ATLAS de HISTOLOGÍA VEGETAL y ANIMAL
Técnicas histológicas
INCLUSIÓN
Manuel Megías, Pilar Molist, Manuel A. Pombal
Departamento de Biología Funcional y Ciencias de la Salud.
Facultad de Biología. Universidad de Vigo.
(Versión: Diciembre 2015)
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ÍNDICE
Introducción ................................. 4
El proceso hisológico .................... 5
Inclusión ......................................... 7
Inclusión en parafina ...................... 9
Inclusión en resina ......................... 11
Técnicas histológicas. Introducción. 4
Introducción
En estas páginas dedicadas a las técnicas características morfológicas de las células sólo se
histológicas vamos a describir los procesos pueden observar con estos aparatos.
experimentales necesarios para obtener secciones Existen procedimientos rápidos y simples para
teñidas y listas para observar al microscopio la observación de tejidos y células vivas que
partiendo de tejidos vivos extraídos de un animal reciben el nombre de vitales. Por ejemplo, la
o de una planta. Por tanto, dedicaremos espacios observación del flujo sanguíneo en capilares del
a la obtención, fijación, inclusión, corte y tinción sistema circulatorio. Otra forma de observar
de los tejidos. Todos estos apartados seguirán el células o tejidos vivos es mediante las técnicas
mismo esquema que los capítulos dedicados a los histológicas supravitales, en los que las células y
tejidos o a la célula, partir de un esquema básico los tejidos se mantienen o se hacen crecer fuera
y ampliar la información sucesivamente en del organismo, como es el caso de los cultivos de
páginas adicionales. No dedicaremos demasiado células y de tejidos.
espacio a los instrumentos, desde el punto de
vista operativo, pero sí a la conveniencia de su Las técnicas histológicas postvitales son
uso y a sus capacidades. aquellas en las que las células mueren durante el
La mayoría de las técnicas histológicas van proceso, pero las características morfológicas y
encaminadas a preparar el tejido para su moleculares que poseían en estado vivo se
observación con el microscopio, bien sea éste conservan mejor o peor dependiendo del tipo de
óptico o electrónico. Ello es debido a que la técnica. Estas páginas estarán dedicadas a este
estructura de los tejidos está basada en la tipo de técnicas, puesto que son las más
organización de los tipos de células que los comúnmente usadas en los laboratorios de
componen y, salvo contadas ocasiones, las histología.
Atlas de histología vegetal y animal. Universidad de Vigo.
Técnicas histológicas. Introducción. 5
El proceso histológico
Denominamos proceso histológico a una serie El proceso histológico comienza con la
de métodos y técnicas utilizados para poder obtención del tejido objeto de estudio. En el caso
estudiar las características morfológicas y de los tejidos vegetales directamente se toman
moleculares de los tejidos. Hay diversos caminos muestras de los distintos órganos que componen
para estudiar los tejidos, es decir, series de el cuerpo de la planta, mientras que para los
técnicas que se utilizarán dependiendo de qué tejidos animales podemos optar por dos opciones:
característica deseemos observar. En el siguiente coger una porción del tejido u órgano y
esquema se muestran los métodos y técnicas procesarla o procesar primero el animal completo
comúnmente empleados para el procesamiento y luego extraer la muestra que nos interese. En
de los tejidos para su observación con los cualquier caso las muestras son habitualmente
microscopios óptico o electrónico. Sin embargo, fijadas con unos soluciones líquidas denominadas
hay que tener en cuenta que existen muchas fijadores, las cuales se usan para mantener las
variantes a estos "caminos" y su elección estructuras celulares y moleculares inalterables
dependerá del resultado final que queramos durante el procesamiento posterior y con una
obtener. organización lo más parecida posible a como se
Esquema del proceso histológico.
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Técnicas histológicas. Introducción. 6
encontraban en la muestra viva. También para poder observarlas y estudiarlas, aunque
podemos fijar las moléculas de los tejidos por ciertos tipos de microscopía, por ejemplo con
congelación rápida. Fijar un tejido es como hacer contraste de fase, permiten observar secciones de
una fotografía de dicho tejido, su estructura se tejidos sin procesar. Normalmente las secciones
mantendrá hasta su observación. La fijación por se tiñen con colorantes que son hidrosolubles, por
congelación se emplea cuando la fijación química lo que hay que eliminar el medio de inclusión
o los procesos histológicos posteriores alteran las para que los colorantes pueden unirse al tejido.
características de la muestra que queremos Las secciones ultrafinas (observadas con el
estudiar, por ejemplo una molécula sensible a microscopio electrónico) o semifinas (observadas
dichos tratamientos. con el microscopio óptico) se pueden contrastar
Normalmente, tras la fijación se procede a con metales pesados o con colorantes,
incluir el tejido para posteriormente obtener respectivamente, sin necesidad de eliminar el
secciones. Cuanto más delgada queramos que sea medio de inclusión.
nuestra sección más tenemos que endurecer Los tejidos procesados se observan con los
nuestra muestra. Esto se consigue embebiendo el microscopios. Existen dos tipos básicos de
tejido con sustancias líquidas que posteriormente microscopios: óptico y electrónico. Los primeros
polimerizarán (resinas) o se volverán consistentes ofrecen una gran versatilidad en cuanto a modos
(ceras). También se puede conseguir el mismo de observar los tejidos: campo claro,
efecto mediante congelación rápida. Cortes más fluorescencia, contraste de fase, polarización o
gruesos de 40 >m se pueden cortar sin necesidad contraste de interferencia diferencial, mientras
de inclusión usando el vibratomo. Los medios de que los segundos permiten un gran poder de
inclusión no son normalmente hidrosolubles por resolución, pudiéndose observar características
lo que tendremos que sustituir el agua de los ultraestructurales.
tejidos por solventes orgánicos liposolubles y
posteriormente sustituirlos por el medio de Como dijimos al comienzo existen múltiples
inclusión. variaciones sobre este esquema general de
procesamiento histológico. Por ejemplo, se
Tras la inclusión o la congelación se procede a pueden observar tejidos con el microscopio
cortar los tejidos, es decir, obtener secciones. electrónico de barrido sin necesidad de incluir ni
Existen diferentes aparatos de corte que permiten cortar, pero sólo observaremos superficies. En las
conseguir secciones ultrafinas (del orden de siguientes páginas veremos con cierto detalle
nanometros), semifinas (de 0.5 a 2 >m), finas algunas de las técnicas más empleadas para la
(entre unas 3 y 10 >m) y gruesos (mayores a 10 observación de los tejidos.
>m). Habitualmente las secciones se procesan
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Técnicas histológicas. Inlusión. 7
Inclusión
Una vez fijado el tejido tenemos que dos formas: por congelación o por inclusión.
procesarlo para su observación con el La congelación de los tejidos previamente
microscopio. Ello implica hacer secciones para fijados permite la obtención de secciones que
teñirlas primero y posteriormente observarlas. pueden ir desde unas 50 >m hasta nm de grosor,
Como regla general se procede al endurecimiento para lo que se utilizan diferentes aparatos:
de la muestra para poder obtener dichas microtomo de congelación☆ para secciones de
secciones ya que lo normal es que cuanto más decenas de >m, criostato para secciones de entre
delgada queramos una sección más consistente 5 y 20 >m y ultracriotomo para secciones
debe ser la muestra de la que se obtiene. Los ultrafinas del orden de nm. Para evitar los daños
tejidos se endurecen a consecuencia de la que se producen durante los procesos de
fijación, pero esta dureza no es muy alta e impide congelación, como la formación de cristales de
la obtención de cortes generalmente más hielo que nos agujerean los tejidos, se pueden
delgados que 20 o 30 >m. Sólo en el caso de que usar: a) Anticongelantes que impidan la
queramos trabajar con secciones relativamente formación de cristales. El crioprotector más
gruesas (entre 30 y 200 >m) se puede aprovechar usado es la sacarosa al 30 %, aunque también se
el endurecimiento provocado por el fijador y usa el dimetil sulfóxido, el glicerol, etilén glicol y
obtener dichas secciones con el vibratomo☆. Este otros. La elección de uno u otro depende del tipo
tipo de aparato se utiliza en ciertas técnicas de muestra y de la técnica que se vaya a usar. b)
donde es necesaria una buena preservación Una congelación lo más rápida posible, por
molecular. Sin embargo, en muchos casos ejemplo, con nitrógeno líquido. Cuanto más
necesitamos endurecer más el tejido para obtener rápida es la congelación menores son las
secciones más finas, lo cual se puede hacer de dimensiones de los cristales de agua formados.
Se pueden obtener secciones de grosor variable utilizando diferentes métodos.
Secciones más finas se obtienen endureciendo más el tejido. Esto se puede
conseguir mediante la congelación o embebiendo el tejido en sustancias que
solidifican como la parafina o ciertas resinas. Téngase en cuenta que las
dimensiones de los cortes y objetos que se muestran en este dibujo no están a
escala. Una rejilla es mucho más pequeña que un portaobjetos. Las dimensiones
en µm y nm se refieren al espesor de las secciones.
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Técnicas histológicas. Inlusión. 8
La inclusión es el método más común de más frecuentemente usados son la parafina o la
endurecer el tejido y consiste en infiltrar la celoidina, mientras que si vamos a realizar
muestra con sustancias líquidas que tras un observaciones con el microscopio electrónico☆ la
proceso de polimerización o enfriamiento se inclusión se realiza con resinas☆, principalmente
solidifican, sin afectar a las características del de tipo acríclicas o epoxy. La mayoría de estas
tejido. Con ello se consigue obtener cortes del sustancias no son hidrosolubles, es decir, no son
orden de >m a nm, según el medio de inclusión, miscibles con el agua, luego si queremos que la
sin que el tejido se rompa o se deteriore. sustancia en la que vamos a incluir ocupe todo el
Además, son un buen método para preservar las tejido tenemos que eliminar el agua y sustituirla
muestras durante largos periodos de tiempo. por un líquido miscible con dicha sustancia. Si
Existen diferentes sustancias o medios de una muestra no está completamente embebida en
inclusión dependiendo del grosor del corte y de la el medio de inclusión se deteriorará y la
técnica que necesitemos realizar. Cuando se obtención de secciones homogéneas será
quieren hacer secciones para su observación con imposible.
el microscopio óptico los medios de inclusión
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Técnicas histológicas. Inlusión en parafina. 9
Inclusión en parafina
Para la inclusión de muestras que han de tanto con el alcohol de 100° como con la
observarse con el microscopio óptico se utiliza parafina, denominado sustancia intermediaria,
sobre todo la parafina, y en menor medida la como es el benceno, xileno, tolueno o el óxido de
celoidina, como medio de inclusión. Vamos a propileno, entre otros. Estas sustancias son
describir los pasos para la inclusión en parafina normalmente aclarantes por lo que comprobando
de muestras de tejido previamente fijadas. la translucidez de la pieza podemos cerciorarnos
de la penetración de la sustancia intermediaria en
La parafina es una sustancia de aspecto ceroso el tejido. El tiempo de incubación de la pieza en
que está formada por mezclas de hidrocarburos algunos de estos líquidos intermediarios como el
saturados. A temperatura ambiente es sólida y su tolueno o xileno no debe ser excesivo puesto que
punto de fusión puede variar entre 40 °C y 70 °C estas sustancias endurecen la pieza y crean
según la composición de la mezcla de problemas al hacer las secciones.
hidrocarburos. Así, parafinas más duras a
temperatura ambiente tienen un punto de fusión Por último se pasa el tejido a parafina
mayor, mientras que las más blandas uno menor. previamente licuada en una estufa regulada a la
Es recomendable una dureza mayor para incluir temperatura apropiada para dicho tipo de
muestras más duras. Las parafinas más usadas parafina. Se dan tres pasos por parafina líquida
tienen un punto de fusión en torno a los 60 °C. para favorecer una completa sustitución del
Podemos también modificar las características de líquido intermediario por la parafina. El tiempo
las parafinas añadiendo sustancias para variar su que dura dichos pasos depende de lo volátil que
dureza, viscosidad, fragilidad, etcétera. sea el líquido intermediario y lo grande que sea
nuestra pieza. Será mayor cuanto menos volátil es
La parafina no es miscible con agua, mientras el líquido intermediario o mayor sea la muestra
que todos los tejidos están formados de tejido. Hay que tener en cuenta que un tiempo
principalmente por agua. Además, la mayoría de excesivo en parafina puede endurecer el tejido.
los fijadores son soluciones acuosas. Esto implica Tras el embebimiento completo de la muestra se
que para que la parafina líquida pueda penetrar vierte parafina líquida en un molde, se intruduce
completamente en el tejido ha de sustituirse el la muestra y se coloca según la orientación
agua por un solvente orgánico. Esto se consigue deseada de corte y se deja solidificar a
mediante la deshidratación del tejido en temperatura ambiente.
alcoholes, normalmente etanol, de gradación
creciente hasta alcohol de 100°. Posteriormente Un protocolo común de inclusión en parafina
se transfiere el tejido a un líquido que es miscible es el siguiente:
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Técnicas histológicas. Inlusión en parafina. 10
Esquema de la inclusión en parafina de una muestra de tejido previamente fijada. Los
tiempos de incubación en cada sustancia pueden variar en función del tamaño de la
muestra, tipo de tejido o, por ejemplo, el líquido intermediario. Sin embargo, los pasos
son comunes a cualquier inclusión en parafina.
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Técnicas histológicas. Inlusión en resina. 11
Inclusión en resina
Para la observación de la ultraestructura ultraestructura celular y que no perderemos los
celular es necesario hacer secciones de tejido lípidos que forman las membranas celulares
muy delgadas, del orden de nanometros, durante el proceso de inclusión, gracias al
denominadas ultrafinas, y usar un microscopio tetróxido de osmio.
electrónico de transmisión. La obtención de b) Partimos de tamaños de muestras mucho
secciones ultrafinas implica que tenemos que más pequeñas, de unos pocos milímetros, puesto
endurecer enormemente el tejido. Esto se puede que no nos interesa ver la organización general
conseguir mediante congelación, obteniendo del tejido sino detalles del mismo. Si queremos
entonces la secciones con un ultracriotomo. Sin observar zonas diferentes de un órgano es
embargo, lo más frecuente es incluir el tejido en conveniente hacer bloques de muestra pequeños e
un material de alta dureza como son las resinas independientes de cada una de ellas.
de tipo epoxy, y en menor medida las resinas
acrílicas como el metacrilato. Ambas se infiltran c) La resinas más comúnmente usadas para la
en el tejido en forma líquida y posteriormente inclusión no son hidrosolubles, por lo que
polimerizan sin afectar a la ultraestructura tenemos que sustituir el agua del tejido por un
celular. solvente orgánico que sea miscible con la resina.
El procedimiento estándar de inclusión en Para ello se deshidrata el tejido mediante
resinas tipo epoxy es similar al descrito para la incubaciones sucesivas en gradaciones crecientes
parafina con algunas modificaciones. Así, los de etanol o acetona. Como líquido intermediario
pasos que se siguen son fijación de las muestras, entre la acetona pura o el etanol de 100° y las
por inmersión o perfusión, deshidratación, resinas se suele utilizar el óxido de propileno.
líquido intermediario, infiltración y d) El endurecimiento del medio de inclusión, la
polimerización en el medio de inclusión. Algunos resina, no es por enfriamiento sino por
medios de inclusión de tipo acrílico, por ejemplo polimerización, normalmente a 60 °C.
la resina LR white, son parcialmente miscibles e) Al medio de inclusión, la resina, se le añaden
con el agua por lo que no es necesario deshidratar aceleradores y plastificantes que regulan las
completamente la muestra o el líquido características de la polimerización y la dureza de
intermediario, y además polimerizan con luz la resina polimerizada. Las resinas tipo epoxy son
ultravioleta a bajas temperaturas. Estos medios las más usadas puesto que aportan una mayor
son buenos para estudios citoquímicos. homogeneidad en las polimerización y más
En las inclusiones en resinas tipo epoxy, facilidad a la hora de obtener secciones regulares.
normalmente para muestras que se observarán en Por el contrario las resinas acrílicas presentan
el microscopio electrónico, se suelen seguir las algunos inconvenientes y hay que ser muy
siguientes recomendaciones: cuidadosos a la hora de elegir las condiciones de
a) Las soluciones fijadoras suelen contener polimerización, obtención y tratamiento de los
glutaraldehído y es necesaria una postfijación cortes ultrafinos.
posterior en tetróxido de osmio. Con ello nos A continuación se muestra un proceso de
aseguramos una fuerte fijación para preservar la inclusión habitual en resinas de tipo epoxy.
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Técnicas histológicas. Inlusión en resina. 12
Esquema de la inclusión en resina de tipo epoxy de una muestra de tejido
previamente fijada. Los tiempos de incubación en cada sustancia pueden variar en
función del tamaño de la muestra o tipo de tejido.
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