Western Blot
1. Objetivo
Confirmar la presencia de protenas mediante inmunodeteccin especfica.
2. Materiales y Equipo
Adems del listado de materiales a continuacin, verificar los reactivos para preparar las soluciones
requeridas.
dH2O Cmara de electroforesis y fuente de
Tris base poder
Glicina Ice pack y hielo
Metanol Parrilla de agitacin y agitador
Tween 20 magntico
Leche en polvo o BSA Fotodocumentador
SDS Plstico y selladora trmica
Reactivo de Ponceau Soluciones de anticuerpos
cido actico glacial Reactivos (Para anticuerpos
HCl conjugados)
3. Notas y recomendaciones
Utilizar guantes para el manejo de las muestras, reactivos y en general durante todo el
procedimiento.
Si ya cuenta con alguna(s) de las soluciones descritas, verificar que no tengan particulas y/o
crecimiento.
La tincin con Ponceau es nicamente para confirmar la transferencia de las protenas a la
membrana.
Las soluciones de anticuerpos se realizan en buffer de bloqueo de acuerdo a la dilucin
especficamente probada y/o recomendada por el proveedor
El Western Blot se lleva a cabo posteriormente de electroforesis SDS-PAGE
Vaciar los residuos de buffers y soluciones en el contenedor correspondiente. NO TIRAR A LA TARJA
1
4. Metodologa
Preparar las soluciones requeridas. A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones son en dH2O:
Tabla 1 Listado de buffers necesarios para realizar el gel y la corrida de electroforesis
Cantidad/
Solucin Reactivo pH Observaciones Etapa de uso
Concentracin
Tris base 3.03 g - Medir el pH (debe quedar
entre 5.7 y 6.2)
Glicina 14.4 g - Aforar a 1L con dH2O
Buffer de
- - Preparar de mnimo 2L por Transferencia
transferencia Metanol 200 mL transferencia
- Una vez aadido el metanol,
dH2O 670mL) guardar a 4C
Buffer de - Preparar en PBS (pH 7.4) o
Tween 20 0.2% (v/v) - Blotteo
lavado Buffer Tris (pH 7.5)
Leche en polvo
Buffer de - Preparar en PBS (pH 7.4) o
o 5% (p/v) - Blotteo
bloqueo Buffer Tris (pH 7.5)
BSA
Glicina 25 mM Stripping de
Stripping buffer 2.1 - Ajustar el pH con HCl
SDS 1% (p/v) membranas
Reactivo de
0.5% (p/v)
Ponceau
Ponceau - - Guardar a 4 C Tincin (Coomassie)
Ac. Actico
1% (v/v)
glacial
a) Transferencia
1. Equilibrar las membranas y los papeles filtro en buffer de transferencia durante 15 y 5 minutos
respectivamente.
Nota: Para membranas de PVDF remojar previamente en metanol 100% durante ~1min.
2. Abrir un cassette de bloteo con el lado de color negro hacia abajo y colocar en un recipiente con
buffer de transferencia.
3. Remojar previamente lo siguiente y colocarlos de acuerdo al orden que se menciona a continuacin:
Nota: Cuidar que no se generen burbujas
a. Esponja
b. Papel filtro
c. Gel
d. Membrana
e. Papel filtro
f. esponja
2
4. Cerrar el cassette y colocarlo en el sujetador con de forma que ambos lados de color negro estn en
la misma direccin.
5. Colocar la cmara de blotteo en un contenedor y colocar ambos sobre una parrilla de agitacin.
6. Colocar el sujetador (con el cassette) en la cmara, colocar un ice pack, un agitador magntico y
llenar con buffer de transferencia hasta el nivel indicado.
7. Activar la agitacin de la parrilla y verificar que el agitador funcione correctamente.
8. Llenar el contenedor, sobre el que est la cmara, con hielo.
9. Cerrar la cmara, conectar los electrodos a una fuente de poder y correr durante 1h 30 mins a 95V.
b) Bloteo
1. Desconectar la fuente y los electrodos. Abrir la cmara, sacar el cassette y recuperar cuidadosamente
la membrana.
Nota: En caso de requerirlo, realizar tincin de Ponceau para confirmar la transferencia de protenas.
2. Sumergir la membrana en buffer de bloqueo durante 1 hora con agitacin constante.
3
3. Colocar la membrana en bolsas de plstico junto con la solucin de anticuerpo primario y sellarlas.
Incubar a 4C durante toda la noche
4. Recuperar las membranas y aplicar la solucin con anticuerpo secundario durante 1h a 37C con
agitacin constante.
5. Realizar 3 lavados de 15 minutos con buffer de lavado y en agitacin constante. Adicionalmente
realizar un ltimo lavado con el buffer sin el Tween 20.
c) Inmunodeteccin y revelado (quimioluminiscencia)
1. Preparar el sustrato (Luminol) conforme a lo indicado por el proveedor.
2. Adicionar a la membrana y dejar actuar durante 1 min en agitacin constante.
3. Retirar el sustrato
4. Utilizar el fotodocumentador para tomar imagen de la membrana
d) Tincin de Ponceau
1. Aplicar solucin de Ponceau a la membrana (previo al bloqueo) durante 1h con agitacin constante.
2. Recuperar la solucin de Ponceau, (se puede utilizar hasta 10 veces)
3. Enjuagar con dH2O y con agitacin constante para desteir.
Nota: Tambin se puede aplicar PBS para remover por completo el colorante.
4. Cuando se logren ver las bandas (de color rojo y rosado) en la membrana tomar una imagen con el
fotodocumentador.
5. Para seguir con el bloteo desteir por completo la membrana y continuar conforme a lo descrito
anteriormente.
