AO DEL BUEN SERVICIO AL CIUDADANO

UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL DE

LA AMAZONIA

FACULTAD INGENIERIA Y CIENCIAS

AMBIENTALES
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA
INDUSTRIAL

Tema:

ELECTROFORESIS

Curso : Qumica Analtica

Docente : GRIMALDO CORDOVA, Nery

Alumna : DEL CASTILLO TELLO, Celeste Ester

JIBAJA SEPULVEDA, Elizabeth Jimena

Ciclo : III

PUCALLPA PER

2017
 DEDICATORIA
Este trabajo quiero dedicarle a Dios por
darme la fuerza de seguir mi camino sin
distraccin alguna y regalarme cada
maravilloso da para cumplir cada una de mis
metas, y a las persona ms importantes de
nuestra vida, que est con nosotros en todo
momento, apoyndonos tanto
econmicamente como moralmente, por su
amor, comprensin y sacrificio, ellos son mis
padres, que jams dejaran de creer en m que
me dan siempre consejos para formarme
profesionalmente y llegar hacer una
profesional de xito, por sus cuidados en el
tiempo que hemos vivido juntos. Gracias por
confiar en m.

2
 INDICE
DEDICATORIA.....................................................................................................2

INDICE..................................................................................................................3

ELECTROFORESIS.............................................................................................6

1. DEFINICIN..................................................................................................6

1.1. Fundamento...........................................................................................6

2. TIPOS............................................................................................................7

2.1. Electroforesis de frente mvil o libre..................................................8

2.2. Electroforesis de zona..........................................................................8

2.2.1. Electroforesis en gel de poliacrilamida........................................9

2.2.2. Electroforesis en geles de gradientes..........................................9

2.2.3. Electroforesis en geles de agarosa............................................10

2.2.4. Electroforesis capilar...................................................................10

2.2.5. Isoelectroenfoque.........................................................................11

3. FUNCION....................................................................................................12

4. EQUIPOS....................................................................................................13

4.1. Cmara de electroforesis...................................................................13

4.2. Gel.........................................................................................................13

4.3. Geles de agarosa.................................................................................14

4.4. Geles de acrilamida.............................................................................15

4.5. Buffer de corrimiento..........................................................................17

4.6. Marcador de peso molecular..............................................................18

4.7. Buffer de carga....................................................................................18

4.8. Transiluminador ultravioleta..............................................................19

4.9. Electroforesis horizontal....................................................................19

4.10. Electroforesis vertical.....................................................................20

5. PROCEDIMIENTO GENERAL DE UNA ELECTROFORESIS..................20

5.1. Electroforesis de cidos nucleicos...................................................21

3
 5.1.1. Visualizacin de las muestras.....................................................23

5.2. Electroforesis de protenas................................................................24

5.2.1. Visualizacin de las muestras.....................................................26

6. UTILIDAD....................................................................................................27

CONCLUSIONES...............................................................................................28

REFERENCIA BIBLIOGRFICA.......................................................................29

ANEXOS.............................................................................................................30

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 INTRODUCCIN

En biologa molecular, una gran cantidad de tcnicas que se realizan

comnmente requiere el uso de la electroforesis, lo que supone una parte
importante del procedimiento sistemtico del anlisis (separacin, purificacin,
preparacin) de los cidos nucleicos y las protenas.

La mayora de las biomolculas poseen una carga elctrica cuya magnitud

depende del pH del medio en el que se encuentran; como consecuencia,
pueden desplazarse cuando se someten a un campo elctrico hacia el polo de
carga opuesta al de la molcula. A diferencia de las protenas, que pueden
tener una carga positiva o negativa, los cidos nucleicos slo poseen carga
negativa, debido a su esqueleto de fosfatos. Por lo tanto, en una electroforesis,
los cidos nucleicos migrarn hacia el polo positivo, es decir, el nodo. En el
caso de las protenas, que suelen ser de carga neutra, se realiza
pretratamiento con detergentes, como el dodecilsulfato de sodio (SDS), que les
confiere carga negativa; con ello se homogeneizan las protenas de la muestra
y todas migrarn hacia el polo positivo; slo se separarn por tamao.

El principio de la electroforesis consiste en la migracin proporcional de las

molculas a travs de un gel u otro tipo de matriz porosa, segn su peso
molecular o tamao; movimiento generado por el campo elctrico.

En el presente trabajo nos enfocamos en 5 aspectos, primero con una

definicin sobre el tema, luego los tipos de electroforesis, que funcin cumplen,
que equipos son necesarios para la electroforesis y por ultimo cual es la utilidad
de esta tcnica.

5
 ELECTROFORESIS
1. DEFINICIN
La electroforesis es un mtodo de laboratorio en el que se utiliza una
corriente elctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas
segn su tamao y carga elctrica a travs de una matriz gelatinosa.
Fue empleado por primera vez por en el ao 1937, pero su importancia vino
a incrementarse cuando en los aos cincuenta E. L. Durrum y Arne W.K.
Tiselius, impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asign a la
separacin de materiales en un campo elctrico en presencia de algn tipo
de soporte; aunque este trmino se limit originalmente al anlisis de
coloides y partculas submicroscopicas, se ha convertido en estos ltimos
aos en una metodologa aplicada a sustancias de bajo peso molecular.

1.1. Fundamento.
Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son
colocadas en un campo elctrico, estas experimentan una fuerza de
atraccin hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir
cierto tiempo las molculas cargadas positivamente se desplazaran
hacia el ctodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se
desplazaran hacia el nodo (el polo positivo).
El movimiento de las molculas est gobernado tambin por dos
fuerzas adicionales; inicialmente la friccin con el solvente dificultar
este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las
molculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento
browniano debido a que poseen energa cintica propia denominado
difusin. La energa cintica de las molculas aumenta con la
temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusin.

6
 La suma de todas estas fuerzas provoca que las molculas no migren
de una manera homognea, de tal manera que, si las molculas son
colocadas en un cierto lugar de solucin, los iones comenzaran a
moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento
de las molculas empleando un medio que oponga ms resistencia a
dicho movimiento. Una forma comn de hacer esto es formar un gel. El
gel consiste de un polmero soluble de muy alto peso molecular que
atrapa molculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento
de los solutos, consecuentemente, la migracin electrofortica de las
molculas ser ms lenta, pero el ensanchamiento del frente se ver
reducido tambin.

Es de destacar que a escala analtica, los mtodos electroforticos son

de alta sensibilidad, poder de resolucin y versatilidad, y sirven como
mtodo de separacin de mezclas complejas de cidos nucleicos,
protenas y otras biomolculas, donde aportan un potente criterio de
pureza. Se pueden conocer tambin mediante estas tcnicas, las
caractersticas cido-bsicas de las protenas presentes en un extracto
crudo, lo que da la informacin necesaria si se pretende realizar una
separacin cromatogrfica basada en diferencias de carga. Es til
adems para determinar otros parmetros como peso molecular, punto
isoelctrico y nmero de cadenas polipeptdicas de las protenas.

2. TIPOS
Existen principalmente dos mtodos electroforticos ampliamente utilizados:
la electroforesis convencional y la electroforesis capilar. La primera se lleva
a cabo sobre papel o sobre un gel, en los que se aplica la muestra
7
directamente. La disolucin tampn, que ser el medio conductivo, cubre la
capa de papel o de gel. Seguidamente se aplica el potencial de corriente
continua a travs de la placa. Cuando se considera que se han completado
las separaciones se interrumpe el paso de la corriente y, si es necesario, las
muestras se tien para visualizarlas.

2.1. Electroforesis de frente mvil o libre

Aquella en la cual las partculas se mueven de forma libre en el medio
en el que se encuentran dispersas.
Las sustancias a separar se introducen en un tubo en forma de U,
disueltas en un tampn de pH y fuerza inica adecuados. Se colocan
los electrodos en sendos brazos del dispositivo, entre los que se crea
un campo elctrico, provocando que las molculas de la muestra (por
ejemplo: protenas) cargadas emigren hacia los electrodos de polaridad
opuesta.

2.2. Electroforesis de zona

Son los ms comunes, dada su alta aplicabilidad en diferentes campos.
Son tiles para lograr la separacin de mezclas complejas. Se aplican
pequeas cantidades de la disolucin de protenas a un soporte slido,
que se impregna con una solucin tampn. Los soportes son en general
polmeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las
molculas a travs del medio durante la electroforesis y disminuyen los
flujos de conveccin del solvente.
Como soporte han sido utilizados papel (celulosa), almidn,
poliacrilamida, agarosa y acetato de celulosa, entre otros. Este mtodo
tiene gran poder resolutivo por que se aplica una cantidad pequea de
protena a una zona estrecha, mientras que la longitud del trayecto es
mucho mayor que la zona de aplicacin. El equipamiento requerido es
simple, fuente de poder, cubeta vertical u horizontal donde se colocan el
soporte y dos electrodos.
La disolucin a tratar se aplica como una mancha, o como una banda, y
las partculas migran a travs de un disolvente, utilizando adems un
medio soporte inerte y homogneo, tal como el papel o ciertos tipos de
geles. Esta tcnica es utilizada para analizar mezclas, para determinar

8
la pureza de una muestra, para detectar cambios de movilidad o de
conformacin de sustancias.

2.2.1. Electroforesis en gel de poliacrilamida.

Los geles de poliacrilamida se forman por polimerizacin de la
acrilamida por accin de un agente entrecuzador, es
qumicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser
preparado de forma rpida y reproducible. Forma, adems, geles
transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en agua,
relativamente no inicos y que permiten buena visualizacin de
las bandas durante un tiempo prolongado. Adems tiene la
ventaja de que variando la concentracin de polmeros, se puede
modificar de manera controlada en el tamao del poro,
lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico
debido a su neurotoxocidad.

2.2.2. Electroforesis en geles de gradientes.

El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente
creciente de concentracin de archilamida + bisacrilamida, y en
consecuencia un gradiente decreciente en el tamao del poro,
pueden tener ventajas sobre los geles de concentraciones
uniformes de acrilamida. En un gel en gradiente la protena migra
hasta alcanzar una zona donde el tamao de poro impida

9
 cualquier avance. Una vez se alcanza el limite del poro no se
produce una migracin apreciable aunque no se detiene
completamente. Una de las ventajas de este tipo de geles es que
resuelve mejor las bandas pues las concentra en regiones ms
estrechas, adems de incrementar el rango de pesos moleculares
que se pueden resolver en un mismo gel comparado con los de
una concentracin fija.

2.2.3. Electroforesis en geles de agarosa.

La agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas,
como el agar-agar, pero de composicin homognea), cuyas
disoluciones (tpicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de
permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel,
semislido al enfriarse. Este gel est constituido por una matriz o
trama tridimensional de fibras polimricas embebida en gran
cantidad de medio lquido, que retarda el paso de las molculas,
se usa usualmente para separar molculas grandes de alrededor
20.000 nucletidos.

2.2.4. Electroforesis capilar.

La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las
tcnicas electroforeticas convencionales, pero utiliza condiciones
y tecnologa distinta que nos permiten obtener una serie de
ventajas al respecto, Esta separacin de pptidos realizada sobre

10
 un capilar de silica fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en
un campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por aire.
La corriente electroendosmtica (FEO) generada por los grupos
silanol de la superficie interna del capilar da como resultado una
corriente plana del frente del lquido que contrasta con el frente
parablico de la cromatografa lquida de alta resolucin.
La ventaja de esta tcnica es que el capilar de silica fundida que
generalmente se cubre con una capa de polimina para darle
mayor rigidez y resistencia, tiene una ventaja a travs de ella que
permite el pasaje de la luz UV de tal manera que la visualizacin
es on-line. Con esta tcnica descripta es posible separar cationes,
aniones, protenas, macromolculas y sustancias no cargadas en
forma simultnea.

2.2.5. Isoelectroenfoque.
Esta tcnica, habitualmente denominada electroenfoque se basa
en el desplazamiento de las molculas en un gradiente de pH. Las

11
 molculas amfotricas, como los aminocidos, se separan en un
medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente
de pH. La regin del nodo es cida y la del ctodo es alcalina.
Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las
molculas que se han de separar tenga su punto isoelctrico
dentro del rango. Las sustancias que inicialmente se encuentran
en regiones de pH inferior a su punto isoelctrico estarn
cargadas positivamente y migraran hacia el ctodo, mientras
aquellas que se encuentran en medios con pH ms bajos que su
punto isoelctrico tendrn carga negativa y migraran hacia el
nodo.
La migracin les conducir a una regin dnde el pH coincidir
con su punto isolctrico, tendrn una carga neta nula y se
detendrn. De esta forma las molculas amfotricas se sitan en
estrechas bandas donde coincide su punto isoelctrico con el pH.

3. FUNCION
La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas segn la
movilidad de stas en un campo elctrico. La separacin puede realizarse
sobre la superficie hidratada de un soporte slido (p. ej., electroforesis en
papel o en acetato de celulosa), a travs de una matriz porosa
(electroforesis en gel), o bien en disolucin (electroforesis libre).

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 Dependiendo de la tcnica que se use, la separacin obedece en distinta
medida a la carga elctrica de las molculas y a su masa.

La electroforesis se usa en una gran mayora en la materia del ADN

recombinante ya que nos permite saber la carga que poseen los
polipptidos, y separar los diferentes polipeptidos resultantes de las
variaciones del experimento del ADN recombinante. La variante de uso ms
comn para el anlisis de mezclas de protenas o de cidos nucleicos utiliza
como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los
cidos nucleicos ya disponen de una carga elctrica negativa, que los
dirigir al polo positivo, mientras que las protenas se cargan al unirse con
sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de
una manera dependiente de la masa molecular de la protena. Al poner la
mezcla de molculas y aplicar un campo elctrico, stas se movern y
debern ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras
cruzadas), por lo que las pequeas se movern mejor, ms rpidamente.
As, las ms pequeas avanzarn ms y las ms grandes quedarn cerca
del lugar de partida.

4. EQUIPOS
4.1. Cmara de electroforesis
La cmara de electroforesis es un dispositivo que permite la generacin
de un campo elctrico alrededor de un gel en el que se depositan las
muestras. Este campo se genera dentro de una solucin amortiguadora
en la que se encuentra sumergido el gel que contiene las muestras; el
alto contenido de electrolitos permite la transmisin de la corriente
elctrica, manteniendo el pH estable al paso de la corriente. La cmara
cuenta con dos polos que se conectan a una fuente de energa. En las
cmaras de electroforesis vertical el polo positivo se encuentra en la
parte inferior de la cmara y en las horizontales, en uno de los
extremos. En ambos tipos de cmaras el polo positivo se identifica con
color rojo y el negativo con negro.

4.2. Gel

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 La muestra debe colocarse sobre un medio de soporte, con la finalidad
de evitar perturbaciones mecnicas durante la separacin. El soporte
idneo es un gel semislido o gelatinoso, compuesto por polmeros que
forman una especie de malla o microporos tridimensionales a travs de
los cuales las molculas avanzan, segn el peso molecular, lo que
permite la separacin por tamao de los diferentes componentes de la
muestra. Los geles pueden ser de agarosa o poliacrilamida. Para la
separacin de cidos nucleicos se usan geles de agarosa o acrilamida y
para protenas, slo de acrilamida.

4.3. Geles de agarosa

La agarosa es un polisacrido extrado de algas marinas que tiene la
propiedad de mantenerse en estado slido a temperatura ambiente, que
se disuelve con facilidad en temperatura de 50 a 60C, se torna lquida
y se solidifica cuando se enfra formando un gel altamente poroso. El
gel de agarosa es la manera ms efectiva de separar fragmentos de
cido desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid) que van de 100
pb a 25 kb. Para elaborar el gel se pesa la cantidad de agarosa
requerida, se disuelve en una solucin amortiguadora adecuada de la
misma composicin y concentracin que el buffer de corrimiento y se
calienta hasta formar una solucin. Sin dejar enfriar, se vaca de forma
inmediata sobre un molde de forma rectangular y en uno de los
extremos se coloca un aditamento en forma de peine con la finalidad de
generar los pocillos u orificios en los que se colocarn las muestras. La
agarosa posee ventajas sobre la acrilamida, ya que no es un
compuesto txico y permite realizar el anlisis de cidos nucleicos con
pesos moleculares variados, segn la concentracin de agarosa que se
emplee. Sin embargo, su poder de resolucin es menor que el de los
geles de poliacrilamida. La concentracin de agarosa se escoge segn
el tamao del cido nucleico que se vaya a analizar. El tamao de los
poros de la matriz del gel depende de la concentracin de agarosa
utilizada y la concentracin de agarosa es inversamente proporcional al
tamao del poro obtenido; esto nucleicos de peso elevado tardan ms
tiempo en atravesar los poros de agarosa. En el caso de cidos

14
 nucleicos no linearizados, como plsmidos circulares (conformacin
nativa), cido ribonucleico (RNA, ribonucleic acid) con estructuras
secundarias o DNA de gran longitud, la migracin no slo depende del
peso molecular, sino tambin del grado de empaquetamiento que
presenten. En la electroforesis de un plsmido, por ejemplo, se
visualizan tres conformaciones distintas de la misma molcula: la forma
superenrrollada, la semirrelajada y una relajada. Esto se refleja en tres
bandas de tamao diferente, aunque se trate del mismo plsmido. Por
ello, antes de una electroforesis es importante la linearizacin y la
eliminacin de estructuras secundarias por desnaturalizacin de la
muestra. La concentracin de agarosa ms utilizada para electroforesis
de cidos nucleicos es de 0.5 a dos por ciento es, a mayor
concentracin, menor tamao de los poros, y viceversa, si los poros son
pequeos la migracin del cido nucleico es ms lenta.
Por ello, antes de una electroforesis es importante la linearizacin y la
eliminacin de estructuras secundarias por desnaturalizacin de la
muestra. La concentracin de agarosa ms utilizada para electroforesis
de cidos nucleicos es de 0.5 a dos por ciento feles con un amplio
intervalo de tamaos de poro. El gel de poliacrilamida es el resultado de
la polimerizacin qumica de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida.
El tamao del poro de un gel de acrilamida est determinado por la
concentracin total de acrilamida presente (acrilamida + bisacrilamida),
que generalmente se maneja en proporcin.

4.4. Geles de acrilamida

La acrilamida es un polmero sinttico, termoestable, incoloro y
qumicamente inerte, con el que se pueden generar geles con un amplio
intervalo de tamaos de poro. El gel de poliacrilamida es el resultado de
la polimerizacin qumica de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida.
El tamao del poro de un gel de acrilamida est determinado por la
concentracin total de acrilamida presente (acrilamida + bisacrilamida),
que generalmente se maneja en proporcin de 19:1. Regulando la
concentracin de ambas y su proporcin se consiguen distintas
porosidades, siempre menores que la de los geles de agarosa. Cuando

15
 la acrilamida se encuentra en disolucin acuosa experimenta
autopolimerizacin de forma espontnea y lenta, con el resultado de
que las molculas de acrilamida se unen cabeza con cola.
En presencia de un sistema generador de radicales libres se da una
polimerizacin vinlica en la cual se activan los monmeros de
acrilamida, quedan en estado de radical libre y reaccionan rpidamente
para formar polmeros de cadena larga. El polmero en disolucin no
forma un gel, sino que se encuentra en estado viscoso debido a que las
cadenas pueden deslizarse unas sobre otras; la formacin del gel
requiere que varias cadenas queden trabadas (lo que se consigue con
la bisacrilamida). La acrilamida es una neurotoxina, por lo que debe
manejarse con precaucin.

En la imagen se aprecian los elementos que se requieren para el corrimiento

electrofortico y visualizacin del gel.

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 Cmaras de electroforesis. A) En las cmaras de electroforesis vertical
el corrimiento de la muestra sigue la gravedad, ya que el polo positivo
se encuentra en la parte inferior de cmara. B) En la electroforesis
horizontal debe cuidarse que el nodo se coloque hacia el extremo del
gel donde corren las muestras, de lo contrario las muestras se saldrn
del gel.

4.5. Buffer de corrimiento

El buffer de corrimiento es de la misma composicin y pH que el buffer
con el que se prepara el gel de resolucin, ya sea de agarosa o de
acrilamida. ste proporciona el medio para la transmisin de la corriente
elctrica y mantiene el pH sin variaciones mientras se realiza el
corrimiento. En el caso de los cidos nucleicos, pueden emplearse TBE
o TAE como buffer de corrimiento. El buffer TBE contiene Tris base,
cido brico y EDTA, y se maneja a un pH de 7.2. El buffer TAE
contiene Tris base, cido actico y EDTA, ajustado a pH 8.5. El buffer

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 de corrimiento de electroforesis de protenas lleva Tris, 25 mM, SDS al
1% y glicina, 192 mM, a un pH 8.3.

4.6. Marcador de peso molecular

Los marcadores de peso molecular son una mezcla de molculas de
DNA o de protenas de tamao conocido que permiten determinar por
comparacin el tamao de las molculas (cidos nucleicos o protenas)
contenidos en las muestras sometidas a electroforesis. Los marcadores
de peso molecular estn disponibles comercialmente en una amplia
variedad. En el caso de marcadores de peso molecular de cidos
nucleicos, stos pueden ser bacterifagos o plsmidos sometidos a
corte con enzimas de restriccin que generan fragmentos de diversos
tamaos; tambin puede tratarse de molculas de DNA sintticas
denominadas escaleras, porque contienen fragmentos con incrementos
de tamao gradual. Los marcadores de peso molecular de protenas
suelen ser una serie de protenas de peso molecular conocido (que van
desde 10 hasta 300 kDa), las cuales pueden estar teidas o coloreadas.
En los casos en que la electroforesis sea un paso previo para la tcnica
de Western blot, tambin se dispone de marcadores de peso molecular
de protenas recombinantes que contienen un sitio de unin a
inmunoglobulina (Ig) G. El sitio de unin a IgG puede ser reconocido por
un anticuerpo primario o secundario empleado para la deteccin de la
protena buscada por Western blot. Este sistema es compatible con
quimioluminiscencia, el marcaje cromognico y la fluorescencia.

4.7. Buffer de carga

Este amortiguador tiene como fin brindar peso, densidad y color a la
muestra, lo que facilita su depsito en el pocillo y evita su salida del gel;
permite, adems, monitorear el corrimiento de la muestra en el gel. Se
emplea en relacin 1:3 para cidos nucleicos o 1:6 para protenas,
respecto a la cantidad de muestra. El buffer de carga de cidos
nucleicos contiene Tris, azul de bromofenol, azul de xileno y glicerol.
Mientras que el buffer de carga para protenas contiene Tris-HCl, pH
6.8, ditiotritiol (DTT), SDS, glicerol y azul de bromofenol. En el caso de

18
 que se deseen condiciones reductoras y desnaturalizantes, deber
aadirse betamercaptoetanol a este buffer y habr que calentar las
muestras a 95C por cinco minutos.

4.8. Transiluminador ultravioleta

El transiluminador es un aparato que transmite luz del espectro
ultravioleta a travs de la muestra, lo cual excita la molcula
cromognica que emite energa fluorescente y permite visualizarla. El
transiluminador es el sistema empleado con ms frecuencia por ser
simple y efectivo. En general emiten energa a una longitud de onda a
302 nm, aunque tambin existen para 254 y 365 nm; suelen contar con
un botn para baja/alta intensidades por si se requiere una menor
exposicin de la muestra a la luz ultravioleta.
Algunos tambin permiten la seleccin de entre dos longitudes de onda,
lo que los hace ms flexibles. Los epitransiluminadores (365, 480 nm)
generan la emisin visible por fluorescencia igual que el transiluminador
pero, a diferencia de ste, la fuente de energa se encuentra reflejada y
no pasa a travs de la muestra. El epiiluminador es efectivo en geles
muy densos.
Una vez que se tienen los materiales necesarios existen dos maneras
de realizar la electroforesis: de forma horizontal y vertical.

4.9. Electroforesis horizontal

Se lleva a cabo con gel de agarosa para cidos nucleicos.
Para el corrimiento el buffer debe cubrir el gel, con la finalidad de evitar
que se seque por el calentamiento inducido por el paso de la corriente
elctrica. Al momento de cargar las muestras en los pocillos, se puede
optar por hacerlo en seco; esto es, llenar parcialmente la cmara con
lquido de corrimiento de tal manera que la parte superior del gel no se
cubra de buffer para que los pocillos puedan llenarse sin la interferencia
del lquido. Una vez cargada la muestra, se corre por unos minutos a
bajo voltaje hasta que la muestra entre en el gel y entonces se cubre
del todo con el buffer de corrimiento. Tambin existe la tcnica
denominada electroforesis submarina, en la que la totalidad del gel se

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 cubre con buffer de corrimiento, desde el momento de cargar las
muestras en los pocillos. En esta tcnica el buffer siempre debe cubrir el
gel, y se llama submarina porque la muestra se coloca con el gel
sumergido en el buffer.

4.10. Electroforesis vertical

Empleada de forma exclusiva con gel de poliacrilamida, se utiliza para
protenas o cidos nucleicos de pequeo tamao.
El gel debe estar contenido entre dos placas rectangulares de vidrio
donde la corriente elctrica se genera gracias al buffer en el que se
encuentra embebido el gel y llena las cubetas o compartimientos del
nodo y el ctodo.

5. PROCEDIMIENTO GENERAL DE UNA ELECTROFORESIS

A continuacin se exponen los pasos de los que consta una electroforesis
tpica.

La muestra se coloca despus de haber vertido el buffer de corrimiento y

retirado el peone que sirve de molde para la formacin de los pocillos.

a) Preparar un gel de agarosa o acrilamida a la concentracin requerida.

b) Mezclar las muestras a analizar con un buffer de carga adecuado.
c) Cargar las muestras en el gel.
d) Realizar la corrida electrofortica al voltaje pertinente.
e) Visualizar los cidos nucleicos o las protenas.

5.1. Electroforesis de cidos nucleicos

20
El mtodo ms comn para la electroforesis de DNA es elaborar un gel
horizontal de agarosa, con una concentracin de 0.5 a 2%. La carga
elctrica de la molcula de DNA la otorgan sus grupos fosfato, de carga
negativa, y cuyo nmero es igual al doble del nmero de pares de
bases. Dado que la forma de la molcula de DNA siempre es la misma,
la movilidad de la electroforesis depender nicamente de la longitud
del DNA (pb) y se representar en bandas. El corrimiento se realiza a
voltajes de entre 25 y 100 V; a mayor voltaje mayor velocidad de
corrimiento.
El avance electrofortico se monitorea a travs de la visualizacin de
los colorantes (azul de bromofenol y azul de xileno) contenidos en el
buffer de carga con el que se mezcl la muestra previa a su colocacin
en el pocillo. Si los fragmentos de DNA son pequeos (menos de 50 pb)
o bien se requiere discernir entre fragmentos de cidos nucleicos con
una diferencia de longitud de 1 a 20 pb, se recomienda utilizar un gel de
poliacrilamida que permita esta resolucin.
Las agarosas con un punto de fusin bajo permiten la preparacin de
geles a elevadas concentraciones y se aconseja para obtener una
buena separacin de molculas de
DNA con < 1 000 pb. Son ideales para preparar geles analticos de
productos procedentes de tcnicas de reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) u otras. Algunas son
capaces de separar fragmentos que difieren entre 10 y 20 pb. Para la
preparacin del gel debe estandarizarse primero qu concentracin de
agarosa es la ms adecuada, segn la muestra que se desee separar.
El volumen de agarosa depende del tamao de la cmara de
electroforesis; 20 a 25 ml son suficientes para las dimensiones ms
comunes del gel: 8 6 0.5 cm (L A A). Inmediatamente despus
de vaciar la agarosa a la cmara, debe insertarse el o los peines
necesarios. La agarosa tarda en solidificar alrededor de 20 min,
mientras que la poliacrilamida, unos 30 min. Una vez solidificado el gel,
se aade el buffer de corrimiento (TAE o TBE) a concentracin 1X,
cubriendo perfectamente el gel (0.5 a 1 cm por encima del gel) y se
retiran los peines. Las muestras se mezclan con el buffer de carga y se

21
depositan de forma cuidadosa en los pocillos, con lo que se evita que
se salgan y puedan contaminar el pocillo contiguo. Debe considerarse
el uso de un marcador de peso molecular en, por lo menos, uno de los
carriles, para la determinacin del peso molecular de la muestra. Este
marcador tambin debe mezclarse con un buffer de carga, excepto
cuando ya viene preparado para su uso de la casa comercial en que se
obtuvo.
Una vez depositadas las muestras en los pocillos, se procede a la
transmisin de la corriente elctrica. Se conectan los cables de la fuente
de energa de cada polo elctrico a la cmara de electroforesis en el
electrodo que le corresponda y se aplica un voltaje de acuerdo con el
peso molecular de las molculas de DNA que se va a separar.
Para el caso de productos de PCR (entre 100 pb y 1.5 kb) se
recomienda usar voltajes comprendidos entre 75 y 100 V. Para
muestras de DNA genmico y plasmdico (> 2 kb) se recomienda aplicar
valores de entre 25 y 75 V.
Es importante que se estandarice el tiempo de electroforesis a fin de
conseguir la mejor resolucin posible.

En esta cmara se aprecia como el gel de acrilamida ha quedado

embebido en el buffer de corrimiento en su extremo superior gracias a la
colocacin de amortiguador en la parte interna de la cmara. El buffer de
la parte externa permite que el polo positivo cuente con la misma
solucin buffer que trasmita la corriente a la parte inferior del gel.
Durante el corrimiento se monitorea la migracin de la muestra con
colores que contiene el buffer de carga, en que se observa el color azul y
el verde correspondientes a los colorantes azul de bromofenol y azul de
xileno, de forma respectiva. En geles de agarosa, dentro del rango de

22
0.5 y 1.5%, el azul de xileno migra de manera similar a un fragmento de
DNA de 4 kb, mientras que el azul de bromofenol se comporta como un
fragmento de 300 pb.
La electroforesis se detiene cuando se considera que la muestra se
localiza en la posicin deseada, o bien cuando la muestra ha corrido por
lo menos tres cuartas partes del gel.
Hay mltiples factores que pueden afectar la migracin del DNA, como la
concentracin del gel utilizado, el tamao de la molcula de DNA
muestra, el empaquetamiento del DNA, el voltaje, la temperatura del
buffer de corrimiento (que puede aumentar demasiado si el voltaje es
muy alto), la contaminacin con agentes intercalantes en la muestra, la
composicin del buffer de corrimiento, etctera.

5.1.1. Visualizacin de las muestras

Para la visualizacin de los cidos nucleicos se utiliza un
colorante fluorescente, el bromuro de etidio, que tiene la
propiedad de intercalarse entre las bases nitrogenadas del DNA y
el RNA. Debido a esta propiedad es un agente mutagnico y debe
manipularse con cuidado. El bromuro de etidio, por lo general, se
incorpora a la agarosa (0.5 mg/ ml) antes de permitir la
solidificacin, o puede incorporarse luego del corrimiento,
incubando el gel en una solucin que lo contenga a 0.5 mg/ml. El
bromuro de etidio emite fluorescencia de color naranja cuando se
expone a la luz ultravioleta con longitud de absorcin de 254 nm,
y longitud de emisin de 366 nm. La seal fluorescente es
proporcional a la cantidad de producto- Su sensibilidad permite
detectar cerca de 30 pg de cido nucleico por banda (segn el
grosor del gel). El bromuro de etidio es teratognico, mutagnico y
cancergeno, por lo que para este procedimiento se recomienda el
uso de guantes. En la actualidad, el bromuro de etidio se ha
sustituido por un compuesto comercial, SYBR Safe, que se une
de manera no covalente a los cidos nucleicos.
Este colorante tiene una fluorescencia a 280, una excitacin
mxima a 502 nm y una emisin mxima a 530 nm.

23
 Con este colorante, el DNA puede visualizarse con una luz
ultravioleta en el rango de 470 a 530 nm. Por otro lado, el
colorante de cianina asimtrico el SYBR-Green es un fluorforo
que se une con gran afinidad al surco menor del DNA bicatenario,
y es unas 25 veces ms fluorescente que el bromuro de etidio.
Este colorante con epiiluminacin de 254 nm puede detectar 60
pg de dsDNA/banda; 1 a 2 ng de oligonucletidos, y 100 a 300 pg
de RNA o ssDNA/banda. Para los geles de acrilamida una
alternativa al bromuro de etidio es el nitrato de plata; sin embargo,
ste utiliza reactivos peligrosos, como el formaldehdo. Por otro
lado, la tincin con plata es ms sensible que el bromuro de etidio,
ms barata a largo plazo y menos txica.

5.2. Electroforesis de protenas

El mtodo ms empleado para electroforesis de protenas se lleva a
cabo en un sistema discontinuo; es decir, un gel conformado por dos
geles de poliacrilamida (uno de resolucin y otro de compactamiento),
que difieren en su concentracin, composicin y pH. Los geles estn
unidos pero limitados por una fase de separacin visible a contra luz;
para lograrlo, deben prepararse por separado, esperando la
polimerizacin total del primero, para continuar con la del segundo; de
lo contrario, en estado lquido, se mezclaran.
Para el caso de los geles de acrilamida para cidos nucleicos slo se
tiene una fase, conformada por el gel de resolucin, en el que las
molculas de DNA migrarn, generando un patrn electrofortico,
segn su tamao.
Para electroforesis de protenas, la acrilamida se prepara a partir de
una solucin al 30% de acrilamida-bisacrilamida 19:1. sta se mezcla
con el buffer correspondiente y una solucin de SDS; adems, se
aade persulfato de amonio (APS) y N,N,N,N-tetrametiletilenodiamina
(TEMED) como polimerizadores en concentraciones del orden de 1 a 10
mM. El APS genera radicales libres, por lo que es un iniciador de la
reaccin de polimerizacin que al final forma el gel. El TEMED funciona
como otro iniciador de polimerizacin.

24
Las propiedades del gel resultante dependen de la concentracin de
APS y TEMED, ya que un aumento en su concentracin disminuye la
longitud media de la cadena de polmero y, por lo tanto, disminuye su
elasticidad y le resta transparencia al gel. Por ello, debe utilizarse la
menor concentracin posible de catalizadores que permita la
polimerizacin en un tiempo ptimo.
El gel de acrilamida se forma entre dos vidrios, y el sistema completo se
sumerge en el buffer de corrimiento dentro de la cmara vertical de
electroforesis. En el momento de sumergir los geles en el tanque, se
debe asegurar que los pocillos del gel estn totalmente cubiertos por el
buffer. Es comn en los geles de acrilamida realizar un precorrimiento
de unos 10 a 30 min a voltajes bajos, con el cual se asegura que los
pocillos se limpien antes de cargar las muestras.
Para la preparacin de la muestra de protena se realiza una reaccin
fisicoqumica, en la que se rompen enlaces peptdicos y puentes
disulfuro por accin de detergentes inicos (SDS), reactivos reductores
(betamercaptoetanol) y temperaturas elevadas (95C), que al final
consigue desnaturalizar la protena hasta su estructura primaria. La
muestra mezclada con el buffer de carga se deposita con cuidado en
los pocillos, evitando la contaminacin del pocillo contiguo. Hay que
considerar el uso de un marcador estndar de protenas para la
medicin del peso molecular de la muestra, que debe someterse a los
mismos tratamientos que la protena.
Una vez colocadas las muestras de protenas en cada pocillo del gel, se
conectan los cables correspondientes de los electrodos a la fuente de
energa, con la seleccin de voltaje o amperaje adecuados. Para el
clculo del voltaje es importante conocer la distancia en centmetros del
gel desde la parte superior hasta la parte inferior. La distancia
multiplicada por 8-15 V permitir determinar el voltaje del corrimiento. El
voltaje ptimo depender de la molcula que se piensa separar; en
consecuencia, se recomienda estandarizar este procedimiento. El valor
del amperaje o corriente elctrica (medida en amperios o miliamperios)
depender de la fuerza inica del buffer. En el caso de trabajar con
buffer Tris-SDS-glicina, el valor recomendado es de 25 a 30 mA. La

25
electroforesis se realiza hasta que el colorante, visualizado como una
lnea azul, haya llegado a los lmites de la parte inferior del gel.

5.2.1. Visualizacin de las muestras

Si se requiere, el gel se sumerge en un recipiente que contiene el
colorante azul brillante de Coomassie y se incuba por unos
minutos; esto permitir la visualizacin de las bandas de
protenas. El proceso de coloracin se basa en la atraccin
electrosttica del enlace peptdico de las protenas sobre grupos
de cido sulfnico, que tien la protena de color azul. Asimismo,
las fuerzas de van der Waals y las interacciones hidrofbicas
participan en este proceso de unin mecnica. La tincin de
Coomassie Blue clsica, por lo general puede detectar bandas de
protena de 50 ng mientras que la tincin con plata incrementa
este lmite de sensibilidad unas 50 veces. La tincin con plata
consiste en desarrollar el color en el gel por incubacin en
soluciones de metano al 140%: cido actico al 10%, luego
metanol al 40%, seguido de agua y posteriormente tiosulfato de
sodio al 0.01%. Despus de este proceso, se lava y se procede a
la incubacin en fro (4C) en cloruro de plata al 0.1%;
posteriormente, se lava e incuba con carbonato de sodio al 2% en
formalina al 0.04% (llamada tambin formol al 35%), que acta
como revelador. Por ltimo, se incuba con soluciones de cido
actico antes de fotografiar o escanear.
Muchas variables pueden influir en la intensidad del color y todas
las protenas tienen caractersticas distintas de tincin.
Algunas veces, el gel se seca para conservarlo. Para ello, primero
se deshidrata en glicerol-metanol y, posteriormente, se coloca en
una lmina de celofn hidroflico y no plastificado que cubra
totalmente el gel. Se cubre el gel con un segundo celofn
previamente remojado en agua y se sella con calor. Aqu se deja
secar en condiciones ambientales por aproximadamente dos das
o se acelera el proceso con el uso de desecadores de geles.

26
 Algunas protenas pueden migrar de forma irregular y aparecer
con un peso molecular mayor que el esperado; esto puede
deberse a que presentan modificaciones postraduccionales en su
estructura, como residuos de glucosilacin, fosforilacin y
acetilacin, que podran retardar la migracin de las muestras.
Asimismo, si existe desnaturalizacin de las protenas, se
considera que la protena est degradada y suelen aparecer
manchas difusas en todo el carril.

6. UTILIDAD
Algunos de los usos de la electroforesis para cidos nucleicos en geles de
agarosa son determinar los tamaos moleculares de los cidos nucleicos,
analizar los fragmentos cortados con enzimas de restriccin (mapa de
restriccin), comparar los tamaos de distintos tipos de DNA, aislar y
recuperar fragmentos de DNA purificados para clonaciones moleculares, y
analizar productos de PCR, entre otros.
Asimismo, la electroforesis puede ser un proceso previo a las tcnicas de
hibridacin, como el Southern blot (DNA) o el Northern blot (RNA), en que la
presencia de determinada secuencia del cido nucleico en una mezcla de
molculas se distingue por su tamao, la cual se confirma por hibridacin
con una sonda especfica. En el caso de las protenas, la electroforesis se
aplica para la identificacin de fracciones proteicas o protenas particulares
por tamao, como es el caso de la electroforesis de globulinas, o protenas
sricas; pero, sobre todo, para la identificacin de molculas particulares
empleando despus una reaccin antgeno-anticuerpo especfica en la
tcnica de Western blot. Asimismo, la electroforesis es crucial en tcnicas
como la secuenciacin, en que, tras un corrimiento electrofortico de las
cuatro reacciones de elongacin con los dideoxinucletidos, se puede
deducir la secuencia del segmento de cido nucleico. Incluso, los
secuenciadores automticos modernos emplean una electroforesis capilar
para el discernimiento de la secuencia.
Tambin, los termocicladores en tiempo real basan la deteccin de los
fragmentos amplificados en una electroforesis capilar, en que es posible la

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deteccin inmediata de los segmentos amplificados y su lectura por el lser
correspondiente al flurocromo con que el producto est marcado.

CONCLUSIONES

La electroforesis es una tcnica de separacin que puede ser utilizada

con fines analticos y que fue introducida por el qumico sueco Arne
Tiselius. El inters principal de este investigador fue la qumica de las
protenas sricas. Por su trabajo pionero en este campo, Tiselius recibi
el Premio Nobel en 1948.
Los mtodos electroforticos son de alta sensibilidad, eficacia, poder de
resolucin y versatilidad.
Mtodo de separacin de:
o Protenas
o cidos nucleicos
o Otras biomolculas
Permite determinar:
o Peso molecular de una protena
o Punto isoelctrico
o Distinguir molculas por su carga neta o su forma

La electroforesis es la migracin de solutos inicos bajo la influencia de

un campo elctrico; estas partculas migran hacia el ctodo o nodo
(electrodos - y +), en dependencia de una combinacin de su carga,
peso molecular y estructura tridimensional.
Es de destacar que a escala analtica, los mtodos electroforticos son
de alta sensibilidad, poder de resolucin y versatilidad, y sirven como
mtodo de separacin de mezclas complejas de cidos nucleicos,
protenas y otras biomolculas, donde aportan un potente criterio de
pureza. Se pueden conocer tambin mediante estas tcnicas, las
caractersticas cido-bsicas de las protenas presentes en un extracto
crudo, lo que da la informacin necesaria si se pretende realizar una
separacin cromatogrfica basada en diferencias de carga. Es til
adems para determinar otros parmetros como peso molecular, punto
isoelctrico y nmero de cadenas polipeptdicas de las protenas.

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 REFERENCIA BIBLIOGRFICA

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ANEXOS

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