Electroforesis
La electroforesis est basada en la movilidad de las molculas cuando se encuentran bajo el efecto de un
campo elctrico. Puede llevarse en solucin, en superficie hidratada de un soporte slido (papel o acetato de
celulosa), o en una matriz porosa (gel de poliacrilamida o agarosa) la cual acta como un tamiz molecular.
Sobre las molculas actan dos fuerzas opuestas; la fuerza elctrica que resulta de la aplicacin de una
diferencia de potencial entre el nodo y el ctodo, y una fuerza de rozamiento que se opone al
desplazamiento. La velocidad de las molculas se vuelve constante cuando la suma de las fuerzas que actan
sobre ellas es cero. Por lo tanto:
A su vez: = , donde q es la carga de la molcula y E la intensidad del campo elctrico aplicado.
Si se asume que la partcula es esfrica, se obtiene que: = 6 , donde es el radio de la
esfera y la viscosidad del fluido.
Por lo tanto se puede reordenar y obtener el valor de la velocidad de desplazamiento: =
La movilidad electrofortica () es una magnitud caracterstica de la partcula o molcula que refleja la
velocidad relativa a la fuerza del campo. Esto es: =
A partir de la ecuacin de velocidad se obtiene que: =
Se puede observar que la movilidad electrofortica depende de la carga y del tamao de la partcula.
Electroforesis de protenas
Electroforesis nativa
Se puede realizar debido a que las protenas poseen carga neta
excepto en su punto isoelctrico. La concentracin de acrilamida
ptima para separar una mezcla de protenas va a depender de
sus cargas y tamaos.
Grfico de Ferguson Se grafica el logaritmo de Rf en funcin del
porcentaje de acrilamida del gel. El Rf o relacin de frente, es la
relacin entre el camino recorrido por la molcula de inters y el
frente de solvente o de un soluto normalmente coloreado de muy
bajo peso molecular.
= %
El valor de la pendiente, Kr se denomina coeficiente de retardo, y se relaciona con el tamao molecular; es
por esto que se observa que la protena A y C de la imagen tienen similar peso molecular (similar pendiente).
Por otro lado, el valor log Rf0 es el valor de la mayor movilidad que tiene la molcula (en solucin, sin
presencia de gel) y se relaciona con la carga de la molcula (protena A y B con similar carga neta).
El grfico de Ferguson se puede utilizar para determinar el peso molecular de las protenas. Para eso se
determina la constante de retardo, Kr de distintas protenas estndar de peso molecular conocidos, y se
realiza una curva de calibracin. Luego se determina Kr de la protena problema y se interpola en la curva
obtenindose el peso molecular. El inconveniente de esta tcnica es que las protenas utilizadas para la
curva de calibracin deben tener la misma forma, grado de hidratacin y volumen especfico que la protena
nativa de inters.
Electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE)
Se utiliza el dodecil sulfato de sodio (SDS), un detergente que
desnaturaliza las protenas y les confiere cargas negativas de manera
uniforme. Esto resulta en que polipptidos distintos obtienen la
misma densidad de carga neta, por lo tanto, la migracin se da
solamente segn el peso molecular.
Por lo general se cumple que a mayor peso molecular de las
protenas, stas migran menos.
Consideraciones a tener en cuenta:
Para una concentracin de gel dada, la relacin entre el log PM y el Rf es lineal solo en un rango
limitado de pesos moleculares.
En este tipo de electroforesis la protena se encuentra desnaturalizada, por lo tanto, el PM que se
obtiene puede no ser el de la protena nativa, por ejemplo, si se trata de protenas con estructura
cuaternaria (formadas por ms de una subunidad).
Si las subunidades estn unidas por puentes disulfuro, es necesario agregar un agente reductor de
puentes disulfuros, como por ejemplo, el 2-mercaptoetanol.
Isoelectroenfoque
Se lleva a cabo en un gradiente de pH que se establece entre los electrodos. Las protenas migran hasta
alcanzar un pH igual a su punto isoelctrico donde la carga neta es cero y en consecuencia se detiene. La
clave del mtodo es lograr un buen gradiente de pH. Se utilizan anfolitos cuyos puntos isoelctricos rodean
el rango de pH deseado.
Visualizacin de las bandas en el gel
1. Tincin: se utiliza generalmente el azul de Coomassie, que se une a las protenas en forma especfica.
2. Deteccin de protenas especficas
Medida de actividad (restringida a enzimas)
Reaccin con anticuerpos especficos (Western blot): se transfieren las protenas desde el gel
hacia una membrana (ej. Nitrocelulosa) que luego se pone en contacto con una solucin de
anticuerpos especficos para alguna protena. Se detecta la unin antgeno-anticuerpo por
fluorescencia, actividad enzimtica, etc.
Electroforesis de cidos nucleicos
Presentan carga negativa debido a los grupos pirofosfato, por lo que el nmero de cargas negativas es
proporcional al tamao de la molcula. Esto resulta en que si se encuentran en conformacin lineal,
migrarn nicamente segn su tamao.
Generalmente se utilizan geles de agarosa y molculas fluorescentes e intercalantes como el bromuro de
etidio para visualizar las bandas.
Southern (ADN) y Northern (ARN) blot
En la tcnica de Southern, la membrana que contiene un ADN
transferido se incuba con ARN o ADN complementario al ADN de
inters. La tcnica de Northern es similar excepto que la
molcula transferida es ARN. La transferencia se realiza luego de
separar la muestra que contiene el ADN por electroforesis,
poniendo luego en contacto el gel con la membrana y
estableciendo una corriente de buffer a travs del gel y hacia la
membrana que arrastra el cido nucleico y lo deposita sobre la
membrana. La deteccin se realiza por hibridacin con un
fragmento de DNA complementario llamado sonda, que puede
estar marcado de diversas maneras de forma de facilitar su
deteccin. Puede contener nucletidos marcados
radiactivamente, con lo cual ser necesario realizar una
autoradiografa, o poseer otro tipo de marca, como un
fluorforo.
