en la producción de resinas de alta
resistencia a la humedad en la industria papelera. Se prepara
sintéticamente por transformación del propileno con gas de cloro a
600°C y por hidrólisis con hidróxido de calcio.
