Multibac I.D.
El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicro- - Multidiscos o sensidiscos conteniendo la concentracin adecuada
bianos es una de las funciones ms importantes de los laboratorios de de antimicrobiano.
microbiologa clnica. Su realizacin se desarrolla mediante las pruebas
de sensibilidad o antibiograma, cuyo principal objetivo es la evaluacin en Procedimiento
el laboratorio de un microorganismo frente a uno o varios antimicrobia- 1. Preparacin del inculo: recoger con un asa microbiolgica, de 3 a
nos, traduciendo, en una primera aproximacin, su sensibilidad al mismo 5 colonias iguales de la placa de cultivo de 18 a 24 horas y sembrar-
como una prediccin de su eficacia clnica. El antibiograma define la acti- las en 5 ml. De medio lquido (infusin cerebro-corazn, caldo Todd
vidad in Vitro de un antibitico frente a un microorganismo determina- Hewitt, caldo soya tripticasa, etc.) e incubar a 35C. Durante 2 hasta
do y manifiesta su capacidad para inhibir el crecimiento de una poblacin 6 horas, conseguir o superar turbidez del 0.5 de la escala de MacFar
bacteriana. Por consiguiente, ofrece en su conjunto, elementos objetivos land. Si la turbidez es superior, se realiza el ajuste necesario con so-
de actuacin en los tratamientos empricos. El panorama actual de las lucin salina estril.
resistencias de los microorganismos a los antimicrobianos hace ineludible El estndar de sulfato de bario de MacFarland, se prepara mezclando:
su determinacin, incluso en aquellos casos en los que la sensibilidad se -0.5 ml. de cloruro de bario 0.048 M. (1.175% peso/volumen de
considera universal y no se han descrito (por el momento) mecanismos cloruro de bario dihinidratado con: -99.5 ml. De H2S04 al 1% v/v
de resistencia. Los ensayos de sensibilidad han de estar convenientemen- [0.36 N.]) Esto es la mitad de la densidad del tubo no.1 de MacFar
te normalizados y sujetos a procesos de control que aseguren su reprodu- land y se denomina, 0.5 de MacFarland.
SA
cibilidad. Para efectos de reproducibilidad y practica rutinaria, las pruebas
semicuantitativas de difusin en agar nos brindan la informacin suficien- 2. Preparar el medio de Muller-Hinton agar y depositar aproximadamen
te para la eleccin y seguimiento del tratamiento con antimicrobianos. te 25 ml. del medio, sobre las cajas de petri estriles de 90 mm de
El antibiograma esta indicado cuando se asla una bacteria responsable dimetro (si las cajas fuesen de mayor dimetro, calcular el volumen
de un proceso infeccioso y no puede predecirse su sensibilidad, espe- necesario para obtener un grosor de la placa de agar de aproxima-
cialmente si sabe que este tipo de bacteria puede presentar resistencia a damente 4mm). Las placas pueden guardarse en refrigeracin has-
M
los antimicrobianos usados ms comnmente. ta su uso debiendo tener la precaucin de que no almacenen agua
El mtodo de difusin en agar es fcil de realizar, rpido y barato. Es una de condensacin. Para microorganismos exigentes, se puede adicio-
metodologa aplicable a una amplia variedad de bacterias, fundamental- nar al medio, sangre de carnero desfibrinada estril al 5%.
mente bacterias aerobias de crecimiento rpido como: Enterobacteria-
AA
ceae, Pseudomonas sp, Staphylococcus sp, Enterococcus sp, Acineto- 3. Antes de que transcurran 15 minutos de haber ajustado el inculo,
bacter sp, etc. introducir un hisopo de algodn estril dentro de la suspensin y al
retirarlo, rotar varias veces contra la pared del tubo por encima del
Fundamento de la prueba nivel del lquido con la finalidad de eliminar el exceso de inculo.
El antibiograma por la tcnica de difusin en agar (disco-placa) basado
en las investigaciones de Bauer-Kirby y colaboradores, es uno de los m- 4. Inocular las placas de Muller-Hinton agar completamente, sin dejar nin-
G
todos que el National Committee for Clinical Laboratory Standars (NC- guna zona libre. Esto se consigue deslizando el hisopo por la superficie
CLS) recomienda para la determinacin de la sensibilidad bacteriana a del agar tres veces, rotando la placa unos 60 cada vez y pasndola por
los antimicrobianos. El antibiograma disco-placa consiste en depositar, ltimo por la periferia del agar para conseguir una siembra uniforme.
en la superficie de agar de una caja de petri previamente inoculada con Dejar secar de 3 a 5 minutos antes de colocar los discos.
el microorganismo, discos de papel secante impregnados con diferentes
antibiticos. Tan pronto el disco impregnado de antibitico se pone en 5. Colocar los discos con dispensadores o manualmente con pinzas es
contacto con la superficie hmeda del agar, el filtro absorbe agua y el triles. Debe asegurarse que contacten perfectamente con la super-
antibitico difunde al agar. El antibitico se difunde radialmente, a travs ficie del agar, por lo que deben presionarse ligeramente sobre la su-
del espesor del agar a partir del disco formndose un gradiente de con- perficie del agar. No deben situarse a menos de 15 mm del borde
centracin. Transcurridas, de 18 a 24 horas de incubacin, los discos de la placa, y han de estar distribuidos de forma que no se produzca
aparecen rodeados por una zona de inhibicin. La concentracin del anti- superposicin de los halos de inhibicin.
bitico en la interfase entre bacterias en crecimiento y bacterias inhibidas
se conoce como concentracin crtica y se aproxima a la concentracin 6. Incubar las placas invertidas a 35C. En atmosfera aerbica antes de
mnima inhibitoria (CMI), obtenida por mtodos de dilucin. que transcurran 15 minutos. Las placas se incubarn 16-18 horas.
Mtodo Lectura de los resultados
Medios, materiales y equipo necesario: Despus de 18 horas de incubacin, leer el dimetro de las zonas com-
- Medio de cultivo Mueller-Hinton Agar. pletas de inhibicin con una regla. Las zonas de los medios transparentes
- Solucin salina isotnica estril. se miden sobre el reverso de la placa y los medios que contienen sangre,
- Tubos de ensaye estriles. sobre la superficie del agar.
- Hisopos de algodn, estriles. Cuando aparecen colonias dentro del halo de inhibicin, puede tratarse
- Cajas de petri estriles. de mutantes resistentes, contaminaciones, poblaciones heterogneas o
- Pinzas de diseccin. cultivos mixtos y conviene volver a identificarlas y realizar otra vez el en-
sayo de sensibilidad antimicrobiana.
Interpretacin de los resultados Estreptococos 19 20-27 28
Comparando los dimetros del halo de inhibicin con las CMIs, y esta- Staphylococcus sp 28 ---- 29
bleciendo las correspondientes rectas de regresin, se han fijado criterios
N. gonorrhoeae 19 ---- 20
para clasificar las cepas estudiadas. De esta forma tenemos tres catego-
ras: sensible (S), intermedia (I) y resistentes (R). Anteriormente se aada Neumococos 19 ---- 20
(STX) Sulfametoxazol
la categora moderadamente sensible (MS), que tiende a eliminarse y los /Trimetroprim
25 mcg 10 11-15 16
resultados correspondientes a la misma se han situado en la categora de (TE) Tetraciclina 30 mcg 14 15-18 19
intermedia. Las interpretaciones seguirn las normas establecidas por el (VA) Vancomicina 30 mcg -- ---- --
NCCLS, pero, por regla general, un dimetro de inhibicin de 30 a 35
Enterococcos 14 15-16 17
mm es indicativo de una cepa altamente sensible, mientras que dimetros Staphylococcus -- ---- 15
de zona de inhibicin inferiores a 15 mm son los que presentan las cepas aureus
resistentes.
Notas al procedimiento
Sensible. Indica que la infeccin ocasionada por la cepa para la que Se recomienda utilizar el mtodo de suspensin directa de colonias para
se han determinado la MCI o su correspondiente halo de inhibicin el estudio de microorganismos de crecimiento difcil en medios lquidos
puede tratarse de forma adecuada empleando las dosis habituales del (Haemophilus sp, N. Gonorrhoeae, S. Pneumonie, Estreptococos que no
antimicrobiano. sean enterococos, Listeria, Moraxella y Croynebacterium sp) y para Esta-
Intermedio. Indica que el halo traducido en valores de CMI se aproxi- filococos en los que se quiera detectar la resistencia a oxacilina.
ma a las concentraciones de antimicrobiano alcanzables en sangre -Mtodo de suspensin directa de colonias: a partir de una placa de
y que puede esperarse eficacia clnica en aquellas localizaciones en cultivo de 18 a 24 horas de incubacin recoger varias colonias con un
que se alcanzan altas concentraciones de antimicrobiano (Ej. orina) asa bacteriolgica y ajustar el inculo a una turbidez equivalente al 0.5
cuando se emplean dosis mas elevadas de lo habitual. de MacFarland en solucin salina isotnica estril. Agitar en un agita-
Resistente. Se refiere a aquellos microorganismos que no se inhiben dor Vortex durante 15-20 segundos. Continuar con el paso no.2.
por las concentraciones habitualmente alcanzadas en sangre/tejidos
del correspondiente antimicrobiano, o a aquellos microorganismos Control de calidad
SA
en los que existen mecanismos de resistencia especficos para el Es necesario emplear cepas control para supervisar la exactitud y fiabi-
agente estudiado. lidad de la metodologa:
- Staphylococcus aureus ATCC-25923
Tabla de comparacin de halos de sensibilidad en mm. (NCCLS) - Escherichia coli ATCC-25922
R I S
Clave-antibitico Concentracin Debido tambin al gran nmero de variables que pueden afectar los
Igual o menor Entre Igual o mayor
M
(AK) Amikacina 30 mcg 14 15-16 17
resultados como son:
- Indebida preparacin del inculo.
(AM) Ampicilina 10 mcg
- Indebida preparacin del medio Muller-Hinton agar.
Enterobacteriacea 11 12-13 14
- Tiempo ente la preparacin del inculo y la siembra del medio de cultivo.
AA
Staphylococcus sp. 28 ---- 29 - Exceso de inculo
Enterococos 16 ---- 18 - Deshidratacin del medio de cultivo.
Estreptococos 21 30 - Cepas mixtas en estudio.
(CB) Carbenicilina 100 mcg - Interpretacin de los halos de inhibicin.
Enterobacteriaceae 18 18-22 23 - Tiempo de lectura despus de 18 horas de incubacin.
G
Pseudomonas sp. 13 14-16 17
(CF) Cefalotina 30 mcg 14 15-17 18
Bibliografa
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(CTZ) Ceftazidima 30 mcg 14 15-17 18
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Staphylococcus sp 10 11-12 13
Pp. 52-111
(ENX) Enoxacina 10 mcg 14 15-17 18
(E) Eritromicina 15 mcg 13 14-17 18
(GE) Gentamicina 10 mcg 12 13-14 15
(NET) Netilmicina 30 mcg 12 13-14 15
(NF) Nitrofurantona 300 mcg 14 15-16 17
(NOF) Norfloxacina 10 mcg 12 13-16 17
(PE) Penicilina 10 U
Enterococos 14 ---- 15
