Ctedra: Gentica Bsica Profesora: Mag. Med. Vet. Iglesias Gabriela.

Universidad Nacional de Rio Negro. Escuela Veterinaria - Choele Choel, Rio negro.
Alumna: BUSSON, Silvina Alejandra. Noviembre 2014.

HEMOFILIA EN PERROS

INTRODUCCION

La hemofilia es frecuentemente un trastorno hemorrgico grave causado por una deficiencia

en factor VII/IX de coagulacin, que afecta de forma severa el proceso de coagulacin. Se
caracteriza por un tiempo de coagulacin prolongado, en el cual las plaquetas son incapaces
de adherirse a las paredes de los vasos daados. La enfermedad se da en muchas razas y en
perros mestizos.

La hemofilia es un desorden recesivo ligado al cromosoma X, por lo que las hembras (tienen
dos cromosomas X) solo sern afectadas cuando tengan dos copias mutadas del gen. Es uno de
los pocos caracteres ligados al sexo en perros. Los machos tienen un cromosoma X heredado
de su madre, y un cromosoma Y heredado de su padre. Las hembras tienen dos cromosomas X,
uno de su padre y uno de su madre. Por lo tanto, si una madre portadora (Xx) transmite el gen
mutado a su hija, sta ser una portadora afectada o presentar la enfermedad de forma leve,
pero los hijos que reciban el gen mutado (xY) sern afectados. Sin embargo, los machos tienen
un cromosoma X y un cromosoma Y. Los machos que hereden una copia mutada del gen de su
madre sern afectados. Incluso aunque estn levemente afectadas, las hembras portadoras no
deberan reproducirse. (1)
 Enfermedad producida por un gen recesivo ligada al sexo (2)

Actualmente es posible clasificar la hemofilia en dos tipos, indistinguibles clnicamente, la

hemofilia A, asociada a un defecto en el factor VIII de coagulacin (FVIII), y la hemofilia B que
se caracteriza por el dficit del factor IX de la coagulacin (FIX) en plasma (McKusick, 1994).

El modelo de la hemofilia B en caninos, imita la enfermedad en los seres humanos (3)

La mutacin causal de la hemofilia y el tipo de hemofilia ha sido descripta recientemente por

Rogaev y colaboradores (2009), el cambio encontrado fue reportado como una mutacin en el
sitio consenso de splicing del intrn 3 (IVS33A>G) en el gen del FIX (hallazgo que explica que la
familia real padeca la enfermedad) (4)
Hemofilia B

La hemofilia B (HB) o enfermedad de Christmas se caracteriza por mutaciones de diverso tipo y

severidad a lo largo del gen del factor IX de coagulacin (F9), y al igual que en HA resulta en
una protena plasmtica afectada o ausente.

Estructura de la protena, el mensajero y el gen del factor IX de coagulacin.

El FIX fue aislado en 1982 (Kurachi y Davie, 1982) y caracterizado en 1985 (Yoshitake et al,
1985). El gen FIX se encuentra localizado en la regin telomrica del brazo largo del
cromosoma X, en la banda Xq27 (Chance y col., 1983). Tal y como se indica en la Figura 1 el
gen FIX, clonado en 1982, tiene un tamao cercano a las 34 Kb y consta de 8 exones y 7
intrones (5). En este caso no existen mutaciones recurrentes, sino que se han detectado gran
variedad de mutaciones a lo largo de su secuencia.

Figura 1

El FIX maduro consta de 415 residuos (excluyendo 46 residuos correspondientes al pptido

seal y al propptido), con una masa molar relativa de 55 kilo Daltons (kD), constituye una
enzima con actividad sernproteasa dependiente de la vitamina K, sintetizada en el hgado y
liberada al plasma como un zimgeno o proenzima, que es activada a travs del clivaje
proteoltico mediado mayoritariamente por el FXIa. El FIXa participa en un complejo junto con
el FVIIIa sobre la superficie plaquetaria para activar al factor X en una reaccin crucial para la
generacin de trombina y el proceso de coagulacin sangunea.
En la protena se pueden distinguir principalmente 4 grandes dominios estructurales, desde el
extremo amino (Fig. 2): el dominio Gla (residuos 140), un pequeo segmento hidrofbico
(4147), dos dominios que muestran homologa con el factor de crecimiento epidrmico (EGF1
y 2) (4884 y 85128, respectivamente), juntos estos 3 dominios conforman la cadena liviana
del FIX (1145), y un dominio cataltico sernproteasa, que corresponde a la cadena pesada
(181415). Ambas cadenas se mantienen unidas a travs de un puente disulfuro (Di Scipio et al,
1978, Anson et al, 1984).

Figura 2

La deficiencia del factor IX en los perros es causada por una mutacin compleja en las
posiciones 772 a 777 del cDNA. (Figura 3)
Los resultados de la mutacin en un mutgeno 'frameshift' de translacin, un codn de parada
prematuro y una ausencia completa del FIX funcional (6).
El gen del FIX se encuentra un poco ms hacia el centrmero en Xq27.2, separado del gen del
FVIII por 0.5 centimorgans (cM); es menos complejo, tiene 34 kb de longitud, se compone de 8
exones (a-h), codifica un ARN mensajero (ARNm) de 1.4 kb y aunque existe una amplia gama
de mutaciones, las ms frecuentes son las puntuales.
Electroforesis del gel de poliacrilamida (secuencias de racciones del gen mutado- Figura 3)

Figura 3

El F9 se organiza en 8 exones (Fig. 2, panel superior):

El exn A codifica para el pptido seal involucrado en la secrecin desde el hepatocito.
El exn B codifica principalmente para el propptido, los sitios de unin de la carboxilasa
dependiente de vitamina K, y junto al exn C codifican para completar el dominio Gla.
El exn D codifica para el primer dominio del tipo factor de crecimiento epidrmico que
contiene un dominio conservado de residuos carboxlicos incluyendo un hidroxiasprtico en
el aminocido 64 que une un in Ca++ adicional con alta afinidad. El exn E codifica para el
segundo dominio del tipo factor de crecimiento epidrmico.
El exn F codifica para el segmento llamado pptido de activacin, que se libera del factor
resultando en la cadena liviana y pesada del FIXa.
Los exones G y H codifican para el dominio cataltico con actividad serinproteasa, responsable
de la protelisis del factor X a Xa, esta regin mantiene alta homologa con otras
sernproteasas estudiadas y es altamente probable que la trada His221, Asp269 y Ser365
participen en el clsico mecanismo cataltico estudiado en este grupo de protenas como la
tripsina. Estos tres residuos juntos se los denomina trada cataltica (Giannelli et al, 1998).

Estudios posteriores a la caracterizacin completa del F9 en 1985, detectaron defectos

genticos causales de HB, observando una alta frecuencia de mutaciones por cambio de un
solo nucletido, ampliamente distribuidas dentro de la secuencia gnica, asociadas a cambios
de falso sentido (missense), cambios a no sentido (nonsense) y cambios del marco de lectura
(frameshifts) (Tabla 1).

Estudio previo en perros de raza Rodesiana

Mutacin encontrada en el nucletido 1477 de G A, en el dominio

cataltico

Cambio G A EXON 7
Glicina Acido Glutmico inactividad del sitio cataltico del FIX
Diagnostico por PCR / RFLP (enzima restriccin)
1 PCR, amplificacin 133pb
2 La banda 133pb se digiere con la una enzima (Ddel).
3 Se corre un gel
No hay sitio de corte por la ez Ddel

Alelo Normal 133pb

Alelo Mutado
54pb Sitio de corte por la ez Ddel 79pb

NN NM MM M N

133pb

79pb
54pb
(8)
 Estudio previo en perros de raza Lhasa Apso

Mutacin compleja en las posiciones 772 a 777 del cDNA ( delecin de

5pb) y en el 777 cambia C T, en la regin del pptido seal.
Produce un Codn de Stop, y se termina la sntesis de la protena
(protena corta no funcional). O sea, pierde el sitio cataltico.

Diagnostico: Slo por PCR

1 Amplificacin 181pb en el normal.
2 Amplificacin del mutado, 181pb 5pb = 176pb
3 Hacer un gel de agarosa.
Sin delecin
Alelo Normal 181pb
181pb 5pb = 176pb
Alelo Mutado

Hemofilia A

La HA est caracterizada por mutaciones deletreas de distinto tipo a lo largo del gen del
factor VIII de coagulacin (F8), resultando en una protena plasmtica FVIII ausente o afectada.

Estructura de la protena, el mensajero y el gen del factor VII de coagulacin.

La determinacin de la secuencia nucleotdica del ADNc (ADN copia del ARNm) del FVIII,
predice una cadena polipeptdica madura de 2332 aminocidos (excluyendo los 19 residuos del
pptido seal, indispensables para su secrecin) con una masa molar relativa de 265 kD (sin
considerar carbohidratos) (Vehar et al, 1984).

La estructura primaria del FVIII muestra bsicamente 3 tipos de dominios repetidos que
incluyen una regin triplicada de aproximadamente 330 residuos (dominios A), una regin
nica de 980 residuos (dominio B) y una regin carboxiterminal duplicada de 150 residuos
(dominios C), y tres pequeos pptidos cidos (a1, a2, a3) en el orden:
[Link] (Vehar et al, 1984) (Fig. 2, panel inferior). Esta
estructura presenta un alto grado de homologa con el factor V de coagulacin
(A1A2BA3C1C2, slo sus dominios B no estn relacionados), con la protena plasmtica
ceruloplasmina (A1A2A3) y con la ferroxidasa (dominio A) (Vehar et al, 1984). Sus dominios C
tambin presentan homologas entre s y con protenas de otras especies, pero en grado
menor. El gen que codifica para el factor VIII, localizado en la regin Xq28 del cromosoma X.
Contiene 22 exones (Fig.4) con tamaos comprendidos entre 69 y 3106 pares de bases (bp)
que se transcriben a un ARNm de 9 kb. Las secuencias correspondientes a los intrones ocupan
177 kb del gen, y entre ellos, el intrn 22 es el de mayor tamao (Gitschier et al, 1984) (Fig. 2,
panel inferior).

Figura 4

Despus del clonado y caracterizacin del F8 (Gitschier et al, 1984; Vehar et al, 1984; Toole et
al, 1984; Wood et al, 1984), numerosos estudios detectaron mutaciones causales de HA
severa, moderada y leve, incluyendo casi todo tipo de cambios: deleciones grandes (> 0,2 kb)
mediadas por eventos de recombinacin homloga (Rossetti et al, 2004) o de recombinacin
no homloga (WoodsSamuels et al, 1991), deleciones o inserciones pequeas (de 1 bp, en
motivos repetidos, o de pocas bases, algunas de las cuales predicen cambios en el marco de
lectura o frameshifts y otras no), inserciones grandes, como la insercin del retrotransposn
LINE1, long interspersed nuclear elements o Alu, mutaciones puntuales que causan cambios
de falso sentido (missense), o aparicin prematura de codones de terminacin (nonsense), o
que afectan las secuencias necesarias para el proceso de maduracin del transcripto primario
de ARN en ARNm (splicing).(Gitschier et al, 1988; Kazazian et al, 1988; Kogan y Gitschier, 1990;
Tuddenham et al, 1991; Higuchi et al, 1991) (Tabla 2).
CONCLUSIN

La bsqueda de las mutaciones que causan hemofilia es motivo de inters internacional, pues
tales cambios se correlacionan con la severidad de la enfermedad y con la funcin del dominio
afectado; el anlisis permite esclarecer los mecanismos moleculares que las provocan, la
naturaleza de la actividad de los factores, y proporcionan herramientas tiles para producir
factores recombinantes ms eficaces. A las tcnicas que se emplean a fin de identificar las
mutaciones, se las simplifica para abarcar las partes funcionalmente importantes de los genes,
debido a la dificultad para secuenciar un gen completo.

BIBLIOGRAFIA

(1) [Link]
(2) [Link]
(3) Evans J, Brinkhous K, Brayer G, Reisner H, High K Canine hemophilia B resulting from a
point mutation with unusual consequences. Proc Natl Acad Sci USA 86:10095, 1989
(4) Antecedentes histricos de la Hemofilia
[Link]
(5) Genetica Molecular de Hemofilia. Radic, Claudia Pamela2010
(6) A deletion mutation causes hemophilia B in Lhasa Apso dogs. AE Mauser, J Whitlark,
KM Whitney and CD Jr Lothrop
(7) [Link]
(8) G244E in the canine factor IX gene leads to severe haemophilia B in Rhodesian
Ridgebacks. R. Mischke a,*, P. Khnlein b, A. Kehl b, I. Langbein-Detsch b, F. Steudle b,
A. Schmid c, T. Dandekar c, A. Czwalinna d, E. Mller b.