Instituto Politcnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas
Laboratorio de Bioqumica General
Alumnos: Aguilar Bautista Apolinar.
Garca Gutirrez Karen Liliana.
Seccin 2.
Catedrtico: M. en C. Vernica Alcntara Farfn
Prctica 1. DETERMINACIN DE AMINOCIDOS TERMINALES CON GRUPO
ALFA-AMINO LIBRE. MTODO DE SANGER.
DETERMINACIN DEL GRUPO AMINO TERMINAL DE LA HEMOGLOBINA.
Objetivo.
Identificar el aminocido alfa-amino En dnde;
terminal de las cadenas de la El frente del soluto es la
molcula de hemoglobina por el distancia recorrida de la
mtodo de Sanger. muestra.
El frente del eluyente es la
Resultados. distancia recorrida de este
Se obtuvieron los siguientes Rf con ltimo.
base a una cromatografa utilizando Para DNFB.
de como soporte papel Whatson No. Frente de soluto Frente del
1 (celulosa), como fase estacionaria eluyente
agua y fase mvil una sustancia 18.6 cm 38.6 cm
18.6
tampn de Citratos pH 6.4. = = 0.481
38.6
Tabla 1. Resultados de Rf Para DNP-Val.
calculados en la cromatografa. Frente de soluto Frente del
Muestras Rf eluyente
Calculado 27.9 cm 38.1 cm
1 27.9
DNFB 0.481 = = 0.732
2 38.1
DNP-Val 0.732
3
DNP-Ala 0.572 Para DNP-Ala.
4
DNP-Phe 0.608 Frente de soluto Frente del
Muestra Rf(1) 0.686 eluyente
21.8 cm 37.9 cm
problema. Rf 0.429 21.8
(2) = = 0.572
37.9
La relacin de frentes (Rf) de cada
muestra se calcul en base a dos Para DNP-Phe.
variables las cuales fueron, el frente Frente de soluto Frente del
del eluyente (fase mvil) y el frente eluyente
del soluto (Muestras). 22.7 cm 37.3 cm
22.7
= = 0.608
37.3
=
Discusin de resultados.
Para muestra problema Rf (1). Este ensayo generalmente consiste
Frente de soluto Frente del de 4 pasos clave durante el
eluyente desarrollo del mtodo establecido,
25.4 cm 37 cm comenzamos con la disolucin de la
25.4
= = 0.686 hemoglobina en bicarbonato de sodio
37 al 4.2 % debido a que el siguiente
Para muestra problema Rf (2).
Frente de soluto Frente del
paso que fue la dinitrificacin de los
eluyente grupos alfa-amino terminal requerira
15.9 cm 37 cm de un medio ligeramente alcalino,
15.9 siendo el bicarbonato una sustancia
= = 0.429
37 ideal para generar estas condiciones,
posteriormente agregamos 2 mL de
solucin de DNFB al 1%, seguido de
una agitacin fuerte durante un lapso
de 1 hora todo esto para que los
grupos amino libres colisionaran con
el DNFB y llevara a cabo la reaccin
de sustitucin nucleoflica aromtica,
liberando cido fluorhdrico, razn por
la cual se debe vigilar que el pH se
mantenga entre 8 y 9 para evitar que
la protena se precipite por el cido
resultante. Al terminar este lapso se
ajust a pH de 3 con HCl 3N, con el
fin de detener la dinitrofenilacin,
despus se realizaron 3 extracciones
con 5 mL y una ltima con 6 mL de
ter saturado con una solucin
acuosa de FeSO4 para eliminar el
DNFB que no reaccion,
posteriormente se coloc el tubo en
un bao Mara con el fin de evaporar
el ter que quedo de las extracciones,
una vez evaporado continuamos
centrifugando a 3000 rpm durante un
lapso de 10 minutos para sedimentar
la protena desnitrificada, y se pudiera
eliminar sobrenadante y junto con
este algunas impurezas de bajo peso
molecular. Todo esto se realiz en los
primeros dos pasos clave de ensayo
Figura 1. Cromatograma con sus respectivos que fueron la dinitrofenilacin del
Rf, del lado derecho encontramos nuestra aminocido N-terminal de la
muestra problema, seguida de DNP-Phe, hemoglobina y la eliminacin del
DNP-Ala, DNP-Val y DNFB del lado izquierdo. DNFB que no reaccion.
Una vez concluido lo anterior se
proseguimos a hidrolizar la protena,
utilizando 5 mL de HCl 6N y Sacamos de la cmara, marcamos el
calentando en autoclave durante 3 frente del solvente, dejamos secar,
horas a 15 libras por pulgada calculamos los Rf, comparamos y
cuadrada, estas condiciones son para obtuvimos resultados.
que nos asegurramos que todos los
enlaces peptdicos se rompieran Podemos observar en la Figura 1 que
liberando al derivado del aminocido la muestra problema tiene dos
terminal dinitrofenilado que deseamos manchas y que son dos sustancias
identificar, siguiendo el procedimiento con diferente polaridad por lo cual
recogimos el contenido del tubo en 5 una corri ms que otra, coincidiendo
mL de agua en vaso para formar una no de manera exacta pero muy
mezcla homognea de solucin de parecida con el DNFB y con el
aminocidos principalmente, una vez derivado de DNP-Val. No
realizada dicha disolucin procedimos coincidiendo con DNP-Ala ni con
a realizar 3 extracciones con 5 mL de DNP-Phe.
ter y una cuarta extraccin con 6
mL, ya que el DNFB y los derivados Existe otro mtodo de anlisis del
dinitrofenilados son prcticamente residuo N-terminal: la degradacin de
apolares el ter al ser un solvente Edman. Este mtodo consiste en que
apolar los separara del resto de un pptido reaccione con isocianato
aminocidos atrapados llevndose la de fenilo, para formar un derivado de
muestra deseada, y en la fase acuosa feniltiocarbamolo (PTC). Este
se quedaron los aminocidos derivado se trata con un cido en un
polares, una vez realizada dicha medio anhidro para romper el enlace
actividad evaporamos el ter en una de amida entre el aminocido N-
parrilla y disolvimos en alcohol terminal y el resto del pptido.
absoluto. Ninguno de los dems enlaces
Posteriormente utilizamos la peptdicos se rompe en este paso,
cromatografa como mtodo de porque la hidrlisis del enlace amida
identificacin, en la cual se utilizaron requiere agua. Cuando el derivado de
como referencia derivados PTC se trata con cido en medio
dinitrofenilados (DNP-Val, DNP-Ala, anhidro, el tomo de azufre de la
DNP-Phe), DNFB y muestra unidad C=S reacciona como
problema, de cada uno colocamos nuclefilo interno, y el nico enlace
cantidad suficiente para que pudiera amida que se rompe bajo estas
correr a lo largo del soporte. condiciones es el del aminocido N-
Colocamos el cromatograma en una terminal. El producto de esta ruptura,
cmara saturada con H2O durante 24 llamado tiazolona, es inestable bajo
horas esto debido a que la celulosa las condiciones de su formacin, y se
es un material poroso e irregular que rearregla para formar un
ocasiona que los solutos se puedan feniltiohidantona (PTH), que se asla
quedar atrapados entre estas y se identifica comparndola con
irregularidades, y as correr de muestras patrn de PTH derivadas de
manera correcta y con mayor aminocidos conocidos. Esto se hace
velocidad. Pasado ese lapso normalmente con mtodos
desarrollamos la cromatografa con cromatogrficos, aunque tambin se
solvente (cido ctrico-citrato) ha usado la espectrometra de
sustancia ligeramente apolar, por 5 masas.
horas aproximadamente.
Comparando el mtodo de Sanger Preguntas extra.
con el de Edman, creemos que es 1. Por qu no utilizamos NaOH en
mejor el segundo, ya que en l slo vez de NaHCO3? Porque el hidrxido
se rompe el enlace peptdico que hay de sodio es una base fuerte que
entre el aminocido N-terminal y el genera una solucin con un pH mayor
resto del pptido o protena, que al requerido adems de ser muy
queda intacta y puede aislarse para reactiva y se disocia fcilmente,
iniciar un segundo procedimiento rompiendo los enlaces disulfuro y
para determinar el nuevo aminocido puentes de hidrogeno coagulando la
N-terminal. Esto nos permite protena mientras que el bicarbonato
determinar la estructura primaria de es una sustancia que genera una
un pptido o protena que no sean ligera lcalis y no desnaturaliza a la
muy grandes, ya que entre ms protena por la disociacin parcial que
determinaciones se hacen, el presenta.
rendimiento va disminuyendo. Con el 2. Qu es un Rf? Es la relacin
mtodo de Sanger esto no es posible entre las distancias recorridas por el
ya que se rompen todos los enlaces soluto y por el eluyente desde el
peptdicos y los aminocidos quedan origen de la placa o bien conocidos
libres. Adems, en la actualidad el como frente del soluto y frente del
mtodo de Edman se ha eluyente, tiene un valor constante
automatizado e incorporado en un para cada compuesto en unas
dispositivo llamado secuenciador de condiciones cromatogrficas
Edman, que hace todas las determinadas (adsorbente,
operaciones por computadora, lo que disolvente, tamao de la cubeta,
lo hace mucho ms rpido. temperatura, etc.)
Conclusiones. Bibliografa.
El aminocido terminal de las
cadenas de hemoglobina es la Carey F. A. Qumica orgnica. Sexta
edicin. Editorial McGraw Hill.
Valina. Mxico, 2006. Pginas 1152-1554.
Por ms extracciones Chuz Bustus Eri (2015). El mtodo
realizadas no se puede de Sanger. 17 de agosto de 2017 de
obtener un derivado Club de ensayos. Sitio web
dinitrofenilado 100% puro. [Link]
EL-M%C3%89TODO-DE-SANGER-
Ya que el mtodo de Sanger 2845829.htm7
es un proceso que requiere de Facultad de Qumica. (2007).
mucho tiempo, ya no se realiza Tcnicas cromatogrficas.
porque existen mtodos Universidad Nacional Autnoma de
mucho ms eficaces, como Mxico 26 de Agosto de 2017. Sitio
web:
secuenciacin de material [Link]
gentico como RNA hivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf
mensajero. [Link]
hivero/4-Proteinas-Resumen-
Intersemestral-16-1_32160.pdf Sitio
web consultado el da 26 de Agosto
de 2017 a las 14:45 horas.
[Link]
ocumentos/practicas/actuales/guion-
[Link] Sitio web consultado el da 26
de Agosto de 2017 a las 14:53 horas.
