COCOS GRAM POSITIVOS: Aspectos
prácticos
TAXONOMIA - Breve reseña Verónica Seija
Antes de entrar de lleno en la identificación del género
Staphylococcus realizaremos una breve introducción a El género Staphylococcus es no exigente en cuanto a
la taxonomía de los cocos Gram positivos. sus requerimientos nutricionales, por lo tanto crece en
Estos se pueden clasificar, en primera instancia, en medios de cultivo pobres.
cuanto a sus requerimientos atmosféricos. Así tenemos ENSAYOS BIOQUIMICOS
los cocos Gram positivos anaerobios estrictos Las pruebas o ensayos bioquímicos son aquellas que
constituidos por los géneros Peptococcus y ponen en evidencia la existencia de una enzima o pasos
Peptoestreptococcus, los cuales serán estudiados en el metabólicos determinados.
capítulo referido a bacterias anaerobias. Ahora enumeraremos las pruebas bioquímicas
Por otro lado tenemos los cocos Gram positivos aerobios necesarias para la identificación de los estafilococos.
y anaerobios facultativos que están constituidos por la 1 . PRUEBA DE LA CATALASA
familia Micrococacceae (géneros Staphylococcus, Objetivo: Separar la Flia. Micrococacceae (catalasa +)
Micrococcus, Planococcus y Stomacoccus) y los de los Géneros Streptococcus y Enterococcus
géneros Streptococcus y Enterococcus. (catalasa
-).
GENERO STAPHYLOCOCCUS Fundamento: La enzima catalasa descompone el
IDENTIFICACION peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno bajo
Durante el curso se le entregarán a los estudiantes la fórmula 2 H2O2----2 H2O + O2. De esta manera las
distintas cepas de cocos Gram + para su identificación. bacterias se protegen del efecto tóxico del H2O2, que es
El primer paso para la identificación de una especie un producto final del metabolismo aerobio de los
bacteriana es el estudio de su morfología microscópica azúcares.
y macroscópica. Luego se deben estudiar sus Procedimiento: Se coloca una gota de H2O2 al 3% sobre
requerimientos atmosféricos y nutricionales. Por último un portaobjetos y luego se transfiere una porción de
se procede a la realización de pruebas bioquímicas que colonia sobre el H2O2 realizándose una emulsión. En lo
permitirán llegar a la identificación de género y especie posible debe tomarse la colonia a partir de un medio sin
bacteriana. sangre ya que los eritrocitos tienen actividad de catalasa
y pueden falsear los resultados.
Morfología microscópica Esta prueba también puede realizarse en un aislamiento
Para la misma se debe realizar un frotis, de preferencia a en tubo, simplemente colocando unas gotas de H2O2
partir de medio líquido, realizando luego la tinción de dentro del mismo.
Gram lo que nos permitirá apreciar la forma, agrupación Interpretación de resultados: El desprendimiento de
y comportamiento al Gram de la cepa en estudio. El burbujas se considera una prueba positiva.
género Staphylococcus se caracteriza por ser cocos Dentro de la Flia. Micrococacceae existen 4 géneros,
Gram positivos que se agrupan en forma de racimo. el de mayor importancia clínica es el
Género Staphylococcus. Para diferenciarlo
Morfología macroscópica del Género Micrococcus se realizan distintas
Existe morfología macroscópica en medio líquido y en pruebas bioquímicas que sólo mencionaremos en la
medio sólido. En medio líquido debemos observar la Tabla Nº 2. Dentro del G.Staphylococcus existen 3
turbidez que se desarrolla luego de incubar 18-24 horas. especies de importancia clínica: S.aureus,
En medio sólido debemos contar con un aislamiento de S.saprophyticus y S.epidermidis. Estas se diferencias
la cepa a estudiar en una placa de Petri. El aislamiento según las pruebas bioquímicas que se detallan en la
nos permitirá observar las características de las colonias, Tabla Nº 3.
que son las estructuras macroscópicas que forman las
bacterias cuando crecen en medios sólidos. 2 . PRUEBA DE LA COAGULASA
Objetivo: Permite separar S.aureus, que posee
Requerimientos atmosféricos coagulasa, de las otras especies de estafilococos que
El género Staphylococcus es aerobio-anaerobio genéricamente se denominan coagulasa negativos.
facultativo, por tanto su crecimiento en tioglicolato será Fundamento: S.aureus posee dos tipos de coagulasa:
en toda la extensión del tubo. a. Una endocoagulasa o coagulasa ligada o
"clumping factor" que está unida a la pared celular. Esta
Requerimientos nutricionales actúa directamente sobre el fibrinógeno provocando la
1
Tabla Nº 2
CARACTERES G. STAPHYLOCOCCUS G. MICROCOCCUS
Bacitracina (disco 0.04 U) positivo negativo
Lisostafina sensible resistente
Utilización de glucosa anaerobia positiva negativa
Tabla Nº 3
formación de coágulos o grumos cuando se mezcla una Test en tubo
suspensión bacteriana con plasma citratado (test en Procedimiento: Se emulsionan varias colonias en un
lámina). tubo con 0,5ml de plasma citratado de conejo. Se incuba
a 35º y se chequea la formación del coágulo a las 4 horas.
CARACTERES S. aureus S. saprophyticus S. epidermidis
Si es negativo se reincuba toda la noche y se procede a
su lectura a las 18 horas. La lectura a las 4 horas, es
COAGULASA + fundamental
- porque en alguna - oportunidad puede
suceder que las fibrinolisinas de S.aureus lisen el
DNAsa + coágulo
- luego de 18 horas de- incubación y de esta
manera se produzcan un test falso negativo.
Interpretación de resultados: Se observa la formación
NUCLEASA + - -
de un coágulo total o parcial si el test es positivo.
TERMOESTABLE
PRESENCIA DE PROTEINA + - -
A 3.PRESENCIA DE DESOXIRRIBONUCLEASA
SUSCEPTIBILIDAD A LA R (DNAsa)
R S
Objetivo: Permite diferenciar S.aureus que es la única
NOVOBIOCINA
especie dentro del Género Staphylococcus que posee
b. Una exocoagulasa o coagulasa libre que actúa DNAsa de las otras especies.
mediante la activación de un factor (CRF), Fundamento: Se basa en la presencia de la enzima
formándose un complejo coagulasa-CRF, el termoestable DNAsa que es capaz de clivar los enlaces
cual reacciona con el fibrinógeno fosfodiester internos de la molécula de DNA. Se utiliza
produciéndose un coágulo de fibrina (test en un medio sólido que contiene verde de metilo el cual se
tubo). combina con DNA altamente polimerizado. Cuan-do la
Test en lámina combinación no ocurre, por acción de la enzima DNAsa,
Procedimiento: Se emulsionan una o más colonias en se produce una decoloración del medio. Procedimiento:
una gota de suero fisiológico hasta formar una Se siembra una colonia de estafilococo en forma de
suspensión lechosa sobre un portaobjetos. Luego se moneda en una placa de medio sólido que contiene DNA
agrega una gota de plasma citratado de conejo y se y verde de metilo. Se incuba 18 horas a 35º.
mezclan. Interpretación de resultados: La formación de un halo
Interpretación de resultados: Debe realizarse dentro transparente alrededor de la siembra indica presencia de
de los primeros diez segundos. Un test positivo se DNAsa.
evidencia por la formación de grumos. Los test
negativos deben ser confirmados por test en tubo. 4 . SUSCEPTIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA
2
Objetivo: Separar S.saprophyticus (resistente a la SENSIBILIDAD A LA BACITRACINA
novobiocina) de los demás estafilococos coagulasa Objetivo: Separar el Streptococcus pyogenes de los
negativos. demás estreptococos beta hemolíticos. Fundamento:
Fundamento: Varias especies del Género Streptococcus pyogenes es sensible a bajas
Staphylococcus son resistentes a la novobiocina (disco concentraciones de Bacitracina ( discos conteniendo
de 5 µg). 0,04U). También existe un 5% de cepas de Str.
Procedimiento: Se siembra una placa de agar sangre agalactiae que son sensibles a la Bacitracina.
con un hisopo embebido en una suspensión de la cepa a Procedimiento: Se realiza sembrando un gran inóculo,
estudiar. Luego se aplica el disco de novobiocina y se tomado con asa bacteriológica de un cultivo puro, que se
incuba a 35º por 18 horas. estría sobre una placa de agar sangre en varias
Interpretación de resultados: Un halo de inhibición de direcciones intentando obtener un cultivo confluente.
crecimiento menor o igual a 16mm corresponde a Luego se coloca el disco de Bacitracina y se incuba 1824
S.saprophyticus. Un halo de inhibición mayor de horas a 37º.
16mm corresponde a otros estafilococos coagulasa Interpretación de resultados: La aparición de
negativos. cualquier diámetro de halo de inhibición de crecimiento
alrededor del disco se considera prueba positiva.
GENERO STREPTOCOCCUS
Como ya mencionamos para el Género Staphylococcus 2. HIDROLISIS DEL PYR
la identificación comienza con el estudio de la Objetivo: Separar Streptococcus pyogenes y
morfología macroscópica y microscópica, la cual ya fue Enterococcus de los de-más estreptococos.
comentada en el capítulo teórico correspondiente. S.pyogenes y Enterococcus poseen la capacidad de
En este capítulo práctico sólo estudiaremos aquellas hidrolizar el substrato PYR (pirridonil ß-naftilamida)
especies más frecuentes en la práctica clínica, las cuales debido a que poseen la enzima l-piroglutamil
serán entregadas a los estudiantes para su identificación. aminopeptidasa. Existen varias configuraciones
En cuanto a los requerimientos nutricionales el Género comerciales de este test por eso no detallaremos ninguna
Streptococcus es exigente y por lo tanto debe ser en particular. En general siempre se revelan por un
cultivado en medios ricos que le aporten los nutrientes cambio de color. Este test es más específico y menos
necesarios, por ejemplo, agar sangre ovina. Dentro de laborioso que realizar el test de sensibilidad a la
las pruebas bioquímicas para la identificación, la Bacitracina y la bilis esculina y caldo salado (se verán
primera, luego de determinar que se trata de un coco más adelante).
Gram positivo, es la prueba de la catalasa. La misma ya
fue comentada en el capítulo de estafilococos. 3. PRUEBA DE CAMP
Luego de determinar que se trata de un coco Gram
positivo catalasa negativo, debemos proceder a observar
el efecto que tiene la cepa sobre el agar sangre
(hemólisis). Así podemos clasificar este grupo de
gérmenes en: ß hemolíticos: son aquellos que producen
una hemólisis total de los glóbulos rojos, observándose
como un halo transparente alrededor de las colonias.
α hemolíticos: son aquellos que producen hemólisis
parcial, la cual se observa como un halo con tonalidad
verdosa alrededor de las colonias.
Gamma hemolíticos: son aquellos que no producen
hemólisis sobre el agar sangre.
ESTREPTOCOCOS ß HEMOLITICOS
Los grupos más importantes son aquellos que se
mencionan en la Tabla Nº 1, junto a las pruebas
bioquímicas que se utilizan para su diagnóstico
presuntivo. Siempre se requieren pruebas de
confirmación serológica posterior para realizar un
diagnóstico definitivo. Str. grupo D es incluido dentro
de los ß-hemolíticos, ya que existen cepas de Str.
faecalis que pueden ser ß-hemolíticas.
3
Objetivo: Separar Str.agalactiae de los demás negro. La concentración de bilis es fundamental, ya que
estreptococos ß-hemolíticos. existen estreptococos del grupo Viridans que son
Fundamento: Se basa en que los estreptococos del capaces de crecer a concentraciones menores de bilis.
grupo B producen un factor llamado CAMP (factor de Procedimiento: Se realiza sembrando en superficie
monofosfato de adenina cíclica) que aumenta la zona de tubos de agar bilis esculina inclinado. Interpretación de
hemólisis producida por un estafilococo productor de resultados: Una reacción positiva se evidencia como
ßlisina. ennegrecimiento del medio.
Procedimiento: Se realiza estriando un cultivo de
estreptococo ß-hemolítico en forma perpendicular a una 5. PRUEBA DE TOLERANCIA A LA SAL (Caldo
estría de un estafilococo productor de ß-lisina en agar salado)
sangre. Se incuba 18-24 horas a 37ºC. Objetivo: Separar los enterococos, capaces de crecer en
Interpretación de los resultados: La prueba positiva se caldo salado, de los demás estreptococos del grupo D.
evidencia por la presencia de una zona de potenciación Fundamento: Se basa en la capacidad de los
de la hemólisis en forma de puntas de flecha en el lugar enterococos de crecer en una concentración de 6,5% de
donde se contactan las dos estrías. NaCl. Se trata de un medio de cultivo líquido que
contiene además de NaCl, glucosa y un indicador de pH:
ESTREPTOCOCOS ALFA Y GAMMA púrpura de bromocresol.
HEMOLITICOS Procedimiento: Se inocula el caldo salado con la cepa
Algunos grupos, como el D, ya fueron mencionados en de Str. grupo D a estudiar y se incuba 18-24 horas a 35º.
la Tabla 3. Dentro de este grupo se incluyen también Interpretación de resultados: Se considera la prueba
Streptococcus penumoniae y Streptococcus del grupo positiva cuando aparece turbidez con o sin acidificación
Viridans. El primero siempre es alfa-hemolítico, del medio, que se observa como un viraje de color del
mientras los segundos pueden ser alfa o gamma púrpura al amarillo. La no aparición de turbidez indica
hemolíticos. Ahora describiremos los ensayos una prueba negativa.
bioquímicos utilizados para su identificación.
6 . PYR
4. BILIS ESCULINA La prueba de PYR se utiliza para la identificación del
Género Enterococcus, como ya fue mencionado.
La especiación dentro del Género Enterococcus se
Objetivo: Separar los estreptococos del grupo D de los obtiene realizando una serie de pruebas bioquímicas
demás grupos de estreptococos. basadas en la utilización de distintos azúcares y
Fundamento: Se basa en la capacidad de los aminoácidos.
estreptococos del grupo D de crecer en un medio de
cultivo que contiene un 40% de bilis y de hidrolizar la SENSIBILIDAD A LA OPTOQUINA
esculina a esculetina, la cual se combina con el citrato Objetivo: Diferenciar S.pneumoniae de otros
ferroso que posee el medio, dando un complejo de color estreptococos α- hemolíticos.
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Fundamento: Se basa en la sensibilidad de
S.pneumoniae a una concentración menor o igual a
5µg/ml de hidroxicuprina (optoquina).
Procedimiento: Estriar un cuadrante de una placa de
agar sangre en varias direcciones con una suspensión Mc
Farland 0,5. Colocar luego un disco de optoquina en el
centro del área estriada. Incubar 18-24 horas a 37ºC.
Interpretación de resultados: Halos de inhibición
mayores de 15mm son característicos de S.pneumoniae.
IDENTIFICACION SEROLOGICA
Muchos Streptococcus aislados de infecciones humanas
poseen antígenos específicos de naturaleza polisacárida
( polisacárido C o ácidos teicoicos) que se encuentran en
la pared celular.
La extracción del polisacárido C por diferentes técnicas
y su posterior enfrentamiento con antisueros específicos
definen una serie de grupos que se denominan con letras
mayúsculas a partir de la A.
La utilidad de la extracción antigénica dependerá del
tipo de hemólisis. En los estreptococos ß-hemolíticos se
ha confirmado como el mejor método para su
clasificación. En los no ß-hemolíticos, la extracción
antigénica sólo es útil para la identificación de los
grupos D y B.
Existen diferentes métodos para la extracción enzimática
que no detallaremos. Actualmente se utilizan métodos
de extracción rápida por medio de enzimas de
extracción. Luego se procede a la identificación del
polisacárido por medio de técnicas de aglutinación con
partículas de látex que tienen absorbido el antisuero
específico. También existen en el mercado kits
comerciales que utilizan técnicas de coaglutinación.
