UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS BIOLOGIA MOLECULAR
UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
2017
INFORME DE BIOLOGIA MOLECULAR
Profesora: GIOVANNA
ELIZABETH SOTIL CAYCHO
Integrantes:
Andrea Soledad Aragon
Torres
Karen Quispe Ore
Piero Fabio Guardales
Martel
Sebastian Vivanco flores
UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS BIOLOGIA MOLECULAR
I. INTRODUCCION
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es una tcnica empleada en la biologa
molecular con el fin de obtener mltiples copias de una regin especfica de ADN o
molde in vitro (en un tubo de ensayo en lugar de un organismo).
Esta tcnica se fundamenta en la propiedad que tiene las DNA polimerasas para replicar
las hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas
alternadas para separar las hebras de ADN recin formadas entre si tras cada fase de
replicacin y a continuacin, dejar que las polimerasas vuelvan a unirse a los segmentos
de ADN para que vuelvan a duplicarlas.
En un principio la tcnica era lenta ya que las polimerasas constantemente se
desnaturalizaban en cada cambio de temperatura (95C) y haba que agregar nuevas
polimerasas sin embargo se realizaron ms investigaciones en las que se obtuvieron
ADN polimerasas termoestables extradas de organismos que toleran estas
temperaturas.
La ADN polimerasa que normalmente se utiliza en la PCR se llama Taq polimerasa, por
la bacteria tolerante al calor de la que se aisl (Thermus aquaticus).
T. aquaticus vive en aguas termales y fuentes hidrotermales. Su ADN polimerasa es
muy termoestable y su mayor actividad se presenta cerca de los (temperatura a la que
la ADN polimerasa de ser humano o de E. coli no funcionara). La Taq polimerasa es
ideal para la PCR gracias a esta estabilidad trmica. Como veremos, la PCR utiliza altas
temperaturas repetidamente para desnaturalizar el molde de ADN o separar sus
cadenas.
Mediante el uso de la PCR, una secuencia de ADN se puede amplificar millones o miles
de millones de veces y producir suficientes copias de ADN para que se analicen
mediante otras tcnicas. Por ejemplo, el ADN se puede visualizar por electroforesis en
gel, enviar a secuenciar o digerir con enzimas de restriccin y clonar en un plsmido.
La PCR es una tcnica cotidiana y normalmente indispensable en laboratorios de
investigacin mdica y biolgica para una variedad de aplicaciones dentro de las que
encontramos la clonacin de ADN para su secuenciacin, la filogenia basada en ADN,
el anlisis funcional de genes, el diagnostico de trastornos hereditarios, la identificacin
de huellas genticas (usada en tcnicas forenses y pruebas de paternidad), la deteccin
y el diagnstico de enfermedades infecciosas.
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II. PRODECIMIENTO
Preparacin del master mix
Se limpi el rea de trabajo con alcohol, se realiz el trabajo en frio (se mantuvieron los
tubos sobre hielo). Se seleccionaron las muestras de ADN molde animal y vegetal a
amplificar y se rotularon ambos tubos.
De acuerdo a los volmenes de reaccin y al kit de PCR a utilizar se realizaron los
clculos para determinar el volumen del master mix a preparar para el nmero de
muestras +1 (sin considerar el volumen de ADN), y la concentracin final de reaccin.
(tabla n1).
Se prepar el master mix en un microtubo de 0.6 ml rotulado. Se retir y se alicuoteo la
cantidad necesaria por reaccin en cada tubo de PCR de 0.2 ml.
Se mezcl en un vortex y se centrifugo por segundos, en modo touch.
Tabla n 1. Master mix
Componentes CCI CCF Vol Vol MTX
Buffer 10 x 10 X 1X 1.5 6
Primer F 10 uM 0.1 uM 1.5 6
Primer R 10 uM 0.1 uM 0.15 0.6
dNTPs 10 uM 200 uM 0.3 1.2
H2O 11.4 45.6
DNA pol 0.5 2
Template 1
Total 15 60
Amplificacin de ADN
Se colocaron los tubos de PCR en un termociclador, se ajust la temperatura de
hibridacin. Se termin de realizar el PCR luego de dos horas aproximadamente.
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III. RESULTADO:
Anlisis:
El PCR obtenido en clase casi no se logra visualizar, excepto por pequeos fragmentos en la base.
Debido a que el ADN recorre el gel de acuerdo con su peso molecular, la pequea porcin que
se visualiza debe ser de ADN fragmentado o de Primers.
El PCR que realiz la profesora nos revelo que el ADN proveniente de una muestra Animal, se
encuentra en un muy buen estado. Esto es consistente con la buena concentracin de ADN
hecho con NANODROP. Se visualiza gran cantidad de ADN replicado consistente con el control
positivo. Nuestra muestra vegetal sin embargo mostro dos barras al correr la electroforesis, es
probable que esta muestra haya estado contaminada o que las molculas de ADN hayan
formado puentes de hidrogeno que alteraron su conformacin natural. Esto est acorde con la
poca concentracin de y pureza del ADN de la muestra vegetal cuantificada con NANODROP.
La primera extraccin y electroforesis que hicimos tambin nos result con una baja cantidad
de ADN vegetal obtenido. Tuvimos en nuestro animal, una gran cantidad de ADN, sin embargo
no todo estaba completo, estaba fragmentado y por lo tanto se vea un franja de corrida a lo
largo del gel.
Aunque nuestra muestra de ADN vegetal estaba contaminada, los resultados indican que al
menos una buena porcin del ADN extrado de muestra animal estaba en un suficiente buen
estado como para que se pueda duplicar. Por lo tanto, lo ms probable es que haya sido un error
de manipulacin en clase al momento de preparar el MasterMix y en mezclarlo con nuestras
muestras de ADN. Se observo que, en relacin con los otros grupos, en nuestra muestra haba
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ms sobrenadante, es posible que los insumos de la MasterMix hayan estado en un volumen
errneo, y que, por esto, no se haya logrado duplicar suficiente de ADN.
IV. CUESTIONARIO
1. Qu es la temperatura de extensin y de que factores depende?
La temperatura de extensin 72C es la cual se produce la sntesis de una cadena
sencilla (producindose un fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la
direccin de 5 3 mediante la enzima DNA polimerasa. Esta temperatura de extensin
depende de los nucletidos conformados en la cadena al ser elongada, siendo guanina
citosina las que requieren mayor T por lo tanto necesitaremos la temperatura indicada
para que las hebras no se cierren y esta est totalmente elongada y no posea nudos
en la hebra, as la ADN polimerasa podr hacer su trabajo.
El tiempo de extensin depende de la longitud y concentracin de la secuencia blanco
y de la temperatura. La extensin del primer se realiza tradicionalmente a 72C. Las
estimaciones para la tasa de incorporacin de nucletidos a 2C varia de 35 a 100
nucletidos por segundo dependiendo del buffer, pH, concentracin de sales y la
naturaleza del templado. Un tiempo de extensin de un minuto es considerado suficiente
para productos de hasta 2 kb de longitud. Sin embargo, tiempos mayores de extensin
pueden ser tiles cuando la concentracin del sustrato es muy pequea o cuando la
concentracin del producto excede la concentracin de la enzima. (Cortazar Martinez,
Adriana, MTODOS FSICO-QUMICOS EN BIOTECNOLOGA.)
2. Cules de los primers de la lista son degenerados? Por qu? Presentaran
alguna ventaja?
Los primers degenerados son 18sdna shrimp 143 F y 18sdna shrimp 143 R en los cuales
presenta, en su secuencia, un nucletido degenerado N el cual nos dara 4 secuencias
pueden ser adenina, citosina o guanina y timina. Porque en la secuencia observamos
una N en lugar de cualquier nucletido, esto nos indica que nuestra secuencia esta
degenerada.
Los primers pueden contener extensiones en el extremo 5 o mismatches para
incorporar sitios de enzimas de restriccin, un codn de inicio ATG, o secuencias
promotoras en la secuencia blanco. Pueden ser usados primers degenerados para
extraer genes nuevos en base a su similitud o su secuencia de aminocidos.
La ventaja que nos da los primers degenerados es que son primers que tienen un
nmero de opciones en varias posiciones en la secuencia para permitir el alineamiento
y la amplificacin de una variedad de secuencias relacionadas. (Cortazar Martinez,
Adriana, MTODOS FSICO-QUMICOS EN BIOTECNOLOGA.)
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V. BIBLIOGRAFIA
Cortazar Martinez, Adriana. MTODOS FSICO-QUMICOS EN
BIOTECNOLOGA. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE
MEXICO: Instituto de Biotecnologia. Accessed October 16, 2017.
[Link]
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