COLEGIO DE POSTGRADUADOS

INSTITUCIN DE ENSEANZA E INVESTIGACIN EN CIENCIAS AGRCOLAS

CAMPUS MONTECILLO
POSTGRADO DE RECURSOS GENTICOS Y PRODUCTIVIDAD
FISIOLOGA VEGETAL

CARACTERIZACIN MORFOLGICA Y GENTICA DE

VARIEDADES MEXICANAS DE HIGO (Ficus carica L.)

MAYRA TERESA GARCA RUIZ

T E S I S

PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL

PARA OBTENER EL GRADO DE:

DOCTORA EN CIENCIAS

MONTECILLO, TEXCOCO, EDO. DE MXICO

2014
 CARACTERIZACIN MORFOLGICA Y GENTICA DE VARIEDADES
MEXICANAS DE HIGO (Ficus carica L.)

Mayra Teresa Garca Ruiz, Dr.

Colegio de Postgraduados, 2014

Resumen

El higo comn (Ficus carica L.) fue introducido en Mxico por los misioneros
Franciscanos espaoles en el siglo XVI, por lo que se asume que los higos
mexicanos son de la variedad espaola Black Mission. Nosotros colectamos y
propagamos plantas de higo de seis estados del centro de Mxico. Aqu nosotros
presentamos una caracterizacin morfolgica de poblaciones mexicanas de higo,
basada en atributos cualitativos y cuantitativos del fruto, as como una metodologa
estandarizada para la extraccin de ADN y un anlisis de huellas de ADN, basadas
en una combinacin de RAPDs, ISSRs y RFLPs. Nuestros resultados muestran una
gran diversidad en la morfologa del fruto, la que no puede ser explicada nicamente
por efecto de las condiciones ambientales. Las principales diferencias entre las
poblaciones mexicanas de higo son el tamao o peso del fruto, el color de la pulpa,
la longitud del cuello y la forma del pednculo. Las huellas de ADN demuestran de
manera contundente que las poblaciones de higo en el centro de Mxico son
genticamente diferentes. Con base en estos resultados, llegamos a la conclusin de
que despus de cientos de aos los higos negros se han adaptado a condiciones
ambientales locales en el centro de Mxico, generando variedades claramente
distintas que representan diversidad morfolgica y gentica valuable y previamente
no descrita. Aunque Mxico no es el centro de origen del higo, nuestros resultados
muestran claramente que Mxico es una fuente de diversidad gentica del higo.
Tambin sugerimos nombres para las variedades caracterizadas con base en sus
lugares de origen y establecemos las bases para la futura caracterizacin
agronmica y molecular de variedades de higo.
Palabras clave: diversidad morfolgica, variedades de higo, huellas de ADN.
 MORPHOLOGICAL AND GENETIC CHARACTERIZATION OF MEXICAN FIG
(Ficus carica L.) VARIETIES

Mayra Teresa Garca Ruiz, Dr.

Colegio de Postgraduados, 2014

Abstract

The common fig (Ficus carica L.) was introduced into Mexico by spanish Franciscan
missionaries in the 16th century, so that is it assumed that Mexican figs belong to the
spanish cultivar Black Mission. We collected and propagated fig plants from six states
in the Central Mexico region. Here we present a morphological characterization of
Mexican fig populations, based on qualitative and quantitative fruits traits, as well as a
standardized method to extract DNA from young leaves, and a DNA fingerprinting
analysis based on a combination of RAPDs, ISSRs and RFLPs. Our results show a
great diversity in the morphology of the fruit, which can not be explained only by the
effects of environmental conditions. The main morphological differences among
Mexican fig landraces are the fruit size or weight, color of the pulp, length of the neck
and the shape of the stalk. DNA fingerprinting showed in a forceful way that the
Mexican fig populations were genetically different among them. Based on these
results, we came to the conclusion that after hundreds of years of cultivations, the
black figs have been adapted to the local environmental conditions of the center of
Mexico, yielding in several clearly distinct landraces, which represent valuable and
previously undescribed genetic and morphological diversity. Though Mexico is not the
center of origin of the fig, our results show clearly that Mexico is a source of genetic
diversity of the fig. We also suggest names for the varieties characterized based on
their place of origin and established the basis for further agronomic characterization
of fig varieties.

Key words: morphological diversity, fig varieties, DNA fingerprinting.

ii
 AGRADECIMIENTOS

A Dios, que me guarda como a la nia de sus ojos, me corona de favores, multiplica
mis fuerzas, y me sustenta con la diestra de su justicia.

Al pueblo de Mxico que financa al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa, por

el apoyo econmico que me brind para la realizacin de mis estudios de doctorado.

Al Colegio de Postgraduados, por contribuir en mi formacin acadmica.

Al Donald Danforth Plant Science Center, en St. Louis, Missouri, USA, por la
oportunidad de realizar una estancia doctoral en el laboratorio del Dr. James
Carrington.

Al Dr. J. Jess Garca Zavala, por su paciencia, sugerencias, apoyo desinteresado,

tiempo dedicado en la revisin de la tesis, y constante motivacin para llevar a buen
trmino esta investigacin, y con ello, la obtencin de mi grado.

Al Dr. Hernn Garca Ruiz, por guiarme de manera personal durante la estancia
doctoral en Danforth, ensendome diferentes aspectos de la ciencia y de la vida
misma, y por sus valiosas sugerencias en la revisin del artculo cientfico y la tesis.

A la Dra. Ernestina Valadez Moctezuma, por sus consejos, apoyo para realizar parte
de esta investigacin con recursos de su laboratorio, sus sugerencias en la revisin
del artculo y de la tesis, y por alentarme a seguir siempre hacia adelante.

Al Dr. Gregorio Arellano Ostoa, por su valenta para aceptar formar parte de mi
Consejo Particular, con la nica intencin de apoyarme en la culminacin de mis
estudios.

Al Dr. Gilberto Rendn Snchez, por sus enseanzas a lo largo de mis estudios de
doctorado y por su apoyo incondicional para ser parte de mi Consejo Particular.

Al Dr. Javier Hernndez Morales, por sus sugerencias a lo largo de mi estancia en el

Colegio de Postgraduados y por brindarme un espacio en su laboratorio para llevar a
cabo parte de esta investigacin, apoyndola incluso con recursos de sus propios
proyectos.

Al M. C. Alfonso Muratalla La, por compartir el material gentico de dos variedades

de higo incluidas en esta investigacin, por permitirme hacer uso de su invernadero,
y por sus sugerencias y enseanzas.

iii
Al Dr. Sergio Sandoval, M. C. Victoria Ayala, Dr. Marcos Soto, M. C. Rubn San
Miguel, Dr. Arturo Galvis, M. C. Tita, Dr. Gabino Garca y Dr. Henry Wagaba, por las
facilidades brindadas para hacer uso de sus laboratorios para llevar a cabo diversas
partes de esta investigacin, as como su apoyo en la identificacin de
microorganismos, el uso de software y anlisis genticos.

Al Dr. Manuel Anaya Garduo, por alentarme a recuperar la confianza en mi misma,

permitirme formar parte del equipo de trabajo de CIDECALLI, y por apoyarme
incondicionalmente para cuncluir esta investigacin.

Al Dr. Francisco Escobar Vega, por defender los derechos de los estudiantes y
apoyarme desinteresadamente para llevar a buen trmino mis estudios de doctorado.

Al Dr. Daniel Teliz Ortz, por sus consejos y apoyo moral a lo largo de mi paso por el
Colegio de Postgraduados.

Al Lic. Armando Ramrez Gmez, por analizar crticamente mi situacin como

estudiante del COLPOS y hacer que la justicia se imparta de manera imparcial.

Al Dr. Jorge Flores Velzquez, porque los verdaderos amigos permanecen para
siempre.

A la M. C. Diana Garfias, por las horas y horas de esfuerzo dedicadas para

escucharme, aconsejarme, y ayudarme a encontrar una pizca de esperanza.

A Gisela, Huitzi, Ana, Irma, Karina, Gerardo y Nora, compaeros de laboratorio y

cubculo; Mara, Michaela, Mary y Penny, equipo de trabajo en Danforth; Alberto y
Dolores, personal de apoyo en el laboratorio de Biologa Molecular de Fitotecnia,
UACh; Maricela y Ma. de La Paz, de Fisiologa Vegetal; Yolanda de Hidrociencias;
Carmen, Dionicio y Luz, compaeros de Fitopatologa; Dr. Vctor Conde Martnez, y
M. C. Antonio Garca Esteva, de Botnica; por los gratos recuerdos.

Al equipo de trabajo de CIDECALLI: Sandra R. M. C. Vlez Arteaga, Yesika Mata

Gallardo y Jhonatan Chacn Rodrguez, por su valioso apoyo moral y logstico
durante la fase final de mi investigacin.

A Ana Mara, Claudia, Alfredo, Paola, Mayela, Pascual, Gabriela, Ral, Elizabeth,
Hpsiva, Antonio, Isabel, Carolina, Jess, Xchitl, Toms, Ignacio, Guadalupe,
Fredy, Moiss, Hernn, y Victoria, por su ejemplo de unidad, trabajo en equipo,
fortaleza, oraciones, y perseverancia en Cristo Jess.

iv
 DEDICATORIA

Con profundo cario dedico esta investigacin a quienes me guiaron, me apoyaron y

me formaron en alguna etapa de mi vida:

Mis padres y hermanos.

Mis abuelitos.

Familia Garca Luna.

Familia Garca Hernndez.

Familia Daz Garca.

Familia Salazar Garca.

Familia Garca Garca.

Familia Chvez Garca.

Profesora Ma. Guadalupe Plaza Paredes.

Profesora Ma. Magdalena Lpez Correa.

M. C. Virginia Cano Garca.

M. C. Alba Luz Reyes Vigl.

Ing. Juvenal Yaez Vargas.

v
 CONTENIDO

I. INTRODUCCIN GENERAL 1
1.1. Objetivos. 3
1.2. Hiptesis. 4
1.3. Literatura Citada. 5

II. REVISIN DE LITERATURA 8

2.1. Origen y distribucin geogrfica del higo. 8
2.2. Caractersticas botnicas del higo. 9
2.3. Clasificacin taxonmica del higo. 12
2.4. Tipos de higueras. 13
2.5. Variedades de higo. 15
2.6. Propiedades nutritivas y nutracuticas del higo. 20
2.7. Indicadores de cosecha del higo. 21
2.8. Fisiologa y vida de anaquel del higo. 23
2.9. Control de microorganismos en higo. 25
2.10. Cultivo del higo en Mxico. 27
2.11. Caracterizacin de higo con base en atributos morfolgicos. 29
2.12. Caracterizacin de higo con base en marcadores moleculares. 31
2.13. Literatura Citada 32

III. DIVERSIDAD MORFOLGICA DE HIGOS (Ficus carica L.) EN 41

MXICO
3.1. Resumen. 41
3.2. Abstract. 42
3.3. Introduccin. 43
3.4. Materiales y Mtodos. 46
3.5. Resultados y Discusin. 50
3.6. Conclusiones. 55
3.7. Literatura Citada. 56

vi
IV. PROTOCOLO PARA LA EXTRACCIN DE ADN DE PLANTAS DE HIGO 60
(Ficus carica L.)
4.1. Resumen. 60
4.2. Abstract. 61
4.3. Introduccin. 62
4.4. Materiales y Mtodos. 65
4.5. Resultados y Discusin. 69
4.6. Conclusiones. 73
4.7. Literatura Citada. 73

V. HUELLAS DE ADN DE VARIEDADES MEXICANAS DE HIGO (Ficus 78

carica L.)
5.1. Resumen. 78
5.2. Abstract. 79
5.3. Introduccin. 80
5.4. Materiales y Mtodos. 83
5.5. Resultados y Discusin. 91
5.6. Conclusiones. 98
5.7. Literatura Citada. 99

VI. VALOR NUTRITIVO Y NUTRACUTICO DE VARIEDADES 103

MEXICANAS DE HIGO (Ficus carica L.)
6.1. Resumen. 103
6.2. Abstract. 104
6.3. Introduccin. 105
6.4. Materiales y Mtodos. 106
6.5. Resultados y Discusin. 111
6.6. Conclusiones. 115
6.7. Literatura Citada. 116

vii
VII. IDENTIFICACIN Y CONTROL DE HONGOS CAUSANTES DEL 118
DETERIORO POSTCOSECHA DE HIGO (Ficus carica L.)
7.1. Resumen. 118
7.2. Abstract. 119
7.3. Introduccin. 120
7.4. Materiales y Mtodos. 122
7.5. Resultados y Discusin. 126
7.6. Conclusiones. 130
7.7. Literatura Citada. 131

VIII. DISCUSIONES GENERALES 133

8.1. Literatura Citada. 138

IX. CONCLUSIONES GENERALES 141

viii
 NDICE DE CUADROS

1 Caractersticas de las variedades de higo de mayor produccin a nivel 16

internacional.

2 Composicin qumica de frutos de higo fresco y deshidratado. 20

3 Mtodos de control de microorganismos en pre y postcosecha de higo. 26

4 Comportamiento de la produccin de higo en Mxico durante los ltimos 30 28

aos.

5 Solucin nutritiva utilizada para la fertilizacin de plantas de higo de 48

diferentes partes del centro de Mxico.

6 Temperatura y humedad relativa prevalecientes en el invernadero, durante 49

la produccin de higos de diferentes poblaciones del centro de Mxico,
utilizados para la caracterizacin morfolgica de los frutos.

7 Caractersticas del fruto de diferentes poblaciones de higo del centro de 51

Mxico.

8 Temperatura y humedad relativa prevalecientes en el invernadero, durante 66

la produccin de higos de diferentes poblaciones del centro de Mxico,
utilizados para la extraccin de ADN.

9 Concentracin y calidad del ADN obtenido de rganos de diferente edad de 70

varias poblaciones de higo del centro de Mxico.

ix
10 Temperatura y humedad relativa prevalecientes en el invernadero, durante 84
la produccin de higos de diferentes poblaciones del centro de Mxico,
utilizados para para el anlisis de huellas de ADN.

11 Secuencias de los primers utilizados en el anlisis de huellas de ADN de 86

diferentes poblaciones de higo del centro de Mxico.

12 Nmero de bandas totales y polimrficas y polimorfismo de los primers que 92

generaron bandas de ADN visibles para la diferenciacin molecular de
poblaciones de higo del centro de Mxico.

13 Temperatura y humedad relativa prevalecientes en el invernadero, durante 107

la produccin de higos de la variedad Neza, utilizados para determinar el
contenido de minerales, fenoles y antocianinas del fruto.

14 Composicin mineral (mg 100 g de materia seca) de frutos de higo de la 111

variedad Neza, producidos en invernadero en diferentes pocas del ao.

15 Temperatura y humedad relativa prevalecientes en el invernadero, durante 123

la produccin de higos de la variedad Neza, utilizados para identificar las
causas del deterioro postcosecha del fruto.

x
 NDICE DE FIGURAS

1 Partes de las flores e infrutescencias de higo. Las flores pistiladas de estilo 11

corto y las flores estaminadas se encuentran en los higos silvestres. Las
flores pistiladas de estilo largo se encuentran en los higos comestibles. La
figura fue adaptada de Storey (1975) y Stover et al. (2007).

2 Periodo de produccin de frutos de higo en funcin del tipo de higuera 14

cultivada para la regin de Israel. *: La 3ra cosecha de las higueras Caprifig
comienza en diciembre y contina en enero del ao siguiente. Las higueras
tipo Comn y San Pedro son bferas o reflorescentes, es decir presentan
dos flujos de produccin al ao. Las higueras tipo Smyrna son unferas y
producen una sola cosecha al ao. La figura es de elaboracin propia y fue
adaptada del IPGRI (2003) y Flaishman et al. (2008).

3 Variedades de higo de mayor valor comercial en el mundo. La figura es de 19

elaboracin propia y fue adaptada con imgenes tomadas de diferentes
sitios web: [Link] [Link]
[Link]
[Link]
[Link]
[Link]
[Link]

4 Distribucin del cultivo de la higuera en la Repblica Mexicana. La figura es 27

de elaboracin propia y fue adaptada con informacin tomada del SIAP
(2011) e imgenes tomadas del sitio web ([Link]

5 Caractersticas representativas del fruto de diferentes poblaciones de higo 52

del centro de Mxico.

xi
6 Tamao del fruto de diferentes poblaciones de higo del centro de Mxico 54
(1: Ixmiquilpan, 2: Salvatierra, 3: Tecmac, 4: Tetela, 5: Neza, 6:
Zacapala), comparado con los estndares internacionales de higo (IPIGRI,
2003) y las variedades Sarylop (Ersoy et al., 2008) y Black Mission (Condit,
1955; Storey 1977; CFAB, 2011). A) Biomasa fresca del fruto (g). B)
Longitud del fruto (cm). C) Dimetro del fruto (cm). D) Longitud del cuello
del fruto (cm). Letras distintas indican diferencia estadstica con la prueba
de Tukey (P 0.05, n=20).

7 Calidad de ADN de higo de rganos de diferente edad de varias 72

poblaciones del centro de Mxico (1: Ixmiquilpan, 2: Salvatierra, 3:
Tecmac, 4: Tetela, 5: Neza, 6: Zacapala), verificada en geles de agarosa
al 1 %. A) Hojas jvenes. B) Hojas maduras. C) Frutos jvenes. D) Frutos
maduros. Los marcadores de 100 pb y 1Kb fueron utilizados como
marcadores de ADN de peso molecular estndar.

8 Diseo de primers utilizando la secuencia del ADNc del gen AT5G6010 89

(Fruitfull) de A. thaliana. A) Alineamiento BLAST de la secuencia del ADNc
de A. thaliana con varias especies de plantas. B) Coordenadas de los
primers utilizados basndonos en la secuencia del ADN genmico del
Fruitfull.

9 Huellas de ADN de diferentes poblaciones de higo del centro de Mxico (1: 93

Ixmiquilpan, 2: Salvatierra, 3: Tecmac, 4: Tetela, 5: Neza, 6: Zacapala),
utilizando ISSRs. A. thaliana variedad Columbia (Col-0) fue incluida como
testigo. A) Patrn de electroforesis de los productos de PCR corridos en
geles de agarosa al 1 %. B) Patrn de electroforesis de los productos de
PCR digeridos con las enzimas BglII-BamHI, corridos en geles de
poliacrilamida al 6 %. Los marcadores de 100 pb y 1Kb fueron utilizados
como marcadores de ADN de peso molecular estndar. El panel inferior de
los geles de poliacrilamida muestra una exposicin ms larga del rea

xii
 entre 0.075 y 0.2 Kb.

10 rbol filogentico (200 remuestreos) de diferentes poblaciones de higo del 94

centro de Mxico, basado en los patrones de electroforesis de los geles de
poliacrilamida de los ISSRs, con tres repeticiones (A, B y C) de cada
poblacin.

11 Huellas de ADN de diferentes poblaciones de higo el centro de Mxico (1: 96

Ixmiquilpan, 2: Salvatierra, 3: Tecmac, 4: Tetela, 5: Neza, 6: Zacapala),
utilizando los primers especficos diseados a partir del Fruitfull. A. thaliana
variedad Columbia (Col-0) fue incluida como testigo. A) Patrn de
electroforesis de los productos de PCR corridos en geles de agarosa al 1
%. B) Patrn de electroforesis de los productos de PCR digeridos con las
enzimas BglII-BamHI, corridos en geles de poliacrilamida al 6 %. Los
marcadores de 100 pb y 1Kb fueron utilizados como marcadores de ADN
de peso molecular estndar. El panel inferior de los geles de poliacrilamida
muestra una exposicin ms larga del rea entre 0.075 y 0.2 Kb.

12 rbol filogentico (200 remuestreos) de diferentes poblaciones de higo del 97

centro de Mxico, basado en los patrones de electroforesis de los geles de
poliacrilamida de los primers especficos diseados a partir del Fruitfull,
con tres repeticiones (A, B y C) de cada poblacin.

13 Secuencia de extraccin e identificacin de compuestos fenlicos de frutos 110

de higo por medio de HPLC.

14 Contenido de fenoles y antocianinas totales de frutos de higo de la 113

variedad Neza, producidos en invernadero en diferentes pocas del ao.

15 Compuestos fenlicos identificados en frutos de higo de la variedad Neza, 114

producidos en invernadero en diferentes pocas del ao.

xiii
16 Infestacin (%) de frutos de higo de la variedad Neza, tratados con 127
diferentes compuestos seguros al 1 %. Letras distintas indican diferencia
estadstica con la prueba de Tukey (P 0.05, n=20).

17 Colonias de hongos desarrolladas en frutos de higo de la variedad Neza, 127

tratados con diferentes compuestos seguros al 1 %. Letras distintas indican
diferencia estadstica con la prueba de Tukey (P 0.05, n=20).

18 Hongos causantes del deterioro postcosecha de frutos de higo de la 128

variedad Neza, producidos en invernadero.

19 Efectividad fungisttica de diferentes compuestos seguros (1 %) aplicados 129

en frutos de higo de la variedad Neza. Letras distintas indican diferencia
estadstica con la prueba de Tukey (P 0.05, n=20).

xiv
 I. INTRODUCCIN GENERAL

La planta del higo (Ficus carica L.) y sus frutos han sidos aprovechados por el
hombre desde tiempos inmemoriables. Anlisis arqueobotnicos revelaron que el
higo comn fue la primera planta cultivada en el mundo, precediendo a la
domesticacin de los cereales (Krislev et al., 2006). La migracin humana contribuy
a dispersar la planta fuera de su ambiente natural (Condit, 1955; Storey, 1977), y
actualmente el higo es cultivado en 48 pases alrededor del mundo (FAO, 2010). El
higo es un componente florstico de la familia Moraceae, la cual incluye 37 gneros y
ms de 1,100 especies (Datwyler y Weiblen, 2004). El gnero Ficus se distribuye
principalmente en climas clidos y templados, y comprende aproximadamente 881
especies. Por esta razn, es considerado como el gnero de plantas ms diverso en
el mundo (Kumar et al., 2011).

En Mxico, la diversidad gentica y morfolgica de la planta de higo es

completamente desconocida. Nosotros nos dimos a la tarea de colectar y propagar
plantas de higo de poblaciones cultivadas en diferentes estados de la Repblica
Mexicana, con los propsitos de caracterizar la diversidad gentica y morfolgica de
los higos mexicanos y de establecer el primer banco de germoplasma de higo en
nuestro pas. Tradicionalmente, los bancos de germoplasma resguardan
descripciones morfolgicas y etnobotnicas de materiales de diferentes especies con
valor comercial, pero no incluyen informacin gentica (Garca et al., 2003).

La descripcin morfolgica de variedades se basa en la medicin de un grupo de

caractersticas fenotpicas que permita diferenciarlas entre s (IPGRI, 2003). Este
mtodo es de amplia aplicacin y permite separar a las plantas en grupos claramente
distintos. Sin embargo, la aplicacin de este mtodo requiere de entrenamiento y
experiencia de los evaluadores, y est sujeto a variaciones personales de
apreciacin (Gallegos et al., 2005). El higo no es la excepcin. Para reducir esos
sesgos se han desarrollado guas tcnicas que sirven como punto de comparacin
estndar para la evaluacin de las caractersticas de inters. El IPGRI (International
Plant Genetic Resources Institute) ha reconocido la importancia de la caracterizacin
de especies y variedades de higo, apoyndose en descriptores biolgicos,
agronmicos, morfolgicos y qumicos, cualitativos y cuantitativos. Las
caractersticas ms importantes son el hbito de crecimiento, nmero de cosechas al
ao, forma de polinizacin; longitud y dimetro del tallo, de la hoja y del fruto;
longitud del lbulo central de la hoja, del peciolo, del cuello y del pednculo; peso del
fruto, color del exocarpio y de la pulpa, sabor, jugosidad, firmeza, contenido de
slidos solubles totales, y acidez total (IPGRI, 2003).

Por otro lado, el caracterizar la diversidad gentica de cualquier especie vegetal

mediante huellas de ADN representa muchas ventajas. Una de ellas es que stas no
son influenciadas por el ambiente ni por la etapa fenolgica del cultivo (Valadez et
al., 2001). Estas huellas conocidas como polimorfismos de ADN o marcadores
moleculares requieren de las tcnicas de electroforesis para poder ser visualizadas
en geles de agarosa o poliacrilamida (Garca, 2000).

Hasta el da de hoy, se han desarrollado almenos 40 tipos de marcadores

moleculares (Semagn et al., 2006; Sarwat, 20102). Los ms comunes son los RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD (Random Amplification of
Polymorphic DNA), ISSR (Inter Simple Sequence Repeat), AFLP (Amplified
Fragment Length Polymorphism) y los Microsatlites (SSR) (Semagn et al., 2006;
Sarwat, 2012). Los ISSR fueron desarrollados in 1994 a partir de regiones
microsatelitales de 16 a 18 pares de bases (Khaled et al., 2010). Los ISSR han
adquirido popularidad debido a que son altamente polimrficos, delimitan secuencias
altamente conservadas y son muy tiles en la identificacin de variacin natural en
plantas (Sarwat, 2012). La efectividad de los ISSR ha sido confirmada por varios
investigadores en especies como crisantemo (Palai y Rout, 2011), uva (Hassan et
al., 2011), y rosa (Jabbarzadeh et al., 2010). Actualmente, los ISSR son
considerados como una de las mejores opciones para realizar estudios sobre huellas
genticas de ADN, diversidad y estabilidad gentica, marcacin de genes,
identificacin de hbridos y variedades, variacin somaclonal y calidad de la

2
produccin (Jabbarzadeh et al., 2010; Khaled et al., 2010; Sarwat, 2012).
Especficamente en higo, los ISSR han sido usados con propsitos de identificacin
varietal y determinacin de relaciones filogenticas entre variedades (Khadari et al.,
2003; Guasmi et al., 2006; Mallikarjuna et al., 2010).

En el contexto de esta investigacin, se puede afirmar que la planta de higo fue

introducida a Mxico en 1683 por los misioneros espaoles Franciscanos (Storey,
1977). Actualmente, el higo es cultivado comercialmente en 11 estados de la
Repblica Mexicana (SIAP, 2011). Sin embargo, en nuestro pas no hay informacin
acerca de la caracterizacin molecular o diversidad natural de variedades de higo, y
en general se cree que los higos mexicanos son y representan a la variedad
espaola Black Mission. En este estudio, nosotros encontramos y reportamos
variacin natural previamente no descrita de la morfologa del fruto entre higos
negros de diferentes partes de Mxico. Para estudiar la variacin gentica entre
variedades de higo negro del centro de Mxico, nosotros realizamos una
caracterizacin morfolgica inicial y anlisis de huellas de ADN basadas en una
combinacin de RAPDs, ISSRs y RFLPs. Nuestros resultados demuestran que los
higos negros, inicialmente derivados de Black Mission, se han adaptado a las
condiciones ambientales locales en el centro de Mxico, generando con ellos
variedades claramente distintas, las cuales representan diversidad gentica valuable
y previamente no descrita.

1.1. Objetivos

1. Caracterizar poblaciones de higo del centro de Mxico con base en la forma y

otras caractersticas del fruto que ellas producen.

2. Establecer, validar, y proponer un mtodo para la extraccin de ADN de plantas

de higo.

3
3. Caracterizar poblaciones de higo del centro de Mxico, mediante huellas de ADN
basadas en una combinacin de RAPDs, ISSRs y RFLPs.

4. Determinar el valor nutritivo y nutracutico de frutos de higo de la variedad Neza,

con base en el contenido de minerales, fenoles y antocianinas.

5. Identificar las causas del deterioro postcosecha de frutos de higo de la variedad

Neza y su control, basado en un anlisis de efectividad de diferentes
compuestos seguros.

1.2. Hiptesis

Objetivo 1
Ho: La diversidad morfolgica de los frutos de higo provenientes de diferentes partes
del centro de Mxico, no se debe solamente a los efectos de las diferencias en
condiciones ambientales donde ste se produce.

Ha: La diversidad morfolgica de los frutos de higo provenientes de diferentes partes

del centro de Mxico, se debe nicamente a los efectos de las condiciones
ambientales donde ste se produce.

Objetivo 2
Ho: La concentracin y la calidad del ADN varan en funcin de la edad y rgano de
las plantas utilizadas para su extraccin.

Ha: La concentracin y la calidad del ADN son constantes y no son influenciadas por
la edad ni por el tipo de rgano de las plantas que se usen para su extraccin.

4
Objetivo 3
Ho: Las diferencias genticas entre higos de distintas partes de Mxico pueden ser
detectadas mediante huellas de ADN tipo RAPDs, ISSRs y RFLPs.

Ha: El anlisis de huellas de ADN tipo RAPDs, ISSRs y RFLPs, no permitir detectar
diferencias genticas entre higos provenientes de distintas partes de Mxico.

Objetivo 4
Ho: El contenido de minerales, fenoles y antocianinas de los frutos de higo, vara con
la poca del ao, la regin de origen o el tipo de higo.

Ha: El contenido de minerales, fenoles y antocianinas de los frutos de higo, no vara

con la poca del ao, la regin de origen o el tipo de higo.

Objetivo 5
Ho: El deterioro postcosecha de los frutos de higo es causado por diversas clases de
microorganismos.

Ha: El deterioro postcosecha de los frutos de higo no es causado por diversas clases
de microorganismos.

1.3. Literatura Citada

Condit, I. J. 1955. Fig Varieties: A Monograph. Hilgardia. 23 (11): 323-539.

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7
 II. REVISIN DE LITERATURA

2.1. Origen y distribucin geogrfica del higo

El higo comn (Ficus carica L.) fue la primera planta cultivada en el mundo (Krislev et
al, 2006). Su centro de origen no ha sido establecido claramente, ya que se trata de
una especie de distribucin mundial, identificada por primera vez en los pases
cercanos al Mediterrneo (lvarez-Arbes y Fernndez-Prieto, 2000). Sin embargo,
anlisis moleculares recientes sugieren que el higo es originario de Turqua
(Karandeniz, 2009). La migracin humana contribuy a dispersar la planta fuera de
su ambiente natural, inicialmente en Arabia, Argelia, Egipto, Espaa, Francia, Grecia,
Italia, Libia, Marruecos, Palestina, Portugal, Tnez y Siria, y despus en todo el
mundo (Condit, 1955; Storey, 1977). Los romanos la distribuyeron entre los territorios
que conquistaron y se cree que al iniciarse el coloniaje, los espaoles introdujeron la
planta de higo en el continente Americano, especficamente en el estado de
California, Estados Unidos, a principios del siglo XVIII. De California la higuera fue
distribuida en el sureste del pas (Price y White, 1902).

En Mxico, el higo fue introducido por los misioneros espaoles en 1683 (Storey,
1977), quienes establecieron las plantas en los atrios de las iglesias en los estados
de Hidalgo, Guanajuato, Morelos, San Luis Potos y Zacatecas. Se cree que de ah
se distribuy la plantacin del rbol de higo en todo el pas, y desde entonces es un
componente importante de los huertos familiares (Parra, 1996). En el siglo XIX, el
fruto de higo empez a comercializarse en todo el territorio nacional como fruta
fresca o cristalizada (Carballo, 1980). Aos ms tarde, en las principales zonas de
produccin de higo se establecieron algunas fbricas de dulces que empezaron a
comercializar la fruta deshidratada y en almbar (Snchez y Martnez, 1987; Parra,
1996). Esto contribuy para que entre 1927 y 1946 se incrementara la superficie del
cultivo en un 255 %, consolidndose la oferta de esta fruta en el mercado nacional
(Carballo, 1980).

8
 2.2. Caractersticas botnicas del higo

Raz. El sistema radical de la higuera es fibroso y superficial (20-45 cm de

profundidad), se expande triplicando el tamao de la copa (6-10 m) y es altamente
eficiente en la absorcin de agua y nutrimentos (Flores, 1990). Las plantas de un ao
de edad presentan races frgiles que se rompen con facilidad en la base del tallo.
Las plantas de dos aos de edad presentan races fuertemente unidas al tallo y son
menos susceptibles a daos. En general, las plantas adultas se adaptan a suelos
calizos y pobres en nutrientes, toleran la salinidad, el dficit de humedad prolongado,
y son resistentes a nemtodos (Melgarejo, 2000). Sin embargo, cuando se cultivan
en suelos arenosos muestran sensibilidad al ataque del nemtodo Melodoygine
incognita (Flaishman et al., 2008).

Tallo. La higuera presenta un tallo principal grueso de hasta 0.3 m de dimetro, con
corteza lisa, de color gris plido que se agrieta con facilidad porque es muy suave y
delgada, provocando debilitamiento de la planta (Flores, 1990). El tallo desarrolla
ramas primarias y secundarias cubiertas por una corteza fina, sin rugosidades. Los
entrenudos son abultados y desarrollan hojas e inflorescencias en cada yema axilar
(Flaishman et al., 2008). En ambientes favorables para el crecimiento de la planta,
los tallos son globosos, vigorosos y alcanzan los 10 m de altura. En contraste, en
condiciones desfavorables, como la presencia de heladas o sequa prolongada, los
tallos son compactos y pequeos (Flores, 1990). Las ramas del higo crecen de
manera continua desde la primavera hasta el otoo, y el desarrollo del fruto tiene
lugar de manera simultnea al crecimiento de las ramas, en las axilas de los brotes
vegetativos (Melgarejo, 2000). Las ramas presentan dominancia apical, son de fcil
enraizamiento y se utilizan para la propagacin de la especie (Flores, 1990).

Hoja. Las hojas de la higuera son grades, de color verde intenso, de forma palmeada
con tres a siete lbulos, muy reticuladas por el envs y con peciolo largo y grueso
(Flores, 1990). Presentan filotaxia alterna, crecen durante la primavera y
permanecen en la planta hasta que las temperaturas bajas del otoo provocan su

9
cada. Una caracterstica distintiva de la higuera es la produccin abundante de ltex
en las hojas y todos los tejidos verdes de la planta (Flores, 1990). El ltex es
sumamente txico y venenoso, por lo que es utilizado como sistema de defensa,
pudiendo causar la muerte de herbvoros, vertebrados, insectos y microorganismos
(Melgarejo, 2000).

Flor. Las flores de la higuera se encuentran dentro de un receptculo carnoso

(Figura 1). Las flores femeninas presentan cinco ptalos de color rosa o blanquecino,
un solo carpelo, ovario spero, estilo largo o corto y estigma bfido (Figura 1); se
distribuyen de forma irregular en la inflorescencia y solo pueden ser observadas
seccionando el receptculo. Las flores masculinas presentan tres spalos y cuatro
estambres; se localizan en la entrada del ostiolo (Figura 1) y solo pueden ser
observadas al momento de la apertura de las brcteas que las protegen (Flores,
1990). Las plantas de higo pueden ser monicas, si las flores masculinas y
femeninas estn presentes en la misma planta, o diicas, si las flores masculinas y
femeninas se encuentran en plantas separadas (Beck y Lord, 1988).

Fruto. El receptculo floral se hincha y se vuele carnoso por la fecundacin,

desarrollando infrutescencias conocidas como brevas o higos, pero no existen
diferencias entre brevas e higos, solo la diferenciacin temporal en su desarrollo y
maduracin (Flaishman et al., 2008). Las infrutescencias (Figura 1) son siconos
blandos de sabor muy dulce, cubiertos por un exocarpio muy delgado de colores
variados como amarillo, caf, morado, rojo o verde, segn la variedad (Solomon et
al., 2006), que contienen pequeos aquenios que semejan semillas, pero son en
realidad los frutos verdaderos (Melgarejo, 2000). Morfolgicamente, las
infrutescencias pueden ser ovoides o piriformes. Los frutos ovoides son ms anchos
en la parte media, mientras que los frutos piriformes son ms anchos cerca del
ostiolo. El ostiolo puede ser pequeo, mediano o grande, mientras que la cavidad
interna puede estar ausente, ser muy pequea, pequea, mediana, grande o muy
grande. El tamao de los frutos puede ser pequeo (29-46 mm de longitud y 28-38
mm de dimetro), mediano (29-54 mm de longitud y 38-49 mm de dimetro), grande

10
(54-75 mm de longitud y 50-60 mm de dimetro), o muy grande (> 75 mm de longitud
y > 60 mm de dimetro). El tamao del cuello puede ser corto (< 5 mm de longitud),
mediano (5-10 mm de longitud), o largo (> 10 mm de longitud). El pednculo puede
ser largo y delgado, corto y grueso, o largo y grueso. El color de la pulpa puede ser
blanco-amarillo, mbar, rosa, rojo, o rojo oscuro. El albedo puede presentar
coloraciones claras o intensas. La firmeza puede ser baja, media, o alta. El contenido
de slidos solubles puede ser bajo (10-13 %), medio (13.1-16 %), alto (16-20 %), o
muy alto (> 20 %). La acidez titulable expresada como porcentaje de cido ctrico
vara de < 0.05 - > 3 % (IPGRI, 2003).

Figura 1. Partes de las flores e infrutescencias de higo. Las flores pistiladas de estilo corto y las flores
estaminadas se encuentran en los higos silvestres. Las flores pistiladas de estilo largo se
encuentran en los higos comestibles. La figura fue adaptada de Storey (1975) y Stover et al.
(2007).

11
Las infrutescencias de higo se desarrollan de manera similar a una yema. Cuando
las brcteas se abren para dar paso al receptculo, miden de 2 a 4 mm;
posteriormente, el crecimiento contina, y en un lapso de 6 a 7 semanas llegan a los
2 o 4 cm de longitud. La infrutescencia contina su crecimiento y alcanza su tamao
mximo en la etapa de envero, que es cuando la infrutescencia se encuentra en
madurez comercial. El periodo de desarrollo de yema a fruto maduro vara de 115 a
121 das (Melgarejo, 2000). Con forme avanza la maduracin, internamente se
produce el cambio de color blanco a amarillo, prpura, rosa o rojo, mientras que
externamente se desarrolla el color caracterstico de la variedad (Solomon et al.,
2006). A partir de que el fruto alcanza la maduracin completa se produce el
agrietamiento de la piel, y si no se cosecha se desprende del rbol en pocos das
(Melgarejo, 2000).

2.3. Clasificacin taxonmica del higo

El gnero Ficus comprende especies cultivadas y especies silvestres que varan en

las caractersticas fenotpicas de la planta y del fruto (Condit, 1955; Flaishman et al.,
2008). Sin embargo, toda esa variacin est representada en taxones bsicos, como
los que se muestran a continuacin:

Reino: Vegetal.
Subreino: Tracheobionta.
Divisin: Magnoliophyta.
Clase: Magnoliopsida.
Orden: Rosales.
Familia: Moraceae.
Subfamilia: Ficeae.
Gnero: Ficus.
Subgnero: Ficus.
Especie: F. carica.

12
El higo es un componente florstico de la familia Moraceae. Esta incluye 37 gneros y
ms de 1,100 especies que son utilizadas para la produccin de fruto o madera
(Datwyler y Weiblen, 2004). El gnero Ficus es el ms diverso en el mundo, y
comprende aproximadamente 881 especies que se distribuye principalmente en
climas clidos y templados (Kumar et al., 2011). La especie F. carica es conocida por
sus frutos comestibles por humanos y animales, mientras que F. elastica y F.
microcarpa se utilizan con propsitos ornamentales (Beck y Lord, 1988).

2.4. Tipos de higueras

Con base en la forma de polinizacin y el nmero de cosechas producidas al ao, se

han descrito cuatro tipos de higueras (Toribio y Montes, 1996; Melgarejo, 2000; Ilgin
et al., 2007):

1. Higueras comunes. Las plantas presentan flores hermafroditas. Los frutos son
partenocrpicos, se autopolinizan pero no ocurre fecundacin; el fruto se
desarrolla por el estmulo que ocasiona el grano de polen sobre el estigma, no
producen semillas y producen una o dos cosecha al ao (Figura 2). Se cultivan en
Espaa, Estados Unidos y Mxico (Melgarejo, 2000; Aguilera et al., 2009; CFAB,
2011). La variedad Black Mission pertenece a este tipo de higueras (Flaishman et
al., 2008).

2. Higueras tipo Smyrna. Las plantas presentan flores diicas y requieren

polinizacin. Los frutos desarrollan semillas y producen una sola cosecha al ao
(Figura 2). Se cultivan principalmente en el continente Africano y Europeo (Toribio
y Montes, 1996; Melgarejo, 2000). Las variedades Sarylop, Marabout y Zidi son
algunos ejemplos de este tipo de higueras (Flaishman et al., 2008).

3. Higueras tipo San Pedro. Las plantas presentan flores diicas. Los frutos son
partenocrpicos en la primera cosecha y requieren polinizacin en la segunda

13
 cosecha (Figura 2). Se cultivan en Espaa y Estados Unidos (Melgarejo, 2000).
A este tipo de higueras pertenecen las variedades Dauphine, King y San Pedro
(Flaishman et al., 2008).

4. Higueras Caprifig. Tambin son conocidas como higueras silvestres. Las plantas
presentan flores diicas, producen tres cosechas al ao (Figura 2), pero los frutos
no son comestibles, solamente se utilizan como fuente de polen. Este tipo de
higos son los hospederos de la avispa polinizadora Blastophaga senes. Por esta
razn se cultivan en todas las regiones productoras de higos tipo Smyrna y San
Pedro (Melgarejo, 2000; Ilgin et al., 2007).

Figura 2. Periodo de produccin de frutos de higo en funcin del tipo de higuera cultivada para la regin
de Israel. *: La 3ra cosecha de las higueras Caprifig comienza en diciembre y contina en
enero del ao siguiente. Las higueras tipo Comun y San Pedro son bferas o reflorescentes,
es decir presentan dos flujos de produccin al ao. Las higueras tipo Smyrna son unferas y
producen una sola cosecha al ao. La figura es de elaboracin propia y fue adaptada del
IPGRI (2003) y Flaishman et al. (2008).

14
Adems del tipo de higuera, la fecha de maduracin de los frutos de higo vara en
funcin de la variedad, las condiciones ambientales y de manejo agronmico del
cultivo. La maduracin se considera temprana si ocurre antes del mes de julio, y
tarda si se presenta despus del mes de agosto (Snchez y Martnez, 1987; IPGRI,
2003). El periodo de cosecha de higo puede ser muy compacto (< 15 das),
compacto (15-20 das), mediano (21-40 das), amplio (41-60 das), o muy amplio (>
60 das) (IPGRI, 2003). Cuando es compacto, las infrutescencias conservan el
tamao. En contraste, cuando es amplio, las infrutescencias presentan diferentes
tamaos (Flores, 1990). Durante el otoo los frutos son de menor calidad, alcanzan
menor tamao, presentan coloracin desuniforme, y contenido de slidos solubles
ms bajo (< 14 %) (Baccaunaud et al., 1995). Despus de la cosecha, la planta de
higo entra en reposo, pero sus requerimientos de fro invernal son mnimos. En
Espaa, temperaturas de 16 C son suficientes para que la planta salga de ese
estado. Para disminuir prdidas por falta de fro, se realizan aplicaciones de
cianamida de hidrgeno al 3 %, 30 a 60 das antes de la brotacin (Melgarejo, 2000).

2.5. Variedades de higo

Aproximadamente 607 variedades de higo han sido descritas (Condit, 1955; Toribio y
Montes, 1996; lvarez-Arbes y Fernndez-Prieto, 2000). De estas, solo 46 son las
ms cultivadas en todo el mundo (Cuadro 1) (Flaishman et al., 2008), y 28 han sido
descritas como resistentes a bajas temperaturas (Price y White, 1902). A nivel
internacional, la produccin comercial de frutos de higo se basa en las variedades
Adriatic, Black Mission, Brown Turkey, Conadria, Kadota y Sarylop (Figura 3). Con
excepcin de Black Mission, la variedad partenocrpica de mayor produccin en
California, Estados Unidos (CFAB, 2011), todas estas variedades pertenecen a las
higueras tipo Smyrna o de polinizacin cruzada, y producen una sola cosecha al ao
(Piga et al., 2003; Koyuncu, 2004; Flaishman et al., 2008; El-Gharably et al., 2009;
Sen et al., 2010; Xanthopoulos et al., 2010).

15
Cuadro 1. Caractersticas de las variedades de higo de mayor produccin a
nivel internacional.
Cultivar Tipo de Regin de Tamao Color del Color del Uso
higuera cultivo del fruto exocarpio mesocarpio
Abicouy Comn Francia Mediano Negro Rojo F/D
Adriatic Comn USA Pequeo Verde/Amarillo Rojo F/D
Allomi Smyrna Irn Mediano Morado/Negro Amarillo F
Alma Comn USA Pequeo Amarillo mbar F
Bardacik Smyrna Turqua Pequeo Verde claro Rosa oscuro F
Black Comn USA Mediano Negro Rosa/Prpura F
Mission Espaa
Mxico
Beall Comn USA Mediano Violeta Rosa claro F
Beyaz San Turqua Pequeo Verde/Caf Rosa claro F
orak Pedro
Brawswic Comn China Grande Caf claro mbar F
Brown Comn USA Grande Caf oscuro Amarillo F/D
Turkey Israel
Bursa Smyrna Turkey Grande Violeta/Negro Rosa/Rojo F
Siyahi
Celeste Comn USA Pequeo Violeta/Caf mbar F
Chichek Comn Turqua Mediano Negro Rojo F/D
Conadria Comn USA Mediano Verde/Amarillo Rosa claro D
Cuello de Comn Chile Mediano Verde Rojo F
Dama Espaa
Francia
Dalmatic Comn Francia Grande Verde Rojo F
Dauphine San Francia Mediano Verde Rosa/Rojo F
Pedro
Goklop Smyrna Turqua Muy Verde/amarillo Rosa/Rojo F/D
grande

16
Cuadro 1. Caractersticas de las variedades de higo de mayor produccin a
nivel internacional (continuacin).
Cultivar Tipo de Regin de Tamao Color del Color del Uso
higuera cultivo del fruto exocarpio mesocarpio
Kadota Comn Chile Mediano Verde/Amarillo Amarillo F
Italia
USA
Kalomon Smyrna Grecia Grande Verde mbar F/D
Kashky Smyrna Irn Mediano Amarillo Rojo F/D
Kshany Comn Irn Grande Amarillo Rojo F
King San USA Mediano Rojo mbar F
Pedro
Lampa San Espaa Mediano Verde/Morado mbar F/D
Preta Pedro Italia
Lampiera San Portugal Mediano Caf claro Rosa F
Pedro
Mangefy Comn Irn Grande Amarillo Amarillo F
Masui Comn Japn Grande Morado Rosa F/D
dauphine
Meshky Comn Irn Grande Morado/Negro Rojo F/D
Neri Comn Italia Mediano Negro Rojo F
Panache Comn USA Mediano Verde/Amarillo Rosa/Rojo F
Ponte de San Italia Mediano Verde/Morado Rosa F
la gada Pedro
Roshnick Comn Albania Pequeo Caf Amarillo D
Sabz Smyrna Irn Grande Amarillo mbar F/D
Shah- Smyrna Irn Grande Verde/Amarillo Amarillo F/D
anjer
San Smyrna Italia Pequeo Verde Amarillo D
Pietro

17
Cuadro 1. Caractersticas de las variedades de higo de mayor produccin a
nivel internacional (continuacin).
Cultivar Tipo de Regin de Tamao Color del Color del Uso
higuera cultivo del fruto exocarpio mesocarpio
Sarylop Smyrna USA Grande Verde/Amarillo mbar D
Turqua
Sierra Comn USA Grande Amarillo Rosa claro F
Siyah Smyrna Irn Mediano Morado Rosa/Rojo F
Siyah Comn Turqua Grande Morado Rosa oscuro F
incir
Siyah Comn Turqua Pequeo Morado/Negro Rojo F
orak
Sultani Comn Egipto Mediano Morado/Caf Rosa F/D
Turqua
Verde Smyrna Italia Pequeo Rojo mbar D
Tsapela Smyrna Grecia Mediano Amarillo mbar D
Yesilguz Smyrna Turqua Grande Verde claro Rojo oscuro F
Zard Comn Irn Grande Amarillo Amarillo F
peazi Marruecos
Zidi Smyrna Turqua Muy Morado/Negro Rojo F/D
grande
Fuente: Elaboracin propia con informacin tomada de Condit (1955), Storey (1977), Piga et al. (2003),
Koyuncu (2004), Flaishman et al. (2008), El-Gharably et al. (2009), Sen et al. (2010),
Xanthopoulos et al. (2010). *F: fresco, F/D: fresco y deshidratado, D: deshidratado.

18
 Adriatic Black Mission

Brown Turkey Conadria

Kadota Sarylop

Figura 3. Variedades de higo de mayor valor comercial en el mundo. La figura es de elaboracin propia
y fue adaptada con imgenes tomadas de diferentes sitios web: [Link]
[Link], [Link] [Link]
[Link] [Link] [Link]

19
 2.6. Propiedades nutritivas y nutracuticas del higo

El higo contiene sustancias nutritivas como las vitaminas, minerales, carbohidratos,

protenas y fibra diettica, que ayudan al crecimiento y desarrollo en nios (Cuadro
2). La proporcin de cada componente vara de acuerdo con factores diversos, como
las condiciones edafoclimticas del cultivo, la especie, la variedad y la etapa de
desarrollo del fruto (Baccaunaud et al., 1995; Ersoy et al., 2007).

Cuadro 2. Composicin qumica de frutos de higo fresco y deshidratado.

Nutriente Cantidad (100 g de porcin)
Fruto fresco Fruto deshidratado
Vitamina A 2.0 mg 0.0 mg
Vitamina C 2.0 mg 1.0 mg
Vitamina B6 0.11 mg 0.11 mg
Calcio 35.0 mg 162.0 mg
Potasio 232.0 mg 680.0 mg
Magnesio 17.0 mg 68.0 mg
Sodio 1.0 mg 10.0 mg
Fierro 0.07 mg 67.0 mg
Fsforo 14.0 mg 167.0 mg
Zinc 0.15 mg 0.55 mg
Carbohidratos 19.18 g 63.87 g
Protenas 0.75 g 3.30 g
Fibra diettica 2.90 g 9.80 g
Agua 79.11 % 30.05 %
Cenizas 0.66 g 1.86 g
Valor energtico 74.0 kcal 249.0 kcal
Fuente: INCAP (2012).

20
En frutos de higo maduros de las variedades Bursa Siyahi, Jemaoui, Magouli,
Rogabi, Wedlani y Zidi, las sustancias nutritivas ms abundantes son la glucosa
(3.49), fructosa (2.54), y los minerales como el calcio (162.0-295.86), magnesio
(68.0-71.64), potasio (680.0-739.75), fsforo (67.0), sodio (10.0-28.95), fierro (2.03),
y zinc (1.25), mg por 100 g de materia seca (Aljane et al., 2007; Ersoy et al., 2007).

El higo no contiene grasa ni colesterol, y es fuente de benzaldehdo, un compuesto

anticancergeno (Slavin, 2006). El valor energtico elevado del higo (74 kcal),
derivado de su contenido de azcares, convierten al fruto de higo en un producto
energizante, ideal para el consumo de personas con desgaste fsico, nios en
crecimiento, estudiantes y deportistas (USDA, 2005).

El estudio de las propiedades nutracuticas del higo, como los fenoles y

antocianinas, ha cobrado importancia debido a que mejoran la calidad de vida del
humano, manteniendo niveles adecuados de salud y previniendo enfermedades
crnicas (Vinson, 1999; Piga et al., 2008; El Gharras, 2009). En higos frescos, los
compuestos fenlicos varan de 1000 a 1100 mg kg-1 (Vinson, 1999), y las
antocianinas se presentan en cantidades de 162 mg kg-1 (Aguilera et al., 2009). En
particular, la variedad Black Mission posee los contenidos ms altos de antocianinas,
por lo que est considerada como la variedad que presenta la capacidad antioxidante
ms elevada (36 %) de todos los tipos de higueras y colores del fruto (Solomon et al.,
2006).

2.7. Indicadores de cosecha del higo

El color y la firmeza del fruto de higo son los indicadores de cosecha ms

importantes (Celikel y Karacali, 1998; Oezeker y Isfendiyaroglu, 1998; Brien y Hardy,
2002; Rodov et al., 2002; Souza y Ferraz, 2005; Colares y De Oliveira, 2009). Los
frutos deben ser cosechados cuando alcanzan la madurez completa. Cuando el fruto
se destina al consumo en fresco, debe estar completamente coloreado y firme.

21
Cuando se usa para deshidratacin solar, en algunos lugares como Turqua o
Marruecos, se deja madurar en el rbol hasta que se desprenda por si solo (Brien y
Hardy, 2002).

En las variedades de higo conocidos como Bardacik, Cicek, Ciftlikkoy, Kurabakunya,

Irimor, Ovacik y Yesilkapli, la firmeza del fruto vara de 0.20 a 1.20 kg cm-2 (Oezeker
y Isfendiyaroglu, 1998). Las diferencias se atribuyen a la geometra asimtrica,
cavidad interna (a mayor tamao menor calidad), contenido de fibra, tipo de tejido y
resistencia mecnica del fruto, que en general es baja (Souza y Ferraz, 2005).

En particular, el mejor indicador para la cosecha de frutos de higo de la variedad

Roxo de Valinhos, es una deformacin del 10 % con respecto a la forma original del
fruto (Colares y De Oliveira, 2009). Para Black Mission, el criterio ptimo es un color
entre morado claro y oscuro, sintindose suaves al tacto con ligera presin; mientras
que para los higos tipo Smyrna, el color debe ser blanco amarillento o amarillo claro
y ser completamente firmes (Crisosto et al., 2002). La variedad Brazilian presenta
diferentes indicadores de cosecha, dependiendo de la poca del ao, siendo
conveniente recolectarlo en verano, cuando desarrolla de un 70 a 90 % de coloracin
morada y son firmes. En otoo, los frutos deben exhibir ms de un 90 % de color
morado y ser un poco suaves (Rodov et al., 2002).

En los principales pases productores de higo, en la mayora de las variedades, el

momento ptimo para la cosecha es cuando la piel se agrieta. Sin embargo, por
cuestiones de apariencia, los consumidores prefieren frutos sin rajaduras, lo que
obliga a que la infrutescencia se coseche en madurez fisiolgica. El agrietamiento
coincide con la madurez de consumo, pero si no se consume se debe deshidratar
para que pueda almacenarse (Melgarejo, 2000).

22
 2.8. Fisiologa y vida de anaquel del higo

El higo pertenece al grupo de los frutos climatricos. Su tasa de respiracin y

produccin de etileno es moderada, con valores de 10 a 20 mg CO2 kg h-1 y de 1 a
10 l C2H4 kg h-1, respectivamente (Kader, 2002). Cuando el fruto est
completamente maduro es exageradamente suave, altamente perecedero y muy
susceptible a daos mecnicos, por lo que su vida de anaquel es de dos das cuando
ms (Venditti et al., 2005).

En primavera, despus de la cosecha, los frutos de higo muestran un

comportamiento climatrico, con cambios en color, firmeza y contenido de slidos
solubles; pero en otoo, muchos de esos cambios no ocurren, porque son
o
fuertemente afectados principalmente por las temperaturas inferiores a 10 C
(Melgarejo, 2000). En general, la sntesis de azcares se incrementa
significativamente en el fruto dos semanas antes de la cosecha (Yahata y Nogata,
1999).

La principal restriccin para la comercializacin del fruto fresco es su corta vida de

anaquel, la cual no supera los dos das debido principalmente al acelerado proceso
de maduracin y crecimiento de patgenos (Venditti et al., 2005), a tcnicas de
cosecha (manual o mecnica), a transporte, empaque y condiciones de
almacenamiento inadecuadas como frutos a granel, sin empaque, a temperatura y
humedad relativa ambiental (Lima et al., 2005).

Los frutos de higo que se almacenan a 15 oC durante una semana, presentan un

rpido ablandamiento de los tejidos, disminucin de azcares totales, firmeza del
fruto, y decoloracin de la piel cuatro das despus de la cosecha, comparados con
los frutos almacenados a 5 oC, los cuales disminuyen su firmeza y contenido de
azcares totales lentamente (Yahata y Nogata, 2000). Por otro lado, los frutos
almacenados a 2 y 8 oC y 90 % de humedad relativa durante dos semanas,
disminuyen su peso entre un 10.1 y 16.9 % (Venditti et al., 2005).

23
El uso de pelculas plsticas como empaque en frutos de higo fresco, almacenados a
1 oC y 70 % de humedad, permiten almacenar los frutos por 15 das, adems de
conservar el aspecto externo y textura del fruto. En contraste, los frutos refrigerados
bajo las mismas condiciones de almacenamiento sin empaque, despus de 10 das
presentan altos valores de jugosidad (Gawade y Waskar, 2005).

Las atmsferas modificadas con 60, 70, 80 y 90 % de CO2, permiten alargar la vida
de anaquel por 30 das, retardar la tasa de ablandamiento, y conservar la apariencia
visual de frutos de higo de la variedad Masudohin, almacenados a 0 oC, sin afectar el
contenido de acidez y slidos solubles (Park y Jung, 2000). En frutos de la variedad
Craxiou de Porcu, las atmsferas modificadas con 100 % de CO2 o N2, mantienen la
frescura de los frutos durante una semana y disminuyen las prdidas postcosecha de
un 30 a 55 % (D'Aquino et al., 1998).

Con atmsferas controladas a altas concentraciones de CO2 disminuye la velocidad

de respiracin y la tasa de produccin de etileno, pero incrementa la produccin de
etanol y acetaldehdo en higos tipo Calymirna y Black Mission (Colelli y Kader, 1994).
Para conservar buena calidad de estas variedades, se recomienda almacenarlos a
temperaturas de 0 a 5 oC, en atmsferas enriquecidas con 15 a 20 % de CO2 (Colelli
y Kader, 1991).

Las bajas concentraciones de O2 (2 %) y altas concentraciones de N2 (98 %), son

ms efectivas en la conservacin de frutos de higos de la variedad Mavra (de color
o
morado), almacenados a -1 C. Bajo estas condiciones de almacenamiento,
disminuye la velocidad de respiracin y la tasa de produccin de etileno, se mantiene
la firmeza y los cambios en coloracin de la pulpa o la piel, y los cambios en
contenido de slidos solubles y acidez titulable no son significativos (Tsantili et al.,
2003). Se debe tomar en cuenta que el tiempo de conservacin de los frutos vara en
funcin de la temperatura, humedad relativa, composicin de la atmsfera
seleccionada, la variedad y la etapa de maduracin del fruto (Kader, 2003).

24
 2.9. Control de microorganismos en higo

El mtodo de control predominante de microorganismos en higos frescos sigue

siendo el qumico. Sin embargo, existe una tendencia a utilizar mtodos alternativos
y sustancias que no causan daos en la salud humana ni en el medio ambiente,
como los llamados compuestos seguros (Cuadro 3). Estos compuestos, conocidos
en Ingls como GRAS (Generally Recognized as Safe), son utilizados para el control
de microorganismos en frutos frescos y como tratamientos microbianos pre y pos
deshidratacin, para la conservacin de los frutos por periodos prolongados (Lima et
al., 2005; Venditti et al., 2005).

Los compuestos seguros, como el carbonato de sodio (Na2CO3) y cido actico

(CH3COOH) en concentraciones de 0.5 al 3 %, han sido utilizados en la variedad de
higo Craxiou de Porcu como posibles alternativas para el control de Botritys cinerea,
previo al almacenamiento de los frutos frescos (2 y 8 oC y 90 % de humedad relativa)
por dos semanas. El bicarbonato de sodio (NaHCO3) al 0.5 %, cloruro de calcio
(CaCl2) al 3 %, y cido actico (CH3COOH) al 1 %, se han probado en frutos de
chabacano, granada, kiwi y naranja. En todos los casos, los tratamientos han sido
exitosos, logrando reducir en forma significativa las prdidas postcosecha causadas
por pudricin o sobremaduracin del fruto. Adems, el cloruro de calcio gener un
incremento variable en la firmeza (Antunes et al., 2007).

El agua caliente (30 oC por 65 min y 80 oC por 16 min) combinada con perxido de
hidrgeno (H2O2) al 2.5 %, se han utilizado para controlar la carga microbiana en
frutos de higo de la variedad Sarylop. Sin embargo, no se ha alcanzado un buen
control de los microorganismos, pues la cantidad de bacterias encontradas en los
frutos es elevada (2.20-2.73 cfu g-1), y no hay ningn control sobre levaduras (26.5
cfu g-1) (Demirbuker et al., 2004).

25
Cuadro 3. Mtodos de control de microorganismos en pre y postcosecha de higo.
Mtodo Concentracin/ Tiempo Forma de Patgenos Eficiencia
T (o C ) aplicacin controlados (%)
Compuestos
seguros
Na2CO3 0.5-3 % NR NR B. cinerea 90-98
C2H4O2 25-100 ppm NR NR B. cinerea 90-98

Calor 30 C 65 min Inmersin Bacterias 0

80 C 16 min Inmersin mesoflicas 0

Calor y 80 C 16 min Inmersin Levaduras 3-40

H2O2 2.5 %

Ozonificacin 1-10 ppm 3-5 h Vaco Bacterias 16-100

mesoflicas
Coliformes, 11-70
Levaduras y
hongos

0.1-1.0 ppm 1h Vaco E. coli 8-50

1-9 ppm 1h Vaco B. cereus 57-64

Rayos Uv NR 1-2 h Radiacin Hongos 94 %

toxgenos
Fuente: Elaboracin propia con informacin tomada de Antunes et al. (2003); Demirbuker et al. (2004);
Venditti et al. (2005); Molinu et al. (2006); Oztekinet al. (2006); Antunes et al. (2007); Isman y
Biyik (2008); Yelsicimen y Ozdemir (2008).

En general, la efectividad que se logra en el control de levaduras, hongos y bacterias

de los frutos de higo, depende de las caractersticas del tratamiento que se utilice, la
dosis de aplicacin de las sustancias utilizadas, y el tiempo de exposicin del fruto.
Se sugiere evitar el contacto de los frutos cosechados con el suelo, ya que ah se
aloja una gran cantidad de esporas de diferentes microorganismos (Karaca y Nas,
2008).

26
 2.10. Cultivo del higo en Mxico

La higuera es una especie vegetal tolerante a la sequa que ofrece muchas ventajas
de produccin en amplias regiones ecolgicas de Mxico. Despus de su
introduccin en nuestro pas por los misioneros espaoles (Storey, 1977), la higuera
se convirti en un componente importante de los huertos familiares (Parra, 1996). La
planta crece en toda la Repblica en forma de poblaciones naturales. Sin embargo,
es cultivada a campo abierto en condiciones de secano solo en algunos estados
(Figura 4). Desde 1980, la superficie sembrada (ha) y la produccin (Ton) de higo a
nivel nacional ha sufrido fluctuaciones, debido a que la poca de cosecha del fruto
(junio-julio) coincide con la poca de lluvias, lo que favorece la infeccin por
patgenos y causando prdidas de biomasa, cambios de color, sabor y textura del
fruto, y prdidas postcosecha hasta del 50 % (Snchez y Martnez, 1987; Chimi et
al., 2008).

Figura 4. Distribucin actual del cultivo de la higuera con fines comerciales en la Repblica Mexicana.
La figura es de elaboracin propia y fue adaptada con informacin tomada del SIAP (2011) e
imgenes tomadas del sitio web ([Link]

27
Para disminuir las prdidas postcosecha elevadas de higo, los productores
tradicionalmente recurren a la cristalizacin de los frutos. Este mtodo postcosecha
ha resultado ser eficiente para conservar los frutos por ms tiempo, extender su
periodo de comercializacin, e inhibir el desarrollo de microorganismos. Sin
embargo, las principal desventaja de la cristalizacin es que eleva la cantidad de
azcares totales de los frutos y adems los frutos presentan un contenido mineral
escaso, debido a que son cosechados antes de la madurez comercial (Snchez y
Martnez, 1987).

Actualmente, los principales productores de higo a campo abierto son los estado de
Morelos (851 ha), Baja California Sur (278 ha), Hidalgo (53 ha), Veracruz (40 ha), y
el Distrito Federal (23 ha). La produccin anual estimada es de 3,642 Ton, y el
rendimiento promedio es de 4.48 Ton ha-1 (SIAP, 2011). Esta produccin no es
suficiente para satisfacer la demanda nacional, por lo que se recurre a la
importacin, principalmente de fruta deshidratada. Las principales razones por las
que la produccin de higo se ha mantenido estancada (Cuadro 4) han sido la
ausencia de tecnologas para el manejo agronmico y el manejo postcosecha del
cultivo, as como la falta de capacitacin a productores (Snchez y Martnez, 1987).

Cuadro 4. Comportamiento de la produccin de higo en Mxico durante los ltimos

30 aos.
Ao Superficie Produccin Rendimiento
sembrada (ha) (Ton) (Ton ha-1)
1980 4,126 24,975 6.2

1990 787 3,059 4.3

2000 1,1170 2,425 2.9

2010 1201 3,640 4.4

Fuente: Elaboracin propia con informacin tomada del SIAP (1980-2010).

28
El cultivo en invernadero podra ser una alternativa para incrementar la produccin
de higo y satisfacer la demanda nacional. En Espaa, la implementacin de los
sistemas modernos de la agricultura protegida han permitido incrementar el
rendimiento de 4.5 Ton ha-1 a campo abierto a 81.0 Ton ha ao-1 bajo invernadero
(Melgarejo et al., 2007).

En Mxico, el cultivo de higo bajo cubierta plstica ha sido explorado desde

mediados del 2008, pero solamente a nivel experimental, en Texoco, estado de
Mxico. Los sistemas de produccin consistan en el establecimiento del cultivo en
suelo a baja densidad, en invernaderos rsticos con fertilizacin manual y aplicacin
de riego rodado. Sin embargo, con estos sistemas fue posible obtener 120 Ton de
fruto por hctarea por ao (Mendoza, 2009).

En los sistemas de produccin rsticos, las tuzas (Geomys arenarius) y las aves se
convirtieron en una plaga importante que redujeron drsticamente la densidad de
plantacin y el rendimiento de higo (Mendoza, 2009). Por este motivo, los sistemas
de produccin de higo a nivel experimental han ido evolucionado. Actualmente, las
plantas son cultivadas en macetas con diferentes sustratos y sistemas de fertirriego
para evitar las prdidas por tuzas y como sistema innovador, lo que ha permitido
incrementar la produccin y cosechar fruta durante todo el ao.

2.11. Caracterizacin de higo con base en atributos morfolgicos

Para la caracterizacin morfolgica de especies y variedades, generalmente se

utilizan las guas internacionales del IPGRI o de la UPOV (International Union for the
Protection of New Varieties of Plants) (IPGRI, 2003; Gallegos et al., 2005). Entre
1980 y el 2003, el IPGRI desarroll guas tcnicas para la caracterizacin estndar
de atributos morfolgicos de 89 cultivos distintos, incluyendo al aguacate, arroz,
avena, caf, ctricos, durazno, fresa, frijol, higo, maz, manzana, papa, papaya, pia,

29
sorgo, soya, y tomate. Estas guas contemplan la caracterizacin morfolgica de las
plantas con base en 6 tipos de descriptores:

1. Biolgicos: tipo de polinizacin, longitud del periodo de polinizacin, periodo del

amarre de frutos, fecha de maduracin, periodo de cosecha y principio de
defoliacin de la planta.

2. De crecimiento: hbito de crecimiento, vigor de la planta, nmero de ramas,

dominancia apical, formacin de brotes laterales, estacin de crecimiento de los
brotes laterales, forma, longitud, dimetro y color de las yemas terminales y
capacidad de enraizamiento de los brotes.

3. De la hoja: nmero de hojas por tallo, forma de la hoja, de la base y del mrgen
de la hoja, nmero de lbulos, forma de los lbulos, longitud, dimetro y rea de
la hoja, color de la hoja, venacin de la hoja, longitud, dimetro y color del
peciolo.

4. Del fruto: color del exocarpio y mesocarpio, forma, tamao, longitud y dimetro y
color del fruto, forma del pice del fruto, tamao, color y grado de adhesin del
ostiolo, forma, tamao de la cavidad, longitud del cuello, longitud y grado de
abscisin del pednculo, facilidad de pelado, presencia de estras, presencia de
lenticelas, tamao y color de las lenticelas, color del albedo, sabor, jugosidad,
firmeza, contenido de slidos solubles totales y acidez total (IPGRI, 2003).

5. Agronmicos: nmero de hojas por rama, nmero de ramas por tallo, longitud
del tallo, longitud de las ramas, nmero de frutos por rama, fechas de poda,
rendimiento por rbol, rendimiento por hectrea, rendimiento entre los 3 y 5 aos.

6. Susceptibilidad a estrs bitico y abitico: resistencia a temperaturas altas o

bajas, resistencia a sequa, salinidad y plagas y enfermedades.

30
La caracterizacin morfolgica se debe realizar en plantas que crecen bajo un mismo
ambiente, en las que se hayan detectado caracteres distintivos de importancia en la
diferenciacin de especies y variedades. En caso de que las plantas no produzcan
alguna caracterstica importante para su diferenciacin, pueden ser llevadas a un
ambiente distinto en donde puedan expresar rasgos caractersticos que permitan
diferenciarlas (Gallegos et al., 2005).

La morfologa reflejada por los frutos de higo se debe en parte a las condiciones del
medio ambiente en que se han desarrollado y evolucionado (Condit, 19955; Storey,
1977). Sin embargo, no se descarta la posibilidad de que algunas de esas
caractersticas se hayan generado por cambios evolutivos recientes, tal como sucede
en el caso de las cactceas (Bravo, 1978).

2.12. Caracterizacin de higo con base en marcadores moleculares

La caracterizacin gentica de plantas en general ha sido mejorada a travs del uso

de tcnicas de biologa molecular, como los marcadores bioqumicos y moleculares,
caracteres citolgicos, y la identificacin de genes (Arulsekar y Parfitt, 1986; IPGRI,
2003; Satwar, 2012).

Los marcadores bioqumicos se basan en el uso de isoenzimas como la cido

fosfatasa (ACPH), esterasas and (EST A and B), isocitrato deshidrogenasa
(ICD), malato deshidrogenasa (MDH), fosfogluconato deshidrogenasa (PGD),
fosfoglucosa isomerasa (PGI), fosfoglucosa mutasa (PGM) y peroxidasas (Arulsekar
y Parfitt, 1986).

Los marcadores moleculares son diversos. Al menos 40 tipos de marcadores han

sido descritos. Los ms comunes son los RFLPs, RAPDs, ISSRs, AFLPs y
Microsatlites (Semagn et al., 2006; Sarwat, 2012). Cada tipo de marcadores
presenta ventajas y desventajas, las cuales pueden ser utilizadas con base en los

31
objetivos y la precisin que se desea obtener en la investigacin (Semagn et al.,
2006). Estos cinco tipos de marcadores han sido utilizados en higo en estudios de
genotipificacin, diversidad gentica de plantas silvestres o tipo Caprifig, estimacin
de diferencias genticas y seleccin de clones de inters, identificacin de especies
y variedades, y determinacin de relaciones filogenticas (Galderisi et al., 1999;
Cabrita et al., 2001; De Masi et al., 2003; Khadari et al., 2003; Giraldo et al., 2005;
Khadari et al., 2005; De Masi et al., 2005; Guasmi et al., 2006; Chatti et al., 2007;
Mallikarjuna et al., 2010; Dalkilic et al., 2011).

Los caracteres citolgicos consideran principalmente el nmero de cromosomas y el

nivel de ploida de la especie estudiada, mientras que la identificacin de genes se
basa en la secuenciacin de genes especficos que controlen alguna caracterstica
de inters particular (IPGRI, 2003).

Particularmente en higo, la identificacin o diferenciacin de especies y variedades

se ha mejorado mediante anlisis de huellas de ADN (Khadari et al., 2003; Guasmi et
al., 2006; Jabbarzadeh et al., 2010; Khaled et al., 2010; Mallikarjuna et al., 2010;
Hassan et al., 2011; Palai y Rout, 2011; Sarwat, 2012). La deteccin de huellas de
ADN requiere de la tcnica de electroforesis para separar las molculas en funcin
de su peso molecular, a travs de una matriz semislida que normalmente es
agarosa o poliacrilamida (Garca, 2000; Osorio et al., 2005).

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40
 III. DIVERSIDAD MORFOLGICA DE HIGOS (Ficus carica L.) EN MXICO

3.1. Resumen

El higo comn (Ficus carica L.) crece en poblaciones naturales y cultivadas en todos
los estados de la Repblica Mexicana. Sin embargo, la diversidad gentica existente
en el pas es completamente desconocida, y no existen parmetros para la
caracterizacin fenotpica o gentica de poblaciones de higo. Ante la falta de
informacin, se cree que los higos mexicanos pertenecen a la variedad espaola
Black Mission. En este estudio, nosotros presentamos una caracterizacin
morfolgica de seis poblaciones de higos mexicanos basada en una combinacin de
atributos cualitativos y cuantitativos del fruto. Nuestros resultados muestran que
despus de cientos de aos los higos negros se han adaptado a condiciones
ambientales locales en el centro de Mxico, generando con ello variedades
claramente distintas que representan diversidad morfolgica valuable y previamente
no descrita. Las principales diferencias morfolgicas entre las poblaciones
mexicanas de higo identificadas en este estudio son el tamao o peso del fruto, el
color de la pulpa, y la longitud del cuello y la forma del pednculo. Con base en estos
resultados sugerimos que las poblaciones descritas en este estudio son variedades
naturales de higo, y les asignamos un nombre que las identifica con su lugar de
origen. La caracterizacin morfolgica que presentamos aqu establece las bases
para la futura caracterizacin agronmica y molecular de variedades de higo.

Palabras clave: diversidad morfolgica, variedades de higo, atributos cualitativos y

cuantitativos del fruto.

41
 MORPHOLOGICAL DIVERSITY OF FIGS (Ficus carica L.) IN MEXICO

3.2. Abstract

The common fig (Ficus carica L.) grows in natural and cultivated populations in all the
states of the Mexican Republic. However, the natural diversity that exists in this
species is completely unknown, and parameters for the phenotypic or genetic
characterization of fig populations do not exist. Due to the lack of information, it is
believed that Mexican figs belong to the Spanish variety Black Mission. In this study,
we present a morphological characterization of six Mexican fig populations based on
qualitative and quantitative fruit traits. Our results show that after hundreds of years of
cultivation, black figs have been adapted to the local environmental conditions of the
Central Mexico region, yielding this in several clearly distinct varieties, which
represent valuable and previously undescribed morphological diversity. The main
morphological differences identified in this study among Mexican fig populations are
the fruit size or weight, color of the pulp, length of the neck, and the shape of the
stalk. Based on these results we suggest that the populations described in this study
are native fig varieties, and we assigned to them a name that identifies their place of
origin. The morphologic characterization that we present in this study establishes the
basis for further agronomic and molecular characterization of fig varieties.

Key words: morphological diversity, fig varieties, qualitative and quantitative fruit
traits.

42
 3.3. Introduccin

El fruto de higo (Ficus carica L.) es importante en la alimentacin humana por su

contenido de protenas, vitaminas, minerales, carbohidratos y fibra diettica (Aljane
et al., 2007; Ersoy et al., 2007; INCAP, 2012). El contenido de protenas vara de
0.75 a 3.30 g por 100 g de porcin comestible (INCAP, 2012). Las vitaminas ms
abundantes en los frutos de higo son la vitamina A (2.0 mg), vitamina B6 (0.11 mg) y
vitamina C (2.0 mg por 100 g de porcin comestible) (INCAP, 2012). Los minerales
como el calcio (35.0 a 162.0 mg), potasio (232.0 a 680.0 mg), magnesio (17.0 a 68.0
mg), sodio (1.0 a 10.0 mg), fierro (0.07 a 67.0 mg), fsforo (14 a 167.0 mg), y zinc
(0.15 a 0.55 mg) por 100 g de porcin comestible, son los nutrientes que se
encuentran en mayor proporcin en los frutos (Aljane et al., 2007; INCAP, 2012). Los
principales carbohidratos del fruto son la glucosa (3.49 mg) y fructosa (2.54 mg por
100 g de materia seca) (Ersoy et al., 2007). La fibra diettica de los frutos vara de
2.90 a 9.80 mg por 100 g de porcin comestible (INCAP, 2012). El valor energtico
elevado del higo (74.0 a 249.0 kcal), derivado de su contenido de azcares, convierte
al fruto de higo en un producto energizante, ideal para el consumo de personas con
desgaste fsico, nios en crecimiento, estudiantes y deportistas (USDA, 2005).

Los frutos de higo no contienen grasa ni colesterol y son fuente de benzaldehdo, un

compuesto anticancergeno (Slavin, 2006), y antioxidantes (Vinson, 1999; Slavin,
2006; Aguilera et al., 2009). En particular, la variedad Black Mission posee los
contenidos ms elevados de antocianinas, por lo que est considerada como la
variedad que presenta la capacidad antioxidante ms elevada (36.0 %) (Solomon et
al., 2006) de todos los tipos (Comn, Smyrna, Caprifig y San Pedro) y ms colores
de frutos de higo (negro, rojo, verde, amarillo y caf) (Toribio y Montes, 1996;
Melgarejo, 2000; Solomon et al., 2006; Ilgin et al., 2007). Los antioxidantes
desarrollan funciones nutracuticas que mejoran la calidad de vida del humano,
manteniendo niveles adecuados de salud y previniendo enfermedades crnicas
(Vinson, 1999; Piga et al., 2008; El Gharras, 2009). Por todas estas propiedades, el

43
higo es considerado como uno de los frutos ms saludables y nutritivos (Piga et al.,
2003; Slavin, 2006).

Los frutos de higo se consumen como fruta fresca, deshidratada o industrializada, en

forma de jugos, mermeladas, pastas, vinos y licores (Piga et al., 2003; Slavin, 2006).
Medicinalmente, las hojas de la planta son utilizadas como analgsico,
antimicrobiano cicatrizante, desinflamante, desparasitante, expectorante, laxante y
reafirmante (Goor, 1965; Grivetti y Applegate, 1997). Tambin son utilizadas en
tratamientos de alopecia, eliminacin de verrugas e infertilidad de la mujer. Por esta
razn, los griegos consideran a la higuera como un smbolo de fertilidad (Goor, 1965;
Grivetti y Applegate, 1997).

Los frutos de higo, llamados infrutescencias, son siconos blandos de sabor muy
dulce, cubiertos por un exocarpio muy delgado de colores variados como negro, rojo,
verde, amarillo o caf, segn la variedad (Solomon et al., 2006). Las infrutescencias
contienen pequeos aquenios que semejan semillas, pero son en realidad los frutos
verdaderos (Melgarejo, 2000). El receptculo floral se hincha y se vuele carnoso por
la fecundacin, desarollando brevas o higos, segn la fecha de maduracin, pero no
existen diferencias genticas ni morfolgicas entre brevas e higos, solo la
diferenciacin temporal en su desarrollo y maduracin (Flaisman et al., 2008).
Morfolgicamente, las infrutescencias pueden ser ovoides o piriformes (IPGRI,
2003). Cuando la cosecha es compacta, las infrutescencias conservan la forma y el
tamao. En contraste, cuando la cosecha es abundante, se pueden encontrar
infrutescencias de diferentes formas y tamaos (Flores, 1990). El periodo de cosecha
vara segn el tipo de higuera cultivada. Al final de este periodo, la planta se defolia y
entra en reposo. En ambientes benignos, con temperaturas de 10 oC, las yemas
pueden permanecer en el rbol durante el invierno y continuar su crecimiento en la
primavera. Por esta razn, en un mismo brote se pueden encontrar brevas en ramas
del ao anterior e higos en ramas en crecimiento anual. La temperatura, fotoperiodo
y humedad relativa afectan el tamao del fruto y el desarrollo del color (Flaishman et
al., 2008).

44
La caracterizacin morfolgica de especies y variedades de higo se basa en
atributos cualitativos y cuantitativos del fruto (IPGRI, 2003). Las caractersticas
evaluadas ms importantes son el tamao o peso del fruto, longitud, dimetro, color
del exocarpio y mesocarpio, firmeza, tamao del ostiolo, tamao de la cavidad,
longitud del cuello, y forma del pednculo (IPGRI, 2003; Ersoy et al., 2008; Aljane y
Ferchichi, 2009). A nivel internacional, las variedades comerciales conocidos como,
Black Mission, Bursa Siyahi, Conadria, Deanna, Kimy, Niedda Longa, Mattalona, San
Pietro, Sarylop, Verde y Tsapela, han sido caracterizadas morfolgicamente (Piga et
al., 2003; Babalis y Belessiotis, 2004; Koyuncu, 2004; Gawade y Waskar, 2005;
Xanthopoulos et al., 2007; Flaishman et al., 2008; El-Gharably et al., 2009; Piga y Del
Caro, 2009; Sen et al., 2010). De todas estas variedades, solo Black Mission
pertence al tipo de los higos comunes o partenocrpicos, mientras que las dems
variedades pertenecen a los higos tipo Smyrna o de polinizacin cruzada (Condit,
1955; Storey, 1977). La variedad Black Mission se cultiva principalmente en
California, Estados Unidos (Storey, 1977; CFAB, 2011), y se caracteriza por producir
higos piriformes de 3.81 a 7.5 cm de longitud y 5.08 cm de dimetro, de tamao
mediano, con peso de 25.0 a 56.0 g, con exocarpio negro y mesocarpio rosa; de
excelente calidad, sabor y dulzura; con contenido de SST de 14.3 a 22.5 % (Condit,
1955; Storey, 1977; CFAB, 2011; King et al., 2012).

En Mxico, no hay informacin acerca de la diversidad morfolgica de variedades de

higo, por lo que se cree que los higos mexicanos pertenecen a la variedad espaola
Black Mission. Para evaluar la variacin morfolgica entre variedades de higos
negros del centro de Mxico, nosotros realizamos una caracterizacin morfolgica
inicial basada en una combinacin de atributos cualitativos y cuantitativos del fruto.
Nuestros resultados muestran variacin morfolgica del fruto previamente no descrita
entre higos negros de diferentes partes de Mxico. La diversidad en la forma del fruto
no puede ser explicada nicamente por los efectos de las condiciones ambientales, y
proponemos nombres para estas poblaciones basndonos en sus lugares de origen.
Estos resultados establecen las bases para la futura caracterizacin agronmica y
molecular de variedades de higo.

45
3.3.1. Objetivo

Caracterizar poblaciones de higo del centro de Mxico con base en la forma del fruto.

3.3.2. Hiptesis

Ho: La diversidad morfolgica de los frutos de higo provenientes de diferentes partes

del centro de Mxico, no se debe nicamente a los efectos de las diferencias en
las condiciones ambientales.

Ha: La diversidad morfolgica de los frutos de higo provenientes de diferentes partes

del centro de Mxico, se debe a los efectos de las condiciones ambientales.

3.4. Materiales y Mtodos

Material vegetal
Se evaluaron frutos de seis poblaciones de higo del tipo comn o partenocrpicos,
provenientes de diferentes estados del centro de Mxico, en enero del 2011. En los
lugares de origen, las poblaciones son conocidas como Black Mission. Con
propsitos de diferenciacin, nosotros asignamos un nombre a cada uno de las
poblaciones. Las variedades conocidas en Mxico como Neza y Tecmac fueron
seleccionadas por el Maestro Alfonso Muratalla La, del Postgrado de Recursos
Genticos y Productividad del Colegio de Postgraduados Campus Montecillo. Las
cuatro poblaciones identificadas como Ixmiquilpan, Salvatierra, Tetela y Zacapala,
fueron selccionadas por Vctor Mendoza y Mayra Garca, estudiantes del Postgrado
de Recurso Genticos y Productividad-Fisiologa Vegetal, del Colegio de
Postgraduados campus Montecillo. Ninguna de estas poblaciones ha sido descrita en
la literatura previamente.

46
Propagacin y cultivo de las plantas
Plantas de higo de cada una de las seis poblaciones fueron propagadas por estacas de
madera dura, a partir de plantas de tres aos de edad establecidas en suelo en sus
lugares de origen. Las estacas de 25 cm de longitud fueron desinfectadas con Furadn
(0.5 g L-1) y enraizadas con cido indolbutrico (AIB) a 10,000 ppm. El enraizado se
realiz durante 60 das en un microtnel utilizando turba como sustrato. Las estacas
enraizadas fueron transferidas a macetas de plstico soplado de color negro con
capacidad de 40 L, utilizado como sustrato una mezcla de tezontle rojo (45 %), tepojal
(45 %), y vermicomposta (10 %). El arreglo de la plantacin fue de 1.60 m entre hileras
y 0.50 m entre plantas, con una densidad de 1.25 plantas m-2 establecidas en un
invernadero de 1000 m2, en la Universidad Autnoma Chapingo (UACh). La UACh se
encuentra ubicada geogrficamente entre los 19 27 30 latitud norte y 98 54 14
longitud oeste, a una altitud de 2240 m sobre el nivel del mar, en Texcoco, estado de
Mxico. El riego se realiz con un sistema por goteo con emisores autorregulados a 4 L
h-1, con salidas a 4 estacas de 12 cm, con un gasto de 1 L h-1, manejado con un
programador de tiempo (Galcon 8006-AC 6). La frecuencia del riego fue de 3 minutos
por hora, iniciando a las 9 am y concluyendo a las 6 pm. La fertilizacin se manej en
solucin nutritiva en el agua de riego (Cuadro 5). El agua de riego present pH de 7.20
y conductividad elctrica de 0.30 dS m-1. La solucin nutritiva present pH de 5.60 y
conductividad elctrica de 2.61 dS m-1. El pH y la conductividad elctrica fueron
determinados con un potencimetro porttil (Hanna 19380). Las condiciones de humedad
y temperatura prevalecientes en el invernadero durante la conduccin del experimento
(Cuadro 6) fueron registradas cada hora con data logger (Hoboware).

47
Cuadro 5. Solucin nutritiva utilizada para la fertilizacin de plantas de higo de
diferentes partes del centro de Mxico.
Fuente mg L-1 g/1000 L kg/40 m3
Nitrato de calcio 940 940 37.6
Nitrato de potasio 200 200 8.0
Sulfato de potasio 340 340 13.6
Fosfato monoamnico 55 55 2.2
Sulfato de magnesio 490 490 19.6
Sulfato ferroso 15 15 600 g
Sulfato de manganeso 4 4 160 g
Borax 4.5 4.5 180 g
Sulfato de cobre 0.40 0.40 16 g
Sulfato de zinc 0.44 0.44 17.6 g
cido fosfrico 0.067 ml 6 ml 2.7 L
cido sulfrico 0.033 ml 33 ml 1.3 L

Caracterizacin morfolgica del fruto

Las plantas de higo de las seis poblaciones bajo estudio fueron cultivadas en
invernadero bajo las mismas condiciones ambientales (Cuadro 6) y de manejo
agronmico. El muestreo de frutos se realiz en julio del 2012, cuando las plantas se
encontraban a la mitad del periodo de cosecha. Para esto, para cada poblacin, se
seleccionaron al azar 20 frutos maduros provenientes del tercio medio de las
plantas. Un fruto se considera maduro solamente si cumple las siguientes
caractersticas: exocarpio completamente negro, suaves al tacto y con pednculo
curvo. Los frutos fueron cosechados entre las 9:00 y 10:00 horas, e inmediatamente
fueron trasladados al laboratorio de Usos Mltiples del Departamento de Fitotecnia
de la Universidad Autnoma Chapingo, para la evaluacin de las caractersticas
morfolgicas, con base en un grupo de descriptores cualitativos y cuantitativos
establecidos para frutos de higo por el IPGRI (2003). Durante el muestreo de frutos,

48
la temperatura media del invernadero fue de 29.2 oC y la humedad relativa de 78.1
%.

Cuadro 6. Temperatura y humedad relativa prevalecientes en el invernadero,

durante la produccin de higos de diferentes partes del centro de Mxico,
utilizados para la caracterizacin morfolgica de los frutos.
Condicin ambiental Enero-Junio del Julio-Diciembre Enero-Julio del
2011 del 2011 2012
Temperatura (oC)
Mnima 2.50 1.83 3.62
Media 19.33 18.26 18.39
Mxima 48.87 50.44 44.72
Humedad relativa (%)
Mnima 10.58 15.68 18.07
Media 67.10 71.33 71.24
Mxima 95.86 92.95 93.88

Diseo experimental y anlisis estadstico

Para la caracterizacin morfolgica de frutos de higo se utiliz un diseo
experimental completamente al azar con seis tratamientos, formados por las
poblaciones de higo provenientes de diferentes estados del centro de Mxico: 1
(Ixmiquilpan), 2 (Salvatierra), 3 (Tecmac), 4 (Tetela), 5 (Neza) y 6 (Zacapala), con
20 repeticiones cada uno. La unidad experimental fue un fruto. Los datos de las
variables cuantitativas fueron sometidos a pruebas de normalidad (Kolmogorov-
Smirnov) y de homogeneidad de varianzas (Bartlett) en el paquete estadstico SAS.
Se verific que los datos cumplieran con los supuestos bsicos del anlisis de
varianza. Se realiz un anlisis de varianza y pruebas de comparacin de medias
con la prueba de Tukey (P 0.05), en el paquete estadstico SAS (SAS, 1999-2000,
versin 8.1). La representacin grfica de los datos fue realizada en el programa
SigmaPlot (versin 10.1) para computadora personal.

49
Variables respuesta
Forma del fruto. Ovoide o piriforme.
Forma del pice del fruto. Redondo, plano o cnico.
Tamao del ostiolo. Pequeo, mediano, grande o muy grande.
Tamao de la cavidad. Ninguna, muy pequea, pequea, mediana o grande.
Color de la pulpa. Blanca/amarilla, mbar, rosa, roja o roja/prpura.
Color del albedo. Ninguno, claro o intenso.
Firmeza. Suave, media, firme.
Facilidad de pelado. Fcil, media, difcil.
Forma del pednculo. Largo y delgado, corto y grueso o largo y grueso.
Abscisin del pednculo. Fcil o difcil.
Biomasa fresca (g). Los frutos fueron pesados individualmente en balanza
granataria electrnica (OHAUS, con precisin de 0.1 g).
Longitud y dimetro (cm). Los frutos fueron medidos individualmente con vernier
digital (Mitutoyo, Japn).
Longitud del cuello (cm). Los frutos fueron medidos individualmente en la parte
del cuello con vernier digital (Mitutoyo, Japn).

3.5. Resultados y Discusin

Caracterizacin morfolgica del fruto con base en atributos cualitativos

En un esfuerzo por registrar la diversidad natural de higo en Mxico, nosotros
establecimos una coleccin de germoplasma en la Universidad Autnoma Chapingo,
en el estado de Mxico. Esta es la primera y nica coleccin de higo en Mxico, y
actualmente consta de seis poblaciones originarias de diferentes estados del centro
de Mxico. Las plantas fueron cultivadas en un invernadero del Mdulo de
Horticultura del Departamento de Fitotecnia. En sus lugares de origen, las
poblaciones son conocidas como Black Mission. Sin embargo, la caracterizacin
morfolgica del fruto (Cuadro 7) mostr que existe gran variacin natural entre
poblaciones.

50
 Cuadro 7. Caractersticas del fruto de diferentes poblaciones de higo del centro de
Mxico.
Descriptor Poblacin
Ixmiquilpan Salvatierra Tecmac Tetela Neza Zacapala
Origen Hgo Gto Edo. Mx Mor Edo. Mx Pue
Forma Piriforme Piriforme Ovoide Ovoide Piriforme Ovoide
pice Redondo Redondo Plano Redondo Redondo Redondo
Tamao Pequeo Pequeo Pequeo Mediano Grande Pequeo
del ostiolo
Tamao de Ninguna Muy Ninguna Mediano Pequeo Grande
la cavidad pequea
Color de la Roja Roja Amarilla Rosa Roja Roja
pulpa
Color del Claro Claro Ninguno Claro Claro Claro
albedo
Firmeza Firme Media Firme Media Suave Firme
Facilidad Media Fcil Difcil Media Fcil Difcil
de pelado
Forma del Largo y Corto y Corto y Largo y Largo y Corto y
pednculo delgado grueso grueso delgado grueso grueso
Abscisin Difcil Fcil Fcil Difcil Fcil Difcil
del
pednculo

Las principales diferencias entre poblaciones son el tamao o peso del fruto, la forma
del fruto y la longitud del cuello del fruto (Figura 5). El clima juega un papel muy
importante en la expresin de las caractersticas morfolgicas de las plantas (Price y
White, 1902; Storey, 1977). Las poblaciones de higo descritas en este trabajo fueron
cultivadas bajo las mismas condiciones ambientales. Por lo tanto, nuestros
resultados muestran que la diversidad natural en la forma del fruto de exocarpio
negro, no puede ser explicada nicamente por el clima. Las diferencias morfolgicas
encontradas claramente indican que las poblaciones de higo en el centro de Mxico
son genticamente distintas.

51
Figura 5. Caractersticas representativas del fruto de diferentes poblaciones de higo del centro de
Mxico.

A pesar de las diferencias observadas, no podemos descartar la posibilidad de que

en algn momento las poblaciones de higo descritas en este estudio hayan
compartido un ancestro comn. Sin embargo, actualmente las poblaciones son
diferentes entre ellas. Con propsitos de identificacin, nosotros asignamos un
nombre a cada poblacin (Cuadro 7), basndonos en sus lugares de origen.
Utilizando una combinacin de atributos cualitativos del fruto (Cuadro 7 y Figura 5),

52
sus principales caractersticas son como se indica a continuacin: Ixmiquilpan
presenta frutos piriformes con pulpa roja, sin cavidad, con cuello largo y pednculo
largo y delgado. Salvatierra presenta frutos piriformes con pulpa roja y cavidad muy
pequea. Tecmac presenta frutos ovoides con pulpa amarilla sin cavidad. Tetela
presenta frutos ovoides con pulpa rosa, cuello muy largo y pednculo largo y
delgado. Neza presenta frutos piriformes de tamao muy grande con pulpa roja,
cuello largo, pednculo largo y grueso y ostiolo muy grande. Zacapala presenta
frutos ovoides con cavidad grande y pednculo corto y grueso.

Caracterizacin morfolgica del fruto con base en atributos cuantitativos

Los descriptores morfolgicos para frutos de higo en general (IPGRI, 2003) y para
las variedades Sarylop y Black Mission en particular, estn disponibles en la
literatura (Condit, 1955; Storey, 1977; Ersoy et al., 2008; CFAB, 2011; King et al.,
2012; Oguzhan y Atila, 2012). Nosotros utilizamos las referencias cuantitativas del
IPGRI (2003) y de las variedades Sarylop y Black Mission, como estndares para
comparar las poblaciones de higos mexicanos descritas en este estudio. As,
variacin significativa en el tamao o peso del fruto fue observada entre las
poblaciones de higo (Figura 6). Sin embargo, cinco de las seis poblaciones
evaluadas en este estudio, presentaron un tamao que se encuentra en el rango de
valores mnimos y mximos descritos para el tamao del fruto (biomasa fresca,
longitud, dimetro y longitud del cuello). Tecmac y Zacapala produjeron frutos
pequeos. Interesantemente, Neza produjo los frutos ms grandes y pesados de las
seis poblaciones, y adems fueron ms grandes y pesados que los frutos de la
variedad Sarylop y Black Mission (Condit, 1955; Storey, 1977; Ersoy et al., 2008;
Oguzhan y Atila, 2012).

53
 Poblaciones de higo de diferentes estados de la Repblica Mexicana

Figura 6. Tamao del fruto de diferentes poblaciones de higo del centro de Mxico (1: Ixmiquilpan, 2:
Salvatierra, 3: Tecmac, 4: Tetela, 5: Neza, 6: Zacapala), comparado con los estndares
internacionales de higo (IPIGRI, 2003) y las variedades Sarylop (Ersoy et al., 2008) y Black
Mission (Condit, 1955; Storey 1977; CFAB, 2011). A) Biomasa fresca del fruto (g). B)
Longitud del fruto (cm). C) Dimetro del fruto (cm). D) Longitud del cuello del fruto (cm).
Letras distintas indican diferencia estadstica con la prueba de Tukey (P 0.05, n=20).

54
Es probable que las diferencias en tamao entre la variedad Neza y los estndares
internacionales se deban a las condiciones ambientales. Nuestros resultados son
derivados de plantas cultivadas en invernadero, mientras que los estndares
internacionales fueron derivados de plantas cultivadas a campo abierto (Condit,
1955; Storey 1977; IPIGRI, 2003; Ersoy et al., 2008; CFAB, 2011). Sin embargo,
nuestros resultados muestran que la variedad Neza tiene un potencial enorme para
la produccin comercial. De acuerdo con esta conclusin, en Mxico, el rendimiento
promedio de higo en agricultura tradicional es de 4.48 Ton ha-1 (SIAP, 2011). Sin
embargo, nosotros hemos estimado que bajo condiciones de invernadero, la
variedad Neza puede producir fcilmente hasta 120 Ton ha-1 por ao.

3.6. Conclusiones

Los higos negros se han adaptado a condiciones ambientales locales en el centro

de Mxico, fijando genticamente tales adaptaciones, por lo que se han generado
variedades claramente distintas que representan diversidad morfolgica valuable.

Las principales diferencias morfolgicas entre las variedades mexicanos de higo,

identificadas en este estudio como Ixmiquilpan, Salvatierra, Tecmac, Tetela,
Neza y Zacapala, son el tamao o peso del fruto, el color de la pulpa, la longitud
del cuello y la forma del pednculo.

Con la caracterizacin morfolgica de los higos negros identificados en este

estudio, establecemos las bases para la futura caracterizacin agronmica y
molecular de variedades mexicanas de higo.

55
 3.7. Literatura Citada

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59
 IV. PROTOCOLO PARA LA EXTRACCIN DE ADN DE PLANTAS DE HIGO
(Ficus carica L.)

4.1. Resumen

El higo comn (Ficus carica L.), por sus caractersticas propias, presenta contenidos
elevados de ltex y azcares que dificultan la extraccin de ADN de tejidos de la
planta para su amplificacin y anlisis mediante huellas genticas. Varios mtodos
han sido descritos para la extraccin de ADN en diferentes especies vegetales pero
no en higo. Aqu nosotros hicimos modificaciones a mtodos previamente descritos y
presentamos un mtodo nuevo para la extraccin de ADN a partir de hojas jvenes y
maduras, y de frutos jvenes y maduros de higo. Nuestros resultados muestran que
el mtodo del CTAB al 4 % con nuestras modificaciones, puede ser usado para la
extraccin de ADN de higo. Sin embargo, la concentracin y calidad del ADN varan
en funcin de la edad del rgano utilizado para la extraccin. Las hojas jvenes son
el rgano ms recomendado para la extraccin de ADN en concentracin y calidad
ptimas para su amplificacin y anlisis de huellas de ADN. De acuerdo con nuestros
resultados, nosotros sugerimos que en estudios futuros de caracterizacin molecular
de higo, se utilice el ADN obtenido de las hojas jvenes.

Palabras clave: extraccin de ADN, higo, CTAB, concentracin de ADN, calidad de

ADN, tejido de planta.

60
 A PROTOCOL FOR EXTRACTING DNA FROM FIG (Ficus carica L.) PLANTS

4.2. Abstract

The common fig (Ficus carica L.) as a species presents high content of latex and
sugars that difficult DNA extraction from plant tissues for its amplification and analysis
by genetic fingerprinting. Several methods have been described for DNA extraction
for different vegetal species but fig. Here, we made modifications to methods
previously described and presented a new method for extracting DNA from young
and mature leaves and young and mature fruits of fig. Our results show that the 4 %
CTAB method with our modifications can be used for extracting DNA from fig.
However, DNA concentration and quality vary with the age of the organ utilized for
the extraction. The young leaves of the fig plants are the most recommended organ
for extracting DNA in an optimum concentration and quality for its amplification and
DNA fingerprinting analysis. According to our results, we suggest that in future fig
molecular characterization studies, DNA from the young leaves is to be used.

Key words: ADN extraction, fig, CTAB, DNA concentration, DNA quality, plant tissue.

61
 4.3. Introduccin

Los anlisis de ADN se han convertido en un elemento esencial en estudios

biosistemticos, epidemiolgicos, taxonmicos, de gentica poblacional, evolucin, y
caracterizacin de especies y variedades (Prez et al., 2011). Las muestras de ADN
pueden ser aisladas de cualquier tejido biolgico (Pardo y Prez, 2004). Sin
embargo, el desarrollo de mtodos moleculares modernos como la clonacin,
hibridacin y secuenciacin, requieren del establecimiento de protocolos de
extraccin de ADN simples y eficientes (Osorio et al., 2009; Prez et al., 2011).
Actualmente, numerosos protocolos convencionales y comerciales para la extraccin
de ADN de diversas especies herbceas, leosas y perennes han sido descritos
(Dellaporta et al., 1983; Doyle y Doyle, 1987; Edwards et al., 1991; Wang et al.,
1993; Weir et al., 1996; Csaikl et al., 1998; Jewit et al. 1998; Lefort y Douglas, 1999;
Huescas, 2004; Prez et al., 2011).

Entre los protocolos convencionales se encuentra el del CTAB (Cetyl Trimethyl

Ammonium Bromide). Este protocolo fue desarrollado inicialmente para maz
(Dellaporta et al., 1983). Sin embargo, ha sido adaptado para la extractn de ADN de
camote, encino, nopal, orqudeas, papa y soya (Doyle y Doyle, 1987; Ghislaim et al.,
1998; Jewit et al., 1998; Luna, 2008; Posso, 2009; Prez et al., 2011). Este mtodo
de extraccin es intensamente laborioso, consume mucho tiempo y presenta
problemas por la presencia de nucleasas como la ADNasa que degradan el ADN, as
como la presencia de otras macromolculas que son aisladas simultneamente
durante el proceso de purificacin (Couch y Fritz, 1990; Doulis et al., 2000; Valadez y
Kahl, 2000; Huescas, 2004). Sin embargo, las nucleasas pueden ser inactivadas por
medio de magnesio, EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid), EGTA (Ethylene
Glycol Tetraacetic Acid), SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) y fenantrolina en diferentes
concentraciones, en funcin de la especie utilizada. Las macromolculas como las
protenas pueden ser disociadas mediante la adicin de PVP (Polivinilpirrolidona) en
concentracin mayor al 1 % en el buffer de aislamiento inicial (Weir et al., 1996;
Stange et al., 1998; Valadez y Kahl, 2000).

62
Entre los protocolos comerciales para la extraccin de ADN se encuentran el del
Nucleon PhytoPure system (Invitrogen). Este protocolo ha demostrado ser
altamente efectivo en la remocin de polisacridos de especies como acelga,
algodn, arabidopsis, araucaria, cedro, cocotero, chile, col, eucalipto, fresa, y maz
(Tepnel, 2003). Los protocolos Extract-N-AmpTM Plant PCR Kit (Sigma) y
REDExtract-N-AmpTM Plant PCR Kit (Sigma), facilitan la extraccin rpida del
ADN, eliminan la necesidad de congelamiento de los tejidos, y adems incluyen una
mezcla para PCR formulada especialmente para la amplificacin directa del ADN
extrado (Sigma, 2004). El protocolo del Plant DNAzol Reagent (Invitrogen) fue
diseado para la extraccin de ADN a partir de cantidades de tejido de 0.1 g en tan
solo 30 a 60 min, y puede ser utilizado en estudios de clonacin y mapeo gentico
(Invitrogen, 2004). A pesar de la facilidad y rapidez que ofrecen los protocolos
comerciales para la extraccin de ADN, el protocolo del CTAB permite obtener ADN
ms puro e ntegro que cualquiera de ellos, por lo que sigue siendo actualmente el
mtodo de extraccin ms utilizado en diferentes especies (Weising et al., 2005).

La integridad, la pureza, y la concentracin del ADN extrado son los factores ms

importantes que se deben tomar en cuenta antes de proceder con el anlisis
molecular de cualquier tipo. La integridad puede ser determinada de manera
cualitativa en minigeles de agarosa teidos en bromuro de etidio y fotografiados bajo
luz Uv. (Sambrook et al.,1989; Muller y Schweiser, 1994; Weir et al., 1996). La
pureza y la concentracion pueden ser determinadas cuantitativamente por
espectrofotometra, mediante la relacin de absorbancia 260/280. Si esta relacin se
encuentra entre 1.7 y 2.0, se considera que las muestras de ADN son puras y estn
libres de contaminantes celulares (Weir et al., 1996). Una relacin menor indica
contaminacin con protenas o fenoles, y una relacin mayor de 2.0 indica que las
muestras contienen polisacridos (Weir, 1996; Doulis et al., 2000).

Especficamente en higo, la extraccin de ADN se ha realizado con el mtodo del

CTAB. Sin embargo, los resultados obtenidos son muy variables, debido
principalmente a las limitaciones para su aislamiento en cantidad y calidad adecuada

63
(Khadari et al., 2003; Khadari et al., 2004; Guasmi et al., 2006; Achtak, 2009; Khaled
et al., 2010; Mallikarjuna et al., 2010). Por esta razn, se hace necesario estandarizar
protocolos de extraccin de ADN de higo a partir de diferentes rganos de las
plantas, que garanticen que el material gentico inicial sea adecuado para su
amplificacin exitosa, independientemente del tipo de marcadores moleculares que
se desee utilizar.

En nuestro pas, se han adaptado protocolos para la extraccin de ADN de cultivos

como el maz, frijol, nopal, chile, chcharo, garbanzo, encino y orqudeas (De la Cruz
et al., 1997; Valadez et al., 2001; Garzn et al., 2002; Iruela et al., 2002; Huescas,
2004; Luna et al., 2007; Gutirrez et al., 2009; Prez et al., 2011; Ramrez et al.,
2012). Sin embargo, no hay informacin acerca del cultivo de higo. Nosotros
colectamos y propagamos plantas de higo de seis estados del centro de Mxico y
extrajimos ADN de rganos de diferente edad. En este estudio, nosotros reportamos
variacin previamente no descrita de la calidad y concentracin del ADN aislado de
hojas y frutos de higos negros de diferentes partes de Mxico. Para evaluar la
variacin en la calidad y concentracin del ADN entre genotipos de higo negro del
centro de Mxico, nosotros estandarizamos un protocolo de extraccin de ADN a
partir de hojas jvenes y maduras y frutos jvenes y maduros. Nuestros resultados
muestran que el ADN aislado de los higos negros presenta concentracin y calidad
variable en funcin de la edad del rgano utilizado para su extracccin. Las hojas
jvenes facilitan la extraccin, y el ADN aislado presenta una concentracin ms alta
que las hojas maduras y frutos jvenes y maduros. Nosotros sugerimos que en
estudios futuros de caracterizacin molecular de genotipos de higo se utilice el ADN
aislado de las hojas jvenes.

4.3.1. Objetivo

Establecer un mtodo para la extraccin de ADN de plantas de higo.

64
4.3.2. Hiptesis

Ho: La concentracin y la calidad del ADN varan en funcin de la edad y rgano de

las plantas utilizadas para su extraccin.

Ha: La concentracin y la calidad del ADN son constantes y no son influenciadas por
la edad ni por el tipo de rgano de las plantas que se usen para la extraccin.

4.4. Materiales y Mtodos

Material vegetal
En este estudio se evaluaron para extraccin de ADN hojas jvenes y maduras y
frutos jvenes y maduros de seis poblaciones de higo del tipo comn o
partenocrpicos, recolectados en diferentes estados del centro de Mxico, en enero
del 2011. Las hojas jvenes y los frutos jvenes, ambos de color verde claro, fueron
recolectados del pice de las plantas. Las hojas maduras, de color verde oscuro y los
frutos maduros, de color negro, fueron recolectadas del tercio medio de las plantas.
Las seis poblaciones fueron caracterizadas morfolgicamente en el Captulo III de
esta investigacin.

Reproduccin y cultivo de las plantas

Plantas de higo de las poblaciones de inters, y que fueron reproducidas por estacas
conforme a lo descrito en el Captulo III de esta investigacin, fueron cultivadas en
invernadero bajo las mismas condiciones ambientales (Cuadro 8) y de manejo
agronmico.

65
Cuadro 8. Temperatura y humedad relativa prevalecientes en el invernadero,
durante la produccin de higos de diferentes poblaciones del centro de
Mxico, utilizadas para la extraccin de ADN.
Condicin ambiental Octubre-Diciembre del Enero-Marzo
2011 del 2012
Temperatura (oC)
Mnima 1.83 3.62
Media 17.89 17.51
Mxima 50.47 44.72
Humedad relativa (%)
Mnima 15.68 18.07
Media 69.97 69.78
Mxima 92.42 93.62

Extraccin de ADN
Entre octubre y diciembre del 2011, cuando las plantas de higo producidas en
invernadero bajo las mismas condiciones ambientales (Cuadro 9) y de manejo
agronmico, se encontraban al final del periodo de cosecha, se realiz la extraccin
del ADN a partir de hojas jvenes y maduras y de frutos jvenes y maduros de las
poblaciones Ixmiquilpan, Salvatierra, Tecmac, Tetela, Neza, y Zacapala. Las hojas
y los frutos fueron cosechados entre las 9:00 y 10:00 horas e inmediatamente fueron
traslados al laboratorio de Biologa Molecular del Departamento de Fitotecnia de la
Universidad Autnoma Chapingo, para su utilizacin. Las muestras fueron lavadas
con agua destilada y desinfectadas en una solucin de Extrn (2 %) durante 5 min.
El exceso de humedad fue removido con papel absorbente. El buffer de extraccin
se compuso de: CTAB al 4 %, NaCl 1.4 M, EDTA 20 mM, Tris-HCl 100 mM, PVP al 1
% y -mercaptoetanol al 0.4 %. La extraccin del ADN mediante el mtodo del CTAB
al 4 % se realiz de la siguiente manera:

66
1. Tres gramos de muestra de hojas o de frutos fueron trituradas manualmente con
nitrgeno lquido en mortero.
2. El tejido triturado de los frutos fue transferido inmediatamente a tubos de
polietileno para centrfuga de 50 ml. A cada tubo se le agregaron 15 ml del buffer
de extraccin (CTAB al 4 %) previamente calentado a 60 oC. Los tubos fueron
agitados manualmente para homogeneizar la mezcla.
3. Los tubos con el buffer de extraccin fueron incubados por 1 h a 60 oC en bao
Mara con agitacin constante (BT25 Yamato). Para asegurar que la mezcla se
calentara de manera homognea, cada 10 min los tubos fueron agitados
manualmente.
4. Despus de la incubacin, los tubos se dejaron enfriar por 4 min. A cada tubo se
le agregaron 2 volmenes de cloroformo-alchol isoamlico (24:1) y fueron
agitados por 10 min en agitador orbital (Labline).
5. Los tubos fueron centrifugados (IEC CL31 Multispeed) por 15 min a 8,000 rpm.
6. La fase acuosa fue separada y colocada en un tubo nuevo. Al sobrenadante se le
agregaron otros dos volmenes de cloroformo-alchol isoamlico (24:1) y fueron
agitados nuevamente por 10 min en agitador orbital (Labline). Los tubos fueron
centrifugados nuevamente (IEC CL31 Multispeed) por 15 min a 8,000 rpm. La
fase acuosa fue colocada en el tubo que contena la fase acuosa previamente
separada.
7. A los tubos con la fase acuosa se les agreg un volumen de isopropanol al 100 %
y se mezclaron por inversin varias veces. Los tubos fueron centrifugados (IEC
CL31 Multispeed) por 20 min a 4,000 rpm para precipitar el ADN.
8. A la pastilla de ADN precipitado se le agregaron 5 ml de etanol al 70 %,
agitndola suavemente. El ADN fue recolectado por centrifugacin (IEC CL31
Multispeed) por 10 min a 12,000 rpm.
9. El etanol fue eliminado de las muestras de ADN por inversin de los tubos.
10. El ADN fue colocado en tubos eppendor. A cada tubo se le agreg 1 ml de buffer
TE (Tris-Hcl 10 mM y EDTA 1 mM a pH de 8.0) para su disolucin.
11. Las muestras de ADN fueron incubadas por 24 h a 4 oC.

67
12. Las muestras fueron homogeneizadas por centrifugacin (Hettich) por 10 seg a
3,000 rpm.
13. La concentracin y la calidad del ADN fueron determinadas por
espectrofotometra (Thermo Scientific Nanodrop ND-1000).
14. La calidad del ADN fue verificada en geles de agarosa al 1 %.
15. Las muestras de ADN fueron conservadas en refrigeracin a 4 oC hasta su
utilizacin.

Diseo experimental y anlisis estadstico

Para la extraccin de ADN de las hojas y frutos de higo, se utiliz un diseo
experimental factorial de dos factores A y B. El factor A estuvo conformado por las
edades (llamadas bloques) del rgano de la planta utilizado: 1 (hojas jvenes), 2
(hojas maduras) 3: (frutos jvenes) y 4 (frutos maduros). El factor B estuvo
conformado por las poblaciones de higo (llamadas tratamientos) recolectados en
diferentes estados del centro de Mxico: 1 (Ixmiquilpan), 2 (Salvatierra), 3
(Tecmac), 4 (Tetela), 5 (Neza) y 6 (Zacapala). De cada combinacin A y B hubo
cuatro repeticiones. La unidad experimental fueron 3 g de hojas jvenes y maduras y
de frutos jvenes y maduros obtenidos de plantas individuales. Los datos fueron
sometidos a pruebas de normalidad (Kolmogorov-Smirnov) y homogeneidad de
varianzas (Bartlett) en el paquete estadstico SAS. Se verific que cumplieron con los
supuestos bsicos del anlisis de varianza. Se realiz un anlisis de varianza y
pruebas de comparacin de medias con la prueba de Tukey (P 0.05), en el paquete
estadstico SAS (SAS, 1999-2000, versin 8.1). Las figuras fueron editadas en el
programa Illustrator CS3 (versin 13.0) para computadora personal.

Variables respuesta
Concentracin del ADN (ng L-1). La concentracion de ADN fue determinada
por espectrofotometra a 260 nm de longitud (Thermo Scientific Nanodrop ND-
1000), bajo el principio de que la molcula de ADN presenta su absorbancia

68
 mxima a 260 nm (Muller y Schweizer, 1994).

Calidad del ADN (relacin 260/280). La calidad de ADN fue determinada por
espectrofotometraa (Thermo Scientific Nanodrop ND-1000), con base en la
relacin 260/280, considerando que una muestra de ADN fue de calidad
adecuada cuando present una relacin entre 1.7 y 2.0. Posteriormente, la
calidad de ADN fue verificada en geles de agarosa al 1 % sumergidos en buffer
TAE (Tris-sodio Acetato-EDTA. Stock 50 X: Tris base 242 g, cido actico glacial
57.1 mL, EDTA 0.5 M a pH 8.0 100 mL) 1X, utilizando 10 l de Gene Ruler 100
pb (pares de bases) Plus y 10 l de 1 Kb (kilo bases) Plus (Thermo Scientific),
como marcadores de ADN de peso molecular estndar. La electroforesis fue
realizada en un analizador gentico (Cleaver scientific Ltd), por 45 min a 85 volts.
Los geles fueron teidos con bromuro de etidio y fotografiados bajo luz Uv,
usando un fotodocumentador (Universal Hood II, Bio Rad).

4.5. Resultados y Discusin

Concentracin del ADN (ng L-1)

Para obtener ADN de higo en cantidad y calidad adecuada para su amplificacin y
anlisis de huellas de ADN, nosotros realizamos varias modificaciones al mtodo del
CTAB al 2 % establecido por Weising et al. (2005). Esas modificaciones consistieron
en incrementar al doble la concentracin del buffer de extraccin, los tiempos de
incubacin, los tiempos y velocidades del centrifugado y los volmenes de
cloroformo-alcohol isoamlico y etanol utilizados. Para determinar de qu edad y de
qu tipo de rgano de las plantas de higo se obtiene ADN en mayor concentracin y
calidad, nosotros utilizamos hojas jvenes, hojas maduras, frutos jvenes y frutos
maduros. El buffer de extraccin al 4 % (CTAB) fue suficiente para obtener ADN en
concentracin media a alta, con diferencias significativas en funcin de la edad de
las hojas (Cuadro 9). La concentracin de ADN obtenido de los frutos fue baja (7.24

69
%) en comparacin con la de las hojas. Sin embargo, no hubo diferencias
estadsticas significativas entre frutos jvenes y frutos maduros (Cuadro 9).

Cuadro 9. Concentracin y calidad del ADN obtenido de rganos de diferente edad

de varias poblaciones de higos del centro de Mxico.
Factor Concentracin Calidad del ADN
(ng L-1) (relacin 260/280)
A (Edad de los rganos)
Hojas jvenes 931.35 ( 75.36) a 1.99 ( 0.48) a
Hojas maduras 322.68 ( 27.93) b 1.70 ( 0.16) b
Frutos jvenes 53.66 ( 13.23) c 1.61 ( 0.14) c
Frutos maduros 37.19 ( 11.97) c 1.58 ( 0.12) c
DMS 116.06 0.11

B (Poblaciones)
Ixmiquilpan 372.41 ( 209.98) a 1.70 ( 0.26) a
Salvatierra 277.30 ( 217.69) a 1.77 ( 0.20) a
Tecmac 393.30 ( 242.46) a 1.72 ( 0.21) a
Tetela 334.78 ( 197.27) a 1.75 ( 0.17) a
Neza 316.82 ( 173.74) a 1.80 ( 0.20) a
Zacapala 322.81 ( 182.70) a 1.72 ( 0.21) a
DMS 158.52 0.15

A*B ** **
Letras distintas indican diferencia estadstica con la prueba de Tukey (P 0.05, n=4). **: Altamente
significativa.

Calidad del ADN

La calidad del ADN obtenido de rganos de diferente edad de plantas de varias
poblaciones de higo, fue determinada por espectrofotometra y verificada en geles de

70
agarosa. Las mediciones cuantitativas indicaron que con el mtodo del CTAB al 4 %,
modificado por nosotros, se logr aislar ADN puro (relacin 260/280= 1.7-20) con
diferencias estadsticas significativas entre las hojas jvenes y maduras de las seis
poblaciones de higo evaluadas en este estudio (Cuadro 9). Sin embargo, los frutos
jvenes y maduros presentaron ADN contaminado y la pureza fue inferior (relacin
260/280 <1.7) a la de las hojas (Cuadro 9). Los contaminantes pudieron haber sido
principalmente los azcares contenidos en los frutos, pues durante la extraccin
tambin se aslan otras macromolculas que interfieren con la pureza de los cidos
nucleicos (Couch y Fritz, 1990; Doulis et al., 2000; Valadez y Kahl, 2000; Huescas,
2004).

Los resultados de este estudio sugieren que la concentracin y la calidad del ADN
aislado estn estrechamente relacionadas, observando que las muestras ms
concentradas (hojas jvenes) presentaron mayor grado de pureza, y las muestras
menos concentradas (frutos maduros) presentaron menor grado de pureza (Cuadro
9). La variedad no tuvo ningn efecto sobre la concentracin y la calidad de las
muestras de ADN, pero la edad de los rganos utilizados s influy notablemente en
la variacin encontrada en estos dos parmetros de evaluacin del ADN.

Los geles de agarosa al 1 % mostraron que con el mtodo del CTAB al 4 %

modificado por nosotros, el ADN obtenido de higo (Figura 7) se mantiene en la parte
superior del gel como una banda compacta, debido al gran tamao de los
cromosomas de higo. Dos bandas de ADN se encuentran por arriba de las 8.0 Kb.
El ADN genmico es la banda de mayor peso molecular. La banda que mide
aproximadamente 9 Kb indica que hubo dao mecnico o degradacin de ADN
durante la extraccin.

En las hojas jvenes, las bandas son claramente visibles en todas las poblaciones.
Sin embargo, en las hojas maduras y los frutos jvenes y maduros, la visibilidad de
las bandas disminuy (Figura 7). Estos resultados se atribuyen principalmente a que

71
estas muestras de fruto y hojas maduras presentaron una concentracin y calidad de
ADN menor a la de las hojas jvenes.

Figura 7. Calidad de DN de higo de rganos de diferente edad de varias poblaciones del centro de
Mxico (1: Ixmiquilpan, 2: Salvatierra, 3: Tecmac, 4: Tetela, 5: Neza, 6: Zacapala), verificada
en geles de agarosa al 1 %. A) Hojas jvenes. B) Hojas maduras. C) Frutos jvenes. D)
Frutos maduros. Los marcadores de 100 pb y 1Kb fueron utilizados como marcadores de
ADN de peso molecular estndar.

Las modificaciones referidas al mtodo del CTAB, permitieron obtener ADN de las
hojas jvenes y maduras en concentracin y calidad adecuada para su amplificacin
(Cuadro 10, Figura 7). Resultados similares fueron publicados por Lefort y Douglas

72
(1999) y Gonzlez et al. (2004), en el aislamientos de ADN de hojas jvenes y
maduras de encino rojo. El incremento del CTAB al 4 % y el PVP adicionado al buffer
de extraccin, favoreci el rompimiento de las clulas y evit la oxidacin de las
muestras (Handa et al., 2005). Sin embargo, las hojas jvenes contienen ltex en
menor cantidad y facilitan la extraccin del ADN de mayor grado de pureza.

4.6. Conclusiones

ADN de higo de buena calidad y cantidad se pudo extraer con el mtodo del
CTAB al 4 %.

La edad y el tipo de rgano utilizado para la extraccin de ADN de higo influyen

en la concentracin y calidad del ADN obtenido.

Las hojas jvenes de las plantas de higo son el rgano ms recomendado para la
extraccin de ADN en concentracin y calidad ptimas para su amplificacin y
anlisis de huellas de ADN.

4.7. Literatura Citada

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77
V. HUELLAS DE ADN DE VARIEDADES MEXICANAS DE HIGO (Ficus carica L.)1

5.1. Resumen

Recientemente, nosotros demostramos que en nuestro pas el higo comn (Ficus

carica L.) presenta diversidad morfolgica natural previamente desconocida. La
caracterizacin morfolgica de poblaciones de higo en igualdad de condiciones
ambientales sugiere que la diversidad en las caractersticas del fruto se debe a
diferencias genticas. Para probar esta hiptesis, hicimos un anlisis de huellas
genticas usando marcadores moleculares del tipo RAPDs, ISSRs y RFLPs. Los
ISSRs y RFLPs mostraron polimorfismos que claramente distinguen entre si a todas
las poblaciones. Adems, nuestros resultados muestran que el higo, como especie,
tiene un gen homlogo al gen Fruitfull de Arabidopsis thaliana que determina el
tamao del fruto. Entre las poblaciones mexicanas de higo analizadas (Ixmiquilpan,
Salvatierra, Tecmac, Tetela, Neza y Zacapala), se encontr variacin gentica en el
gen Fruitfull que tiene correlacin con la forma de los frutos, y distingue claramente a
las seis poblaciones. Estos resultados demuestran que las poblaciones de higo
descritas en este estudio son genticamente diferentes entre s, y sugerimos que
sean consideradas como variedades naturales derivadas de, pero diferentes de la
variedad espaola Black Mission.

Palabras clave: diversidad gentica, variedades de higo, huellas de ADN,

marcadores moleculares.

1
M.T. Garca-Ruiz, V.M. Mendoza-Castillo, E. Valadez-Moctezuma and A. Muratalla-
La. 2013. Journal of Genetics and Molecular Research. 12 (3): 3931-3943.

78
 DNA FINGERPTINTING OF MEXICAN FIG (Ficus carica L.) VARIETIES2

5.2. Abstract

Recently, we demonstrated that in our country, the common fig (Ficus carica L.)
presents natural morphological diversity previously unknown. Morphological
characterization of fig populations in equality of environmental conditions suggests
that the diversity in the characteristics of the fruit owes to genetic differences. To test
this hypothesis we did DNA fingerprinting analysis using RAPDs, ISSRs and RFLPs
molecular markers. ISSRs and RFPLs showed polymorphism that clearly
distinguishes all the populations among them. In addition, our results show that the
fig, as a species, has a homologous gene to the Fruitfull gene of Arabidopsis thaliana
that determines the size of the fruit. Among the populations of Mexican figs analyzed
(Ixmiquilpan, Salvatierra, Tecmac, Tetela, Neza y Zacapala), genetic variation in the
Fruitfull gene was found that has correlation with the form of the fruits and
distinguishes clearly the six populations. These results demonstrate that the
populations of fig described in this study are genetically different among them, and
we suggest that they should be considered as natural varieties derivated from, but
different from the Spanish Black Mission variety.

Key words: genetic diversity, fig varieties, DNA fingerprinting, molecular markers.

2
M.T. Garca-Ruiz, V.M. Mendoza-Castillo, E. Valadez-Moctezuma and A. Muratalla-
La. 2013. Journal of Genetics and Molecular Research. 12 (3): 3931-3943.

79
 5.3. Introduccin

El uso de marcadores moleculares ha facilitado la identificacin de especies y

variedades mediante anlisis de huellas de ADN (Khadari et al., 2003; Guasmi et al.,
2006; Jabbarzadeh et al., 2010; Khaled et al., 2010; Mallikarjuna et al., 2010; Hassan
et al., 2011; Palai y Rout, 2011; Sarwat, 2012). Actualmente se conocen almenos 40
tipos de marcadores (Sarwat, 2012; Semagn et al., 2006). Los ms utilizados en
anlisis de ADN en plantas son los RFLPs, RAPDs, ISSRs, AFLPs y Microsatlites
(Microsatellite Primed PCR) (Semagn et al., 2006; Sarwat, 2012).

Los RFLPs fueron utilizados por primera vez en 1975 para identificar secuencias
polimrficas de ADN en Adenovirus (Grodzicker et al., 1975). En 1980, este tipo de
marcadores fueron utilizados en la identificacin del genoma humano (Botstein et al.,
1980). Ms tarde, fueron adaptados para la identificacin del genoma de plantas
(Helentjaris et al., 1986; Weber y Helentjaris, 1989). Los RFLPs requieren de una o
ms enzimas de restriccin para detectar diferencias entre fragmentos de ADN de la
misma o diferente especie (Semagn et al., 2006). El nmero y el tamao de los
fragmentos detectados es variable entre organismos, poblaciones y especies. Las
diferencias detectadas en los sitios de restriccin pueden deberse a mutaciones
puntuales, inserciones o delecciones, translocacin, inversin y/o duplicacin del
ADN (Helentjaris et al., 1986; Weber y Helentjaris, 1989). Las enzimas de restriccin,
llamadas endocucleasas provienen de bacterias. Su funcin es identificar y cortar
secuencias de ADN de cuatro, seis u ocho pares de bases. La decisin de utilizar un
tipo de enzima u otro depende principalmente del nmero de cortes que se prevee
en el ADN de inters (Semagn et al., 2006). En higo, los RFLPs han sido utilizados
para evaluar diversidad gentica y diferenciar poblaciones de plantas (Khadari et al.,
2005).

Los RAPDs aparecieron en 1990 (Welsh y McClellan, 1990). Sus principales ventajas
son que permiten analizar todo el genoma, no requieren conocimiento previo del
genoma que se desea estudiar, son econmicos y fciles de manejar, son eficientes

80
en la estimacin de la diversidad gentica de poblaciones con variacin amplia y
anlisis filogenticos (Sarwat, 2012). Sin embargo, entre sus principales desventajas
se encuentran la alta sensibilidad a alteraciones en el protocolo, reproducibilidad
baja, y eficiencia media a baja en la identificacin de variedades (Semagn et al.,
2006). En higo, los RAPDs han sido utilizados en estudios de genotipificacin,
diversidad gentica de plantas silvestres o tipo Caprifig, estimacin de diferencias
genticas, y seleccin de clones de inters e identificacin de variedades (Galderisi
et al., 1999; Cabrita et al., 2001; De Masi et al., 2003; De Masi et al., 2005; Dalkilic et
al., 2011).

Los ISSRs se dieron a conocer en 1994 (Zietkiewicz et al., 1994). Este tipo de
marcadores detectan polimorfismo en mayor porcentaje que los RAPDs con cada
primer o iniciador utilizado, amplifican secuencias de ADN altamente conservadas
entre dos microsatlites que presentan la misma secuencia de bases, permiten
identificar variacin natural en plantas de diferentes especies como almendro,
crisantemo, higo, rosa, etc, determinar diversidad y estabilidad gentica, y diferenciar
hbridos y variedades (Khadari et al., 2003; Guasmi et al., 2006; Semagn et al., 2006;
Jabbarzadeh et al., 2010; Khaled et al., 2010; Mallikarjuna et al., 2010; Satwar,
2012). El polimorfismo detectado por los ISSRs indica que en esa regin particular
del ADN ocurrieron mutaciones. Las diferencias entre polimorfismos denotan cierto
valor en distancias genticas (Martins et al., 2003). Todas estas ventajas han
convertido a los ISSRs en una de las mejores tcnicas moleculares para realizar
estudios sobre huellas genticas de ADN (Khaled et al., 2010; Sarwat, 2012). En
higo, los ISSRs han sido utilizados con propsitos de identificacin varietal y
determinacin de relaciones filogenticas entre variedades (Khadari et al., 2003;
Guasmi et al., 2006; Mallikarjuna et al., 2010).

Los AFLPs surgieron en 1995 (Vos et al., 1995). Son una tcnica poderosa que
permite utilizar ADN de excelente calidad o parcialmente degrado para la digestin,
siempre y cuando est libre de enzimas de restriccin e inhibidores de la PCR
(Blears et al., 1998). Su principal desventaja con respecto a otro tipo de marcadores,

81
es que son de alto costo econmico y requieren conocimiento previo de las
secuencias que se van a amplificar (Valadez y Kahl, 2000). En higo, los AFLPs han
sido utilizados con propsitos de diferenciacin gentica de clones (Cabrita et al.,
2001).

Los Microsatlites aparecieron en 1993 (Meyer et al., 1993). Su principal ventaja es

que permiten detectar polimorfismos a nivel intra e interespecfico. Sin embargo, en
anlisis de genotipificacin, su uso est limitado solo a algunas especies (Semagn et
al., 2006). En higo, los microsatlites se han utilizado en anlisis de la diversidad y
relaciones genticas de colecciones de bancos de germoplasma, y en la
caracterizacin de especies y variedades (Giraldo et al., 2005; Chatti et al., 2007;
Mallikarjuna et al., 2010).

En Mxico, no hay informacin acerca de la caracterizacin molecular o diversidad

natural de higo. En este estudio, nosotros hicimos una caracterizacin morfolgica
de higo y la complementamos con un anlisis gentico basado en marcadores
moleculares (combinacin de RAPDs, ISSRs y RFLPs). Los resultados muestran
con alta precisin las caractersticas morfolgicas y genticas de poblaciones de higo
colectadas en el centro de Mxico. Estos resultados muestran por primera vez que
hay variacin gentica entre higos negros de diferentes partes de Mxico. Estos
resultados apoyan la hiptesis de que los higos negros inicialmente derivados de
Black Mission se han adaptado a condiciones ambientales locales en el centro de
Mxico, generando variedades claramente distintas que representan diversidad
gentica valuable y previamente no descrita.

5.3.1. Objetivo

Caracterizar poblaciones de higo del centro de Mxico, mediante huellas de ADN

basadas en una combinacin de RAPDs, ISSRs y RFLPs.

82
5.3.2. Hiptesis

Ho: Las diferencias genticas entre higos de distintas partes de Mxico pueden ser
detectadas mediante huellas de ADN tipo RAPDs, ISSRs y RFLPs.

Ha: El anlisis de huellas de ADN tipo RAPDs, ISSRs y RFLPs, no permitir detectar
diferencias genticas entre higos provenientes de distintas partes de Mxico.

5.4. Materiales y Mtodos

Material vegetal
El anlisis con marcadores moleculares si hizo con ADN extrado de hojas jvenes
de higos de seis poblaciones del tipo comn o partenocrpicos, recolectadas en
diferentes estados del centro de Mxico, en enero del 2011. Las seis poblaciones
fueron caracterizadas morfolgicamente en el Captulo III de esta investigacin.

Reproduccin y cultivo de las plantas

Plantas de higo de las poblaciones de inters reproducidas por estacas conforme a lo
descrito en el Captulo III de esta investigacin, fueron cultivadas en invernadero bajo
las mismas condiciones ambientales (Cuadro 10) y de manejo agronmico.

Extraccin de ADN
En el Captulo IV se muestra que las hojas jvenes son la mayor fuente de ADN de
higo. Con base en eso, entre enero y marzo del 2012, se extrajo el ADN de las hojas
jvenes colectadas del pice de 12 plantas de cada una de las seis poblaciones de
higo de inters. Las hojas fueron colectadas entre las 9:00 y 10:00 horas e
inmediatamente fueron trasladas al laboratorio de Biologa Molecular del
Departamento de Fitotecnia de la Universidad Autnoma Chapingo. Las hojas fueron

83
 desinfectadas en una solucin de Extrn (2 %) durante 5 min. Posteriormente, se
obtuvieron cuatro muestras de 3 g de la mezcla de hojas de cada poblacin. Las
muestras fueron trituradas con nitrgeno lquido y la extraccin del ADN fue realizada
siguiendo el protocolo del CTAB al 4 % modificado por nosotros (Captulo IV). La
concentracin y calidad del ADN fue determinada por espectrofotometra a 260 nm
de longitud (Thermo Scientific Nanodrop ND-1000), y la calidad del ADN tambin fue
verificada en geles de agarosa al 1 % sumergidos en buffer de Tris-sodio Acetato-
EDTA (TAE) 1X, utilizando 10 l de Gene Ruler 100 pb Plus y 10 l de 1 Kb Plus
(Thermo Scientific), como marcadores de ADN de peso molecular estndar. La
electroforesis fue realizada en un analizador gentico (Cleaver scientific Ltd), por 45
min a 85 volts. Los geles fueron teidos con bromuro de etidio y fotografiados bajo
luz Uv, usando un fotodocumentador (Universal Hood II, Bio Rad). Las muestras de
ADN fueron conservadas a 4 oC hasta su utilizacin.

Cuadro 10. Temperatura y humedad relativa prevalecientes en el invernadero,

durante la produccin de higos de diferentes poblaciones del centro de
Mxico, utilizados para el anlisis de huellas de ADN.

Condicin ambiental Enero Febrero Marzo

Temperatura (oC)
Mnima 4.56 5.26 3.62
Media 16.05 18.66 17.91
Mxima 40.17 41.97 44.72
Humedad relativa (%)
Mnima 27.39 18.07 23.66
Media 78.99 61.99 67.99
Mxima 93.58 93.62 90.99

En agosto del 2012, las muestras de ADN fueron enviadas al Donald Danforth Plant
Science Center, en Saint Louis, Missouri, USA, para llevar a cabo los anlisis de
huellas de ADN. Este anlisis fue parte del proyecto de la estancia doctoral realizada

84
por la autora principal en Danforth. Una vez que las muestras fueron recibidas, la
concentracin y calidad del ADN fue determinada por espectrofotometra (Thermo
Scientific Nanodrop 2000 C), y la calidad del ADN tambin fue verificada en geles de
agarosa al 1 % sumergidos en buffer de Tris-sodio Acetato-EDTA (TAE) 1X,
utilizando 10 l de Gene Ruler 100 pb Plus y 10 l de 1 Kb Plus (Thermo Scientific),
como marcadores de ADN de peso molecular estndar. La electroforesis fue
realizada en un analizador gentico (Cleaver scientific Ltd), por 45 min a 85 volts.
Los geles fueron teidos con bromuro de etidio y fotografiados bajo luz Uv, usando
un fotodocumentador (Universal Hood II, Bio Rad). Las muestras de ADN de las seis
poblaciones fueron normalizadas a una concentracin de 150 ng L-1 para su
amplificacin.

Seleccin y diseo de primers

Primeramente fueron seleccionados 20 primers individuales de los RAPDs y 18
primers individuales de los ISSRs (Cuadro 11). Estos primers fueron probados en
higo por Kadhari et al. (2004) y Khaled et al. (2010). Posteriormente fueron
diseados tres primers especficos: Fruitfull_F131, Fruitfull_R1218 y Fruitfull_R3056
(Figura 8 B) a partir de la secuencia del ADNc del gen nmero ATG560910 (Fruitfull)
de Arabidopsis thaliana (Figura 8 A), obtenida de la base de datos de Arabidopsis
([Link]). Para esto, la secuencia del gen Fruitfull fue alineada con la
secuencia de otras especies de plantas utilizando la herramienta BLAST del banco
de genes ([Link]). Los primers especficos (Cuadro 11) fueron
seleccionados a partir de secuencias altamente conservadas en diferentes especies
de plantas (Figura 8 A).

85
Cuadro 11. Secuencias de los primers utilizados en el anlisis de huellas de ADN de
diferentes poblaciones de higos del centro de Mxico.
No. Nombre Secuencia (5 a 3) Tipo de primer
1 ROTH-H01 GGTCGGAGAA RAPD
2 ROTH-H02 TCGGACGTGA RAPD
3 ROTH-HO3 AGACGTCCAC RAPD
4 ROTH-H04 GGAAGTCGCC RAPD
5 ROTH-H05 AGTCGTCCCC RAPD
6 ROTH-H06 ACGCATCGCA RAPD
7 ROTH-H07 CTGCATCGTG RAPD
8 ROTH-H08 GAAACACCCC RAPD
9 ROTH-H09 TGTAGCTGGG RAPD
10 ROTH-H10 CCTACGTCAG RAPD
11 ROTH-H11 CTTCCGCAGT RAPD
12 ROTH-H12 ACGCGCATGT RAPD
13 ROTH-H13 GACGCCACAC RAPD
14 ROTH-H14 ACCAGGTTGG RAPD
15 ROTH-H15 AATGGCGCAG RAPD
16 ROTH-H16 TCTCAGCTGG RAPD
17 ROTH-H17 CACTCTCCTC RAPD
18 ROTH-H18 GAATCGGCCA RAPD
19 ROTH-H19 CTGACCAGCC RAPD
20 ROTH-H20 GGGAGACATC RAPD
21 (CA)8CG CACACACACACACACACG ISSR
22 (GACA)4GT GACAGACAGACAGACAGT ISSR
23 (GACA)4CG GACAGACAGACAGACACG ISSR
24 (CA)8TG CACACACACACACACATG ISSR
25 (ACTG)4 ACTGACTGACTGACTG ISSR
26 (AGAG)5C AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGC ISSR
27 (TC)10A TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCA ISSR

86
Cuadro [Link] de los primers utilizados en el anlisis de huellas de ADN de
diferentes poblaciones de higos del centro de Mxico (continuacin).
No. Nombre Secuencia (5 a 3) Tipo de primer
28 (CT)10G CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTG ISSR
29 (GACAC)4 GACACGACACGACACGACAC ISSR
30 (AGAG)5T AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGT ISSR
31 (AGAC)4GC AGACAGACAGACAGACGC ISSR
32 (CA)8AGC CACACACACACACACAAGT ISSR
33 (TCC)5AGCT TCCTCCTCCTCCTCCAGCT ISSR
34 (CA)7 CACACACACACACA ISSR
35 (GACA)4GT GACAGACAGACAGACAGT ISSR
36 (GACA)4AC GACAGACAGACAGACAAC ISSR
37 (GTCGATGT)CCA GTCGATGTCCA ISSR
38 (GACGATGA)CCT GACGATGACCT ISSR
39 Fruitfull_F131 ATGGGAAGAGGTAGGG RFLP (Gen
especfico)
40 Fruitfull_R1218 GATACTTGAACGCTATGAT RFLP (Gen
especfico)
41 Fruitfull_R3056 GATTAAGGAGAGGGAGAAG RFLP (Gen
especfico)

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

La PCR fue realizada con los 20 primers individuales de los RAPDs, 18 primers
individuales de los ISSRs, y tres primers diseados a partir del Fruitfull, utilizados en
parejas: Fruitfull_F131 y Fruitfull_R1218 y Fruitfull_F131 y Fruitfull_R3056, usando
un termociclador (MaxyGene Gradient). Los componentes de la mezcla de PCR (25
l) fueron: 300 ng de ADN genmico, 1 mM de MgSO4, 0.25 mM de dNTPs, 0.4 M
de primer, 1X ThermoPol buffer y 1 unidad de Taq DNA Polymerasa (Invitrogen). Las
condiciones de termociclaje de la PCR para los RAPDs fueron: 95 oC por 5 min para
la desnaturalizacin inicial del ADN, 35 ciclos de 95 oC por 1 min, 40 oC por 30 seg,

87
72 oC por 1 min y 40 seg y 72 oC por 10 min para la extensin final. Las condiciones
o
de termociclaje de la PCR para los ISSRs fueron: 95 C por 5 min para la
desnaturalizacin inicial del ADN, 35 ciclos de 95 oC por 1 min, 42 oC por 45 seg, 68
o
C por 1 min y 40 seg y 68 oC por 5 min para la extensin final. Las condiciones de
termociclaje de la PCR para los primers derivados del Fruitfull fueron: 95 oC por 5
min para la desnaturalizacin inicial del ADN, 35 ciclos de 95 oC por 1 min, 40 oC por
45 seg, 68 oC por 3 min y 15 seg y 68 oC por 5 min para la extensin final.

Los productos de la PCR (25 l) no digeridos, provenientes de los ISSRs y de los

primers derivados del Fruitfull, fueron mezclados con 10 l de bromofenol azul 6X.
Posteriormente, 15 l de la mezcla fueron cargados en geles de agarosa al 1%
sumergidos en buffer de Tris-sodio Acetato-EDTA (TAE) 1X, utilizando 10 l de Gene
Ruler 100 pb Plus y 10 l de 1 Kb Plus (Thermo Scientific), como marcadores de
ADN de peso molecular estndar. La electroforesis fue realizada en un analizador
gentico (Cleaver scientific Ltd), por 45 min a 85 volts. Los geles fueron teidos con
bromuro de etidio y fotografiados bajo luz Uv, usando un fotodocumentador
(Universal Hood II, Bio Rad).

Digestin de ADN con enzimas de restriccin

Los productos de la PCR (25 l) no digeridos, provenientes de los ISSRs y de los
primers derivados del Fruitfull, fueron sometidos a una digestin doble utilizando las
enzimas de restriccin BglII y BamHI, a 37 oC por 3 h. Los productos de la PCR
digeridos fueron mezclados con 10 l de bromofenol azul 6X. Posteriormente, 20 l
de la mezcla fueron cargados en geles de poliacrilamida al 6 % sumergidos en TBE
buffer 0.5X, utilizando 10 l de Gene Ruler 100 pb Plus y 10 l de 1 Kb Plus (Thermo
Scientific) como marcadores de ADN de peso molecular estndar. La electroforesis
fue realizada en una cmara vertical (Dual T MVG-216-33, C. B. S. Scientific), por
150 min a 100 volts. Los geles fueron teidos con Sybrgold (Invitrogen) y
fotografiados bajo luz Uv, usando un fotodocumentador (Universal Hood II, Bio Rad.

88
Figura 8. Diseo de primers utilizando la secuencia del ADNc del gen AT5G60910 (Fruitfull) de A.
thaliana. A) Alinemaiento BLAST de la secuencia del ADNc de A. thaliana con varias
especies de plantas. B) Coordenadas de los primers utilizados basndonos en la secuencia
del ADN genmico del Fruitful.

89
Diseo experimental y anlisis estadstico
Se utilizaron tres repeticiones de cada poblacin de higo con cada uno de los primers
individuales de los RAPDs, ISSRs, y tres repeticiones para cada pareja de primers
derivados del Fruitfull (Fruitfull_F131 y Fruitfull_R1218 y Fruitfull_F131 y
Fruitfull_R3056). El patrn de electroforesis obtenido despus de la digestin con
enzimas de restriccin fue analizado en dos partes. Primeramente, fue estimado el
tamao de las bandas utilizando como referencia los marcadores de ADN de peso
molecular estndar. Posteriormente, el patrn de bandas observado en los geles fue
asignado a un sistema binario de 0 y 1. El 0 fue asignado cuando una banda estuvo
ausente y el 1 fue asignado cuando una banda estuvo presente. El coeficiente de
similaridad de Nei y Li/Dice (Nei y Li, 1979) entre las poblaciones de higo fue
determinado por anlisis de clusters, mediante el mtodo UPGMA (Unweigthed pair
Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA), en el paquete para anlisis de datos
genticos FreeTree (versin [Link]), considerando el mtodo de remuestreo
bootstrapping con 200 repeticiones. El rbol filogentico fue visualizado en el
programa Tree View (versin 1.6.6). Las figuras fueron editadas en el programa
Illustrator CS3 (versin 13.0) para computadora personal.

Variables respuesta
Nmero de bandas totales. Fue cuantificado en el patrn de electroforesis de
los geles de poliacrilamida obtenidos de cada primer individual de los RAPDs,
ISSRs y de la pareja de primers del Fruitfull (Fruitfull_F131 y Fruitfull_R1218 y
Fruitfull_F131 y Fruitfull_R3056).

Nmero de bandas polimrficas. Este nmero se obtuvo a partir del patrn de

electroforesis de los geles de poliacrilamida obtenidos de cada primer individual
de los RADPs, ISSRs y de la pareja de primers del Fruitfull (Fruitfull_F131 y
Fruitfull_R1218 y Fruitfull_F131 y Fruitfull_R3056).

90
 Polimorfismo (%). El porcentaje de polimorfismo fue determinado con base en el
nmero de bandas totales (NBT) y el nmero de bandas polimrficas (NBP) de
ADN, observadas en el patrn de electroforesis de los geles de poliacrilamida
obtenidos de cada primer individual y la pareja de primers derivados del Fruitfull
(Fruitfull_F131 y Fruitfull_R1218 y Fruitfull_F131 y Fruitfull_R3056), mediante la
ecuacin: Polimorfismo (%)= [(NBP * 100)/NBT].

5.5. Resultados y Discusin

Huellas de ADN de higo con RAPDs e ISSRs

Las poblaciones de higo descritas en este estudio mostraron caractersticas del fruto
claramente distintas an creciendo bajo las mismas condiciones ambientales de
humedad y temperatura (Cuadro 6, 8,10, Figura 5) y de manejo agronmico, lo cual
sugiere que las poblaciones de higo son genticamente diferentes entre ellas. Para
probar esta hiptesis, nosotros realizamos un anlisis de huellas genticas de ADN
basado en una combinacin de RAPDs, ISSRs y RFLPs (gen especfico derivado del
Fruitfull).

De 20 primers individuales de los RAPDs y 18 primers individuales del tipo ISSR,

solo cuatro ISSRs (Cuadro 12) generaron productos de PCR abundantes y visibles
en geles de agarosa al 1 % (Figura 9 A). Una banda prominente estuvo presente a
750 pares de bases (pb). Sin embargo, bandas menos abundantes estuvieron
presentes entre 1 y 2 kilobases (Kb). Interesantemente, la digestin doble de los
productos de PCR con las enzimas BglII-BamHI (RFLP) gener un patrn de
electroforesis que permiti distinguir claramente las poblaciones de higo (Figura 9 B).

Un total de 14 bandas, 10 de ellas polimrficas (Cuadro 12), fueron observadas entre

75 pb y 1.5 Kb. La variedad Tetela present una banda distintiva en una posicin
superior a 1.5 Kb. Salvatierra present dos bandas distintivas a 90 y 150 pb.
Ixmiquilpan present una banda distintiva a 150 pb. Zacapala careci de una banda

91
a 90 pb y otra banda a 1.4 Kb. Tecmac careci de una banda a 150 pb y present
una banda distintiva a 1.0 Kb. Neza careci de tres bandas, una a 90 pb, otra a 150
pb y la otra a 1.0 Kb.

Cuadro 12. Nmero de bandas totales y polimrficas y polimorfismo de los primers

que generaron bandas de ADN visibles para la diferenciacin molecular
de poblaciones de higos del centro de Mxico.
No. Nombre Tipo de Tm X At Y Nmero de bandas PMF Z
primer (oC) (oC) Totales Polimrficas (%)
25 (ACTG)4 ISSR 47 42 14 10 71.42

31 (AGAC)4GC ISSR 54 49 24 12 50.00

32 (CA)8AGC ISSR 53 48 17 7 41.18

35 (GACA)4GT ISSR 51 46 18 15 83.33

39 Fruitfull_F131 RFLP 58 53 - - -
40 Fruitfull_R1218 RFLP 45 40 22* 5* 22.72*
41 Fruitfull_R3056 RFLP 48 43 26** 10** 38.46**
XTemperatura de fusin (oC), YTemperatura de alineamiento (oC), ZPolimorfismo (%). *Datos obtenidos
de la pareja de primers Fruitfull_F131 y Fruitfull_R1218. **Datos obtenidos de la pareja de primers
Fruitfull_F131 y Fruitfull_R3056.

Utilizando el patrn de electroforesis de los geles de poliacrilamida, fue estimado el

coeficiente de similaridad de Nei y LiDice (Nei y Li, 1979) entre las poblaciones de
higo, mediante el mtodo UPGMA. El anlisis del cluster discrimin a todas las
poblaciones evaluadas en este estudio. Con base en estos resultados, nosotros
concluimos que las poblaciones descritas aqu (Ixmiquilpan, Neza, Salvatierra,
Tecmac, Tetela y Zacapala) son genticamente diferentes. Sin embargo, el rbol
filogentico y el coeficiente de similaridad obtenido (Figura 10) no mostr correlacin
con las caractersticas del fruto (Figura 5).

92
Figura 9. Huellas de ADN de diferentes poblaciones de higo del centro de Mxico (1: Ixmiquilpan, 2:
Salvatierra, 3: Tecmac, 4: Tetela, 5: Neza, 6: Zacapala), utilizando ISSRs. A. thaliana
variedad Columbia (Col-0) fue incluida como testigo. A) Patrn de electroforesis de los
productos de PCR corridos en geles de agarosa al 1 %. B) Patrn de electroforesis de los
productos de PCR digeridos con las enzimas BglII-BamHI, corridos en geles de poliacrilamida
al 6 %. Los marcadores de 100 pb y 1Kb fueron utilizados como marcadores de ADN de peso
molecular estndar. El panel inferior de los geles de poliacrilamida muestra una exposicin
ms larga del rea entre 0.075 y 0.2 Kb.

93
Una explicacin de la falta de correlacin es que adems de las caractersticas del
fruto, las poblaciones descritas en este estudio posiblemente son diferentes en varias
caractersticas como el contenido de azcares, la firmeza, el sabor, el contenido de
antocianinas y polifenoles, la resistencia a plagas o enfermedades, la resistencia a
bajas temperaturas o a estrs hdrico. De acuerdo con esta hiptesis, nosotros
hemos observado que el genotipo Ixmiquilpan presenta los frutos ms firmes,
mientras que Neza presenta los frutos ms suaves. Tecmac ha mostrado mayor
resistencia a estrs hdrico que las otras poblaciones, y Tetela ha mostrado la mayor
sensibilidad a las bajas temperaturas.

Figura 10. rbol filogentico (200 remuestreos) de diferentes poblaciones de higo del centro de Mxico,
basado en los patrones de electroforesis de los geles de poliacrilamida de los ISSRs, con
tres repeticiones (A, B y C) de cada poblacin.

94
Huellas de ADN de higo con primers derivados del Fruitfull (RFLPs)
La principal diferencia entre las poblaciones de higo descritas en este estudio es la
morfologa del fruto (Figura 5). No existe informacin disponible a cerca de los genes
que determinan las caractersticas en frutos de higo. Sin embargo, en la planta
modelo A. thaliana se conocen 27 genes responsables de las caractersticas del
desarrollo del fruto (Roeder y Yanofsky, 2006). Interesantemente, el gen responsable
del tamao del fruto (Fruitfull) est altamente conservado en algunas especies de
plantas (Figura 8 A). Con base en este resultado, nosotros formulamos la hiptesis
que el higo tiene un gen homlogo del Fruitfull. Para probar esta hiptesis, nosotros
generamos un primer iniciador y dos primers reversos basados en la secuencia del
Fruitfull (Figura 8 B). Estos primers fueron utilizados para la PCR del ADN genmico
de los higos. En todas las poblaciones, estos primers produjeron un producto
abundante de PCR de aproximadamente 900 pb (Figura 11 A). Sin embargo, fueron
observadas bandas adicionales entre 200 y 500 pb y entre 2 y 3 Kb.

La digestin de los productos de PCR con las enzimas BglII-BanHI, utilizando los
primers Fruitfull_F131 y Fruitfull_R1218 o Fruitfull_F131 y Fruitfull_R3056, gener
varias bandas polimrficas (Cuadro 12) que permitieron distinguir claramente a todas
las poblaciones. En el rea entre 0.075 y 0.2 Kb, los productos de PCR digeridos
utilizando la pareja de primers Fruitfull_F131 y Fruitfull_R1218, revelaron diferencias
muy claras entre las poblaciones (Figura 11 B). Neza careci de dos bandas entre
100 y 150 pb. Ixmiquilpan careci de una banda a 150 pb y present una banda
adicional a 75 pb. Tetela careci de una banda a 150 pb. Tecmac present dos
bandas muy cercanas una de la otra a 150 pb. Salvatierra y Zacapala fueron muy
similares. Sin embargo, estas dos poblaciones fueron diferenciadas claramente en la
digestin de los productos de PCR generados al utilizar la pareja de primers
Fruitfull_F131 y Fruitfull_R3056 (Figura 11 B). Salvatierra present una banda a 45
pb que estuvo ausente en Zacapala.

95
 A Geles de agarosa

Fruitfull F_131 y R_1218 Fruitfull F_131 y R_3056

Col 1 2 3 4 5 6 Col 1 2 3 4 5 6
- 3.0 Kb - 3.0 Kb
- 1.5 Kb - 1.5 Kb
- 1.0 Kb - 1.0 Kb
- 0.5 Kb - 0.5 Kb
- 0.2 Kb - 0.2 Kb

100 pb 1 Kb 100 pb 1 Kb

B Geles de acrilamida

Fruitfull F_131 y R_1218 Fruitfull F_131 y R_3056

Col 1 2 3 4 5 6 Col 1 2 3 4 5 6

- 3.0 Kb - 3.0 Kb

- 1.5 Kb - 1.5 Kb

- 0.5 Kb
- 0.5 Kb

- 0.2 Kb - 0.2 Kb

- 0.075 Kb - 0.075 Kb

- 0.2 Kb - 0.2 Kb
- 0.075 Kb
- 0.075 Kb

100 pb 1 Kb 100 pb 1 Kb

Figura 11. Huellas de ADN de diferentes poblaciones de higo del centro de Mxico (1: Ixmiquilpan, 2:
Salvatierra, 3: Tecmac, 4: Tetela, 5: Neza, 6: Zacapala), utilizando los primers especficos
diseados a partir del Fruitfull. A. thaliana variedad Columbia (Col-0) fue incluida como
testigo. A) Patrn de electroforesis de los productos de PCR corridos en geles de agarosa
al 1 %. B) Patrn de electroforesis de los productos de PCR digeridos con las enzimas
BglII-BamHI, corridos en geles de poliacrilamida al 6 %. Los marcadores de 100 pb y 1Kb
fueron utilizados como marcadores de ADN de peso molecular estndar. El panel inferior
de los geles de poliacrilamida muestra una exposicin ms larga del rea entre 0.075 y 0.2
Kb.

96
Con base en el patrn de electroforesis observado en los productos de PCR (primers
Fruitfull_F131 y Fruitfull_R1218 y Fruitfull_F131 y Fruitfull_R3056), digeridos y
corridos en geles de poliacrilamida, fue estimado el coeficiente de similaridad de Nei
y LiDice (Nei y Li, 1979) entre las poblaciones de higo, mediante el mtodo UPGMA.
El anlisis del cluster (Figura 12) discrimin a todas las poblaciones. Estos
resultados confirman que las poblaciones de higo descritas en este estudio
(Ixmiquilpan, Neza, Salvatierra, Tecmac, Tetela y Zacapala) son genticamente
diferentes. Adems, el rbol filogentico y la distancia gentica obtenida (Figura 12)
mostr una correlacin muy alta con las caractersticas del fruto (Figura 5).

Figura 12. rbol filogentico (200 remuestreos) de diferentes poblaciones de higo del centro de Mxico,
basado en los patrones de electroforesis de los geles de poliacrilamida de los primers
especficos diseados a partir del Fruitfull, con tres repeticiones (A, B y C) de cada
poblacin.

97
Los resultados de este estudio sugieren que el higo presenta un gen homlogo del
gen Fruitfull que determina el tamao del fruto y que las poblaciones de higos
mexicanos descritas en este estudio han acumulado mutaciones en ese gen. Los
higos negros en Mxico se derivan de la variedad Black Mission. Sin embargo,
despus de cientos de aos de introduccin de la planta en nuestro pas, el higo se
ha adaptado a diferentes condiciones ambientales y ha fijado genticamente tales
adaptaciones. En este estudio, nosotros presentamos dos lneas de evidencias que
muestran que las poblaciones de higo negro en Mxico representan variedades
claramente distintas entre ellos.

1) Huellas de ADN basadas en anlisis de ISSRs.

2) Huellas de ADN basadas en anlisis del Fruitfull (RFLPs).

Con este estudio, no podemos conocer la distancia gentica que existe entre las
poblaciones de higos mexicanos y la variedad Black Mission. Sin embargo, utilizando
la metodologa descrita aqu, esa distancia puede ser determinada. Adicionalmente,
la misma metodologa puede ser utilizada para caracterizar otras poblaciones de higo
provenientes de cualquier lugar de Mxico o del mundo. Esta metodologa tambin
puede adaptarse a cualquier otra especie de plantas.

5.6. Conclusiones

El higo presenta un gen homlogo del gen Fruitfull que determina el tamao del
fruto.

Las huellas de ADN indican que las poblaciones mexicanas de higo identificadas
en este estudio (Ixmiquilpan, Salvatierra, Tecmac, Tetela, Neza y Zacapala) son
genticamente diferentes entre ellas a nivel de genoma y a nivel especfico del
gen responsable del tamao del fruto.

98
 La distancia gentica que existe entre las variedades Mexicanas de higo y la
variedad Black Mission puede ser determinada utilizando los primers
Fruitfull_F131, Fruitfull_R1218 y Fruitfull_R3056, diseados en este estudio.

5.7. Literatura Citada

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102
 VI. VALOR NUTRITIVO Y NUTRACUTICO DE VARIEDADES MEXICANAS DE
HIGO (Ficus carica L.)

6.1. Resumen

Los frutos de higo (Ficus carica L.) son nutritivos y saludables, no contienen grasa ni
colesterol y aportan antioxidantes. La composicin mineral y nutracutica de los
frutos de higo de las variedades mexicanas son completamente desconocidos.
Nosotros cultivamos plantas de higo de la variedad Neza en condiciones de
invernadero. En este estudio nosotros presentamos una evaluacin del valor nutritivo
y nutracutico de los frutos de higo de la variedad Neza, basado en el contenido de
minerales, fenoles y antocianinas totales, en diferentes pocas del ao. Nuestros
resultados muestran que el contenido de minerales, fenoles y antocianinas totales no
vara en funcin de la poca del ao. De nueve elementos minerales analizados, los
ms abundantes fueron el K (1073.06), Ca (330.21), P (123.43), y Mg (121.22) en mg
por 100 g de materia seca. Estos valores de Ca y K superan ampliamente a los frutos
de papaya, naranja, pltano, cereza, chicozapote, ciruela, chirimoya, durazno, fresa,
guanbana, guayaba, kiwi, limn, mandarina, mamey, mango, manzana, zarzamora,
pitahaya, uva, pera y pia. El contenido medio de fenoles y antocianinas totales fue
de 1,469.85 y 334.60 mg por 100 g de tejido fresco, respectivamente. Los anlisis de
HPLC demuestran que el higo contiene por lo menos 12 tipos de compuestos
fenlicos. Nosotros reportamos por vez primera la presencia de lutena en frutos de
higo. Los anlisis bioqumicos de los higos mexicanos de la variedad Neza nos llevan
a la conclusin de que los frutos de higo presentan el mismo valor nutritivo y
nutracetico en cualquier poca de ao.

Palabras clave: contenido mineral, fenoles, antocianinas, higo, compuestos

fenlicos.

103
 NUTRITIVE AND NUTRACEUTICAL VALUE OF MEXICAN FIG (Ficus carica L.)
VARIETIES

6.2. Abstract

The fig fruits (Ficus carica L.) are nourishing and healthy, they contain no fat or
cholesterol and provide antioxidants. The mineral and nutraceutical composition of
the Mexican fig fruit varieties are completely unknown. We grew Neza variety fig
plants under greenhouse conditions. In this study we present an evaluation of the
nutritional and nutraceutical value of the Neza fig fruits variety, based on the content
of minerals, phenols and anthocyanins in different seasons of the year. Our results
show that the content of minerals, phenols and anthocyanins does not vary through
the seasons of the year. From nine mineral elements analyzed here, the most
abundant minerals were K (1073.06), Ca (330.21), P (123.43) and Mg (121.22) in mg
per 100 g of dry matter. These values of Ca and K are higher than the content of Ca
and K in papaya, orange, banana, cherry, sapodilla, plum, custar apple, peach,
strawberry, guanabana, guava, kiwi, lime, mandarin, mamey, mango, apple,
blackberry, pitahaya, grape, pear, and pineapple. The average content of total
phenols and anthocyanins was 1469.85 and 334.60 mg per 100 g of fresh tissue,
respectively. This is the first time that the presence of lutein in fig fruits is detected.
HPLC analysis showed that the fig contains at least 12 kinds of phenolic compounds.
We reported here for the very first time the presence of lutein in fruits of fig.
Biochemical analyses of the Mexican fig variety Neza lead us to the conclusion that
fig fruits have the same nutritional and nutraceutical value at any time of the year.

Key words: mineral content, phenols, anthocyanin, fig fruits, phenolic compounds.

104
 6.3. Introduccin

El valor nutritivo de los frutos de higo se debe al contenido elevado de vitaminas,

minerales, carbohidratos, protenas y fibra diettica (Baccaunaud et al., 1995; Ersoy
et al., 2007). Los compuestos ms abundantes son la glucosa y la fructosa (3.49 y
2.54 mg por 100 g de materia seca, respectivamente) y los minerales como el calcio
(162.0-295.86), magnesio (68.0-71.64), potasio (680.0-739.75), fsforo (67.0) sodio
(10.0-28.95), fierro (2.03) y zinc (1.25) en mg por 100 g de materia seca (Aljane et
al., 2007; Ersoy et al., 2007).

El valor nutracutico de los frutos de higo se debe principalmente al contenido de

compuestos fenlicos como los fenoles (1000 a 1100 mg kg-1) (Vinson, 1999) y
antocianinas (162 mg kg-1) (Vinson, 1999; Aguilera et al., 2009), y anticancergenos
como el benzaldehdo (Slavin, 2006). Estos compuestos tienen importancia
fisiolgica, debido a que mejoran la calidad de vida del humano, mantienen niveles
adecuados de salud, previenen enfermedades crnico degenerativas y actan como
antioxidantes, previniendo al organismo de daos por oxidacin celular incluso a
nivel de ADN (Vinson, 1999; Piga et al., 2008; El Gharras, 2009).

La variedad espaola conocida como Black Mission es la que posee los contenidos
ms altos de antocianinas y la que presenta la capacidad antioxidante ms elevada
(36 %) de todos los tipos de higueras y colores del fruto (Solomon et al., 2006). Sin
embargo, el valor nutritivo y nutracutico que presenten los frutos de higo al
momento de la cosecha puede ser modificado por factores diversos, como las
condiciones edafoclimticas del cultivo, el sitio de cultivo, el tipo de higuera, la
variedad, la edad de la planta, la etapa de desarrollo del fruto, la poca de cosecha,
y el manejo agronmico del cultivo (Baccaunaud et al., 1995; Melgarejo, 2000; Piga
et al., 2003; Koyuncu, 2004; Ersoy et al., 2008; El-Gharably et al., 2009; Sen et al.,
2010.

105
Aun cuando el higo se consume en Mxico y es un fruto muy apreciado, el valor
nutritivo y nutracutico de las variedades mexicanas de higo, son desconocidos. En
estudios previos sobre la caracterizacin morfolgica y gentica de seis variedades
mexicanas de higo, nosotros identificamos a la variedad Neza como la ms
sobresaliente en caracteres agronmicos. Esa caracterizacin fue complementada
bioqumicamente, y aqu presentamos evidencias del contenido mineral y
compuestos fenlicos de esta variedad en diferentes pocas del ao.

6.3.1. Objetivo

Determinar el valor nutritivo y nutracutico de frutos de higo de la variedad Neza, con

base en el contenido de minerales, fenoles y antocianinas.

6.3.2. Hiptesis

Ho: El contenido de minerales, fenoles y antocianinas de los frutos de higo, vara con
la poca del ao.

Ha: El contenido de minerales, fenoles y antocianinas de los frutos de higo, no vara

con la poca del ao.

6.4. Materiales y Mtodos

Material vegetal
De las seis variedades de higos mexicanos evaluadas en Captulos previos (III y V)
de esta investigacin, la variedad Neza fue seleccionada para realizar estudios del
valor nutritivo y nutracutico, por presentar sta caracterstica agronmica

106
sobresaliente, como un alto potencial de rendimiento 120 ton ha-1 y frutos de tamao
muy grande (100 g en promedio).

Reproduccin y cultivo de las plantas

Plantas de higo de la variedad Neza, reproducidas por estacas, conforme a lo descrito
en el Captulo III de esta investigacin, fueron cultivadas en invernadero bajo las
mismas condiciones ambientales (Cuadro 13) y de manejo agronmico.

Cuadro 13. Temperatura y humedad relativa prevalecientes en el invernadero,

durante la produccin de higos de la variedad Neza, utilizados para
determinar el contenido de minerales, fenoles y antocianinas del fruto.
Condicin ambiental Agosto Septiembre Octubre
Temperatura (oC)
Mnima 9.21 1.86 2.78
Media 18.77 18.26 17.50
Mxima 37.92 39.94 44.34
Humedad relativa (%)
Mnima 30.58 25.37 15.68
Media 73.48 74.99 71.28
Mxima 92.46 92.95 92.42

Determinacin del contenido de minerales, fenoles y antocianinas

Entre agosto y octubre del 2011, cuando las plantas de higo producidas en
invernadero bajo las mismas condiciones ambientales (Cuadro 13) y de manejo
agronmico se encontraban a la mitad del periodo de cosecha, se realiz la
cuantificacin del contenido de minerales, fenoles y antocianinas, en frutos
completamente maduros de la variedad Neza. En cada fecha de cosecha, fueron
seleccionados al azar 4 frutos provenientes del tercio medio de plantas individuales.
Para asegurar que los frutos presentaran madurez homognea al momento de la

107
cosecha, con base en la experiencia de la autora, fueron seleccionados higos con
exocarpio completamente negro, suaves al tacto y con pednculo curvo. Los frutos
fueron cosechados entre las 9:00 y 10:00 horas e inmediatamente fueron trasladados
al laboratorio de Ciencias Ambientales del Postgrado de Edafologa del Colegio de
Postgraduados, Campus Montecillo, para la evaluacin del contenido mineral; al
laboratorio de Fisiologa y Biofsica del Postgrado de Botnica, para determinar el
contenido de fenoles y antocianinas totales; y al laboratorio de Fitoqumica, para
realizar la identificacin de los compuestos fenlicos.

Diseo experimental y anlisis estadstico

Para la cuantificacin del contenido de minerales, fenoles y antocianinas de los frutos
de higo, se utiliz un diseo experimental completamente al azar con tres
tratamientos formados por la poca de cosecha del fruto (1: 27 de agosto, 2: 20 de
septiembre y 3: 29 de octubre), con 4 repeticiones cada uno. En ambos casos, los
datos fueron sometidos a pruebas de normalidad (Kolmogorov-Smirnov) y
homogeneidad de varianzas (Bartlett) en el paquete estadstico SAS. Se verific que
cumplieran con los supuestos bsicos del anlisis de varianza. Los datos se
sometieron a anlisis de varianza y pruebas de comparacin de medias con la
prueba de Tukey (P0.05), en el paquete estadstico SAS para computadora
personal (SAS, 1999-2000, versin 8.1). La representacin grfica de los datos se
realiz en el programa SigmaPlot (versin 10.1) para computadora personal.

Variables respuesta
Contenido mineral. Los frutos recin cosechados fueron sometidos a secado
hasta peso constante, en un deshidratador elctrico (Blue M, PoweroMatic 60)
con aire circulante a 105 oC. Inmediatamente despus, se enviaron al laboratorio
de Ciencias Ambientales del Postgrado de Edafologa del Colegio de
Postgraduados Campus Montecillo, para la determinacin del contenido mineral,

108
 utilizando la tcnica de diagnstico en horno de microondas con HNO3. El
contenido de cada elemento es expresado en mg 100 g de materia seca.

Fenoles totales. Se cuantificaron con base en el mtodo propuesto por Folin y

Ciocalteu, modificado por Waterman y Mole (1994). Se trituraron 0.5 g de pulpa
fresca con 5 ml de alcohol etlico al 80 %, durante 30 segundos, en un
homogeneizador de tejidos. A 0.15 ml de sobrenadante se le agregaron 16.85 ml
de agua desionizada y 1 ml de solucin Folin y Ciocalteu. La mezcla se agit y
antes de que transcurrieran 8 minutos se le agregaron 2 ml de carbonato de sodio
al 10 % y se dej reposar por 2 h. Se tom una alcuota de 0.1 ml y se afor a 2
ml con alcohol etlico. La lectura de absorbancia se llev a cabo a 760 nm en un
espectrofotmetro. El desarrollo de color fue proporcional a la concentracin de
fenoles libres. Para calcular la concentracin se utiliz una curva de calibracin
elaborada a partir de fenol. El resultado se expres en miligramos por 100
gramos de tejido fresco.

Antocianinas totales. Se cuantificaron con base en la metodologa propuesta

por Soto (2011). Se pesaron 4 g de tejido fresco y se maceraron con 10 ml de
etanol acidificado (80:15 HCl). La muestra se dej reposar durante 12 h. Despus
se decant y se lav con etanol hasta completar un volumen de 50 ml. Se
centrifug por 4 min a 20 oC a 3 rpm. Se tom una alcuota de 0.2 ml y se afor a
4 ml con etanol. La lectura se llev a cabo en espectrofotmetro a 535 nm.

Identificacin de compuestos fenlicos. Se llev acabo por medio de HPLC,

conforme a la metodologa de Aguilera et al. (2009), con algunas modificaciones
(Figura 13).

109
Figura 13. Secuencia de extraccin e identificacin de compuestos fenlicos de frutos de higo por
medio de HPLC.

110
 6.5. Resultados y Discusin

Contenido de minerales
De la coleccin de germoplasma de seis variedades mexicanas de higo que
establecimos en la Universidad Autnoma Chapingo, en el estado de Mxico,
seleccionamos a la variedad Neza por sus caractersticas morfolgicas y genticas
sobresalientes, para evaluar su valor nutritivo y nutracutico. Esta es la primera vez
que se realiza un estudio de esta naturaleza en Mxico. Las plantas fueron
cultivadas en invernadero con aplicacin de solucin nutritiva a la largo del ciclo del
cultivo. La cuantificacin del contenido mineral de los frutos en diferentes pocas del
ao mostr que no hay variacin en ninguno de los nueve elementos (Cuadro 14)
evaluados en este estudio.

Cuadro 14. Composicin mineral (mg por 100 g de materia seca) de frutos de higo
de la variedad Neza, producidos en invernadero en diferente poca del
ao.
Elemento poca del ao Media
Agosto Septiembre Octubre
Ca 362.32 a 307.39 a 320.93 a 330.21
K 1159.53 a 1056.86 a 1002.79 a 1073.06
Mg 124.31 a 132.80 a 106.54 a 121.22
Mn 0.83 a 0.80 a 0.75 a 0.79
P 116.89 a 137.80 a 115.61 a 123.43
Na 16.34 a 9.54 a 11.00 a 12.29
Fe 2.24 a 4.35 a 5.29 a 3.96
Cu 0.05 a 0.43 a 0.06 a 0.18
Zn 0.73 a 1.17 a 1.08 a 0.99
Valores seguidos por la misma letra dentro de hileras indican similitud estadstica con la prueba de
Tukey (P 0.05, n=4).

El contenido mineral de frutos de higo de algunas variedades est disponible en la

literatura (Hakerlerler et al., 1998; USDA, 2005; Aljane et al., 2007; INCAP, 2012).
Los principales elementos que han sido identificados en los frutos frescos son el Ca,
K, Mg, Mn, P, S, Na, Cu, Fe y Zn. Para F. carica L., en general, el contenido vara

111
entre 0.51 y 680 (USDA, 2005) o entre 0.07 a 232 mg por 100 g de materia seca
(INCAP, 2012).

Nosotros utilizamos el contenido mineral de la variedad Bursa Black como referencia

para comparar a la variedad Neza evaluada en este estudio. Variacin significativa
fue observada en los contenidos de Ca (330.21 mg por 100 g de materia seca) y K
(1073.06 mg por 100 g de materia seca), de la variedad Neza, que superan a los
higos de la variedad Bursa Black en 82.87 y 74.46 %, respectivamente (Hakerlerler
et al., 1998). Las diferencias se atribuyen a que nuestros resultados provienen de
plantas cultivadas en invernadero con fertirriego, mientras que la variedad Bursa
Black fue producida en campo.

Los minerales ms abundantes de los higos de la variedad Neza fueron el K, Ca, Mg

y P, y los elementos ms escasos fueron el Mg, Cu y Zn (Cuadro 14). El
comportamiento constante de los minerales en las diferentes pocas del ao se
puede atribur a que la fertilizacin se manej de manera homognea durante el ciclo
del cultivo. Nuestros resultados demuestran que los higos mexicanos de la variedad
Neza son fuente extraordinaria de minerales, cuyos contenidos de Ca y K superan
ampliamente a los frutos de papaya (24 y 257), naranja (43 y 200), pltano (3 y 499),
cereza (16 y 173), chicozapote (21 y 193), ciruela (6 y 157), chirimoya (8 y 269),
durazno (10.6 y 272), fresa (16 y 153), guanbana (14 y 278), guayaba (28 y 284),
kiwi (34 y 312), limn (24 y 138), mandarina (37 y 166), mamey (11 y 47), mango (12
y 178), manzana (13 y 240), zarzamora (29 y 162), pitahaya (10 y 0), uva (15 y 185),
pera (6 y 119), y pia (13 y 108) mg por 100 g de materia seca (INCAP, 2012).

Contenido de fenoles y antocianinas totales

El contenido de fenoles y antocianinas de los frutos de higo de la variedad Neza
evaluados en este estudio tambin se mantuvo constante (Figura 14), lo cual indica
que en invernadero se pueden producir frutos de higo de alto valor nutritivo y
nutracutico en cualquier poca del ao.

112
 1800! Fenoles totales!
1600! Antocianinas totales!

1400!

1200!
-1
mg kg

1000!

800!

600!

400!

200!

0!
Agosto! Septiembre! Octubre!

Figura 14. Contenido de fenoles y antocianinas totales de frutos de higo de la variedad Neza,
producidos en invernadero en diferentes pocas del ao.

Las propiedades nutracuticas del higo, atribuidas al contenido de fenoles y

antocianinas, han sido poco estudiadas (Vinson, 1999; Piga et al., 2008; Aguilera et
al., 2009; El Gharras, 2009). En la literatura solo est disponible la informacin para
Ficus carica L. en general. Los fenoles totales varan de 1000 a 1100 mg kg-1
(Vinson, 1999). En la variedad espaola conocida como Black Mission, el contenido
de antocianinas es de 162 mg kg-1 (Aguilera et al., 2009). En este estudio, nosotros
encontramos que los higos de la variedad Neza, presentan contenidos medios de
fenoles totales de 1469.85 mg kg-1 y antocianinas totales de 334.60 mg kg-1. La suma
de fenoles y antocianinas es de 1,804.45 mg kg-1, superando ampliamente a la
zarzamora (1,305 mg kg-1), el caf (733 mg kg-1), y el vino rojo (800 mg kg-1), y
mostrando valores dentro del rango del contenido de fenoles totales del arndano
(250-5,000 mg kg-1) (El Gharras, 2009).

Es probable que las diferencias en el contenido de fenoles y antocianinas totales

puedan deberse a variacin gentica, a las regiones de cultivo de las plantas, las
condiciones ambientales y al mtodo utilizado para la extraccin y cuantificacin de
los compuestos fenlicos. Sin embargo, nuestros resultados demuestran que la

113
variedad de higo conocida como Neza es una fuente extraordinaria de antioxidantes
naturales que pueden ayudan a mejorar la calidad de vida del humano.

Identificacin de compuestos fenlicos

Los anlisis de HPLC permitieron identificar por lo menos 12 tipos de compuestos
fenlicos presentes en los frutos de higo de la variedad Neza (Figura 15). Esta es la
primera vez que se reportan ms de tres compuestos fenlicos en frutos de higo
(Piga, et al., 2008; Aguilera et al., 2009). Sin embargo, debido a la falta de
estndares de comparacin, de los 12 compuestos, solamente tres pudieron ser
identificados como rutina con un rea de 22.33 %, cianidina con un rea de 27.54 %,
y lutena con un rea de 6.61 %.

Rutina

Cianidina

Lutena

Figura 15. Compuestos fenlicos identificados en frutos de higo de la variedad Neza, producidos
invernadero en diferentes pocas del ao.

114
Los trabajos sobre identificacin de compuestos fenlicos en frutos de higo son muy
escasos (Piga, et al., 2008; Aguilera et al., 2009). Los compuestos identificados
hasta antes de que realizramos esta investigacin eran la rutina, la cianidina y el
cido cafico (Piga, et al., 2008; Aguilera et al., 2009). Sin embargo, en este estudio
nosotros encontramos que los higos mexicanos de la variedad Neza contienen un
compuesto fenlico llamado lutena, el cual es importante porque previene la prdida
visual y protege los ojos y la piel de los efectos dainos del sol.

La presencia de diferentes compuestos fenlicos en los higos de la variedad Neza

pudiera deberse a la interaccin de factores como las condiciones edafoclimticas en
que se llev a cabo el cultivo, el tipo de higuera producida, la variedad, la edad de la
planta y el manejo agronmico del cultivo.

6.6. Conclusiones

Los higos mexicanos de la variedad Neza presentan el mismo valor nutritivo y

nutracutico en cualquier poca de ao.

Los minerales ms abundantes de los frutos de higo de la variedad Neza son el

potasio, calcio, fsforo y magnesio.

Los higos de la verdad Neza son ricos en compuestos fenlicos, con mayor
proporcin de fenoles que antocianinas, resaltando uno, la lutena, que no haba
sido encontrado antes.

115
 6.7. Literatura Citada

Aguilera O., M.; M. G. Alanis G.; C. L. Garca D.; C. M., Hernndez B. 2009.
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117
VII. IDENTIFICACIN Y CONTROL DE HONGOS CAUSANTES DEL DETERIORO
POSTCOSECHA DE HIGO (Ficus carica L.)

7.1. Resumen

El fruto de higo (Ficus carica L.) es atacado por diversas clases de microorganismos
que generan prdidas postcosecha hasta del 50 %. El control de microorganismos se
realiza con productos qumicos que restringen la comercializacin del fruto por los
efectos nocivos en la salud de los consumidores. En Mxico, se desconoce la clase
de microorganismos causantes de las prdidas postcosecha de higo y su control.
Nosotros planteamos la hiptesis de que los frutos de higo son atacados por diversas
clases de microorganismos. Para probar esta hiptesis, nosotros cultivamos plantas
de higo de la variedad Neza en condiciones de invernadero. Aqu presentamos un
estudio de la efectividad de diferentes compuestos seguros sobre el control de
microorganismos causantes de las prdidas potcosecha del fruto. Nuestros
resultados muestran que los frutos de higo nicamente fueron atacados por hongos.
No se detect la presencia de bacterias ni levaduras en los frutos. La principal causa
de las prdidas postcosecha de los frutos de higo fueron hongos de cinco gneros
distintos: Cladosporium sphaerosperum, Fusarium equiseti, Hiphopichia burtonii,
Penicillium citrinum y Rhizopus niger. Cabe resaltar que Hyphopichia burtonii es
identificado por primera vez en frutos de higo en este estudio. El anlsis de
efectividad mostr claramente que de los tres compuestos seguros evaluados, el
cloruro de calcio al 1 % fue altamente efectivo en el control de la mayora de los
patgenos identificados en este estudio. Estos resultados nos llevan a la conclusin
de que los compuestos seguros son una buena alternativa para el control de
microorganismos, disminucin de las prdidas postcosecha y extensin de la vida til
de los frutos de higo.

Palabras clave: compuestos seguros, variedades de higo, prdidas potcosecha,

hongos.

118
 IDENTIFICATION AND CONTROL OF FUNGI CAUSING FRUIT POSTHARVEST
DECAY IN MEXICAN FIG (Ficus carica L.)

7.2. Abstract

The fig (Ficus carica L.) fruit is attacked by diverse classes of microorganisms that
generate a postharvest decay up to 50 %. The control of microorganisms is realized
with chemical products that restrict the commercialization of the fruit due to harmful
effects in the health of the consumers. In Mexico, the kind of microorganisms that
causes fig postharvest decay and their control are unknown. We propose the
hypothesis that the fig fruits are attacked by diverse kinds of microorganisms. To
prove this hypothesis, we cultivate plants of Neza fig variety under greenhouse
conditions. Here we presentent a study of the efficiency of different safe compounds
on the control of microorganisms that cause fig fruit potsharvest decay. Our results
showed that the fig fruits were attacked only by fungi. There was detected neither the
presence of bacteria nor yeasts in the fruits. The principal reason of the fig
postharvest decay was fungi of five different kinds: Cladosporium sphaerosperum,
Fusarium equiseti, Hiphopichia burtonii, Penicillium citrinum and Rhizopus niger. It is
important to mention that Hyphopichia burtonii is identified by the very first time in fig
fruits in this study. The analysis of efficiency showed clearly that from three safe
compounds evaluated, the 1 % chloride of calcium was highly effective in the control
of the majority of the pathogens identified in this study. These results lead us to the
conclusion that the safe compounds are a good alternative for controlling
microorganisms, reducing postharvest decay and extending shell life of the fig fruits.

Key words: safe compounds, fig varieties, postharvest decay, fungi.

119
 7.3. Introduccin

El higo es un fruto climatrico altamente perecedero (Kader, 2002), cuya vida de

anaquel a temperatura ambiente no supera los dos das (Venditti et al., 2005). En
estado maduro, se dificulta el manejo del fruto y su distribucin hacia los centros de
consumo, debido principalmente a que la suavidad propicia daos mecnicos que
demeritan la calidad por rompimiento de la piel. En general, un fruto de higo de
calidad adecuada para el consumo debe presentar un contenido mnimo de slidos
solubles de 14.0 % y estar libre de contaminantes fsicos y biolgicos (Kader, 2002).

El higo se cultiva en ms de 48 pases a nivel mundial, con una produccin que

supera el milln de toneladas anuales (FAO, 2010). Sin embargo, en postcosecha el
fruto es atacado por diversas clases de microorganismos, principalmente hongos
toxignicos como Aspergilus spp. y Penicillium spp. (Isman y Biyik, 2009), y por
cantidades elevadas de bacterias (2.20-2.73 cfu g-1) y de levaduras (26.5 cfu g-1)
(Demirbuker et al., 2004), que provocan cambios bioqumicos y fisiolgicos como la
prdida de peso, modificacin del color y sabor, ablandamiento excesivo e
incremento de la produccin de etileno. Como consecuencia, la vida de anaquel de la
infrutescencia es de slo dos das (Venditti et al., 2005).

El control de patgenos en higo se realiza con productos qumicos que generan

efectos residuales, lo que restringe la comercializacin del fruto por los efectos
nocivos en la salud de los consumidores (Sen et al., 2009). En contraste, otros
productos denominados compuestos seguros no causan efectos negativos en la
salud (Venditti et al., 2005), por lo que podran ser una alternativa para el control de
microorganismos y extensin de la vida til del fruto de higo.

El carbonato de sodio (Na2CO3) y el cido actico (CH3COOH), de 0.5 a 3 %, han

demostrado ser eficaces en el control de Botritys cinerea. El bicarbonato de sodio
(NaHCO3) al 0.5 %, el cloruro de calcio (CaCl2) al 3 % y cido actico (CH3COOH) al
1 %, ayudan a disminuir las prdidas postcosecha en chabacano, granada, kiwi y

120
naranja, adems de que incrementan significativamente la firmeza del fruto (Antunes
et al., 2007). El agua caliente mezclada con perxido de hidrgeno (H2O2) al 2.5 %,
no permite un buen control de microorganismos en frutos de higo (Demirbuker et al.,
2004).

En Mxico, la produccin de higo se lleva a cabo a campo abierto en condiciones de

secano. Sin embargo, la poca de cosecha se presenta durante los meses de junio y
julio, lo cual coincide con la poca de lluvias (SIAP, 2010). Por esta razn, el fruto
presenta coloraciones desuniformes y es altamente susceptible a sufrir pudriciones y
ablandamiento excesivo, que demeritan su calidad y causan prdidas postcosecha
hasta del 50 %. Esto ocurre principalmente porque el ostiolo favorece la entrada de
agua y microorganismos al interior del fruto, que son difciles de controlar (Melgarejo,
2000).

Con la produccin en invernadero, los frutos de higo se protegen de las bajas

temperaturas, la lluvia y el granizo, por lo que la cosecha de higo se puede extender
hasta por ocho meses, obteniendo hasta 120 ton ha-1 (Mendoza, 2009). Sin
embargo, se ha observado contaminacin con diversas clases de microorganismos
que demeritan la calidad, disminuyen la vida de anaquel, y generan prdidas
postcosecha de un 20 a 30 %.

La variedad mexicana de higo conocida como Neza presenta un alto potencial de

rendimiento en cultivo bajo invernadero. Sin embargo, se desconocen las causas del
deterioro postcosecha de los frutos de higo y su control. Aqu reportamos la
identificacin de por lo menos cinco clases de microorganismos causantes del
deteriodo postcosecha del fruto de higo y su control con diferentes compuestos
seguros, que permiten obtener frutos de calidad adecuada para su comercializacin,
adems de prolongar la vida de anaquel de los frutos y disminuir las prdidas
postcosecha.

121
7.3.1. Objetivo

Identificar las causas del deterioro postcosecha de frutos de higo de la variedad

Neza y su control, basado en un anlisis de efectividad de diferentes compuestos
seguros.

7.3.2. Hiptesis

Ho: El deterioro postcosecha de los frutos de higo es causado por diversas clases de
microorganismos.

Ha: El deterioro postcosecha de los frutos de higo no es causado por diversas clases
de microorganismos.

7.4. Materiales y Mtodos

Material vegetal
De las seis variedades de higos mexicanos evaluadas en Captulos previos (III, V y
VI) de esta investigacin, la variedad Neza fue seleccionada para realizar estudios,
sobre las causas del deterioro postcosecha del fruto, por presentar caractersticas
agronmicas sobresalientes, como un alto potencial de rendimiento 120 ton ha-1 y
frutos de tamao muy grande (100 g en promedio) y contenido elevado de minerales,
fenoles y antocianianas en cualquier poca del ao.

Reproduccin y cultivo de las plantas

Plantas de higo de la variedad Neza, reproducidas por estacas, conforme a lo descrito
en el Captulo III de esta investigacin, fueron cultivadas en invernadero bajo las
mismas condiciones ambientales (Cuadro 15) y de manejo agronmico.

122
Cuadro 15. Temperatura y humedad relativa prevalecientes en el invernadero,
durante la produccin de higos de la variedad Neza, utilizados para
identificar las causas del deterioro postcosecha del fruto.
Condicin ambiental Agosto Septiembre Octubre
Temperatura (oC)
Mnima 9.21 1.86 2.78
Media 18.77 18.26 17.50
Mxima 37.92 39.94 44.34
Humedad relativa (%)
Mnima 30.58 25.37 15.68
Media 73.48 74.99 71.28
Mxima 92.46 92.95 92.42

Identificacin de microorganismos causantes del deterioro postcosecha de

higo
En septiembre del 2011, los frutos maduros recin cosechados del tercio medio de
plantas individuales fueron sumergidos en soluciones de agua, cido actico en agua
al 1 % (v:v), bicarbonato de sodio en agua al 1 % (p:v) y cloruro de calcio al 1 % en
agua (p:v) por dos minutos y se dejaron secar durante una hora. Inmediatamente
despus, los frutos fueron incubados en una cmara hmeda durante tres das a 24
( 0.6) oC, conforme a las especificaciones de Rondn (1974). Con base en la
coloracin del micelio desarrollado, se cuantific el porcentaje de frutos infestados y
el nmero de colonias desarrolladas en el exocarpio y el mesocarpio.
Posteriormente, se aislaron muestras de cada colonia de los frutos infestados y se
inocularon en cajas Petri con medio de cultivo selectivo para hongos (PDA). Para la
identificacin de gneros, los cultivos se incubaron durante cinco das a 23 ( 1.8)
o
C, aplicando la metodologa de Oztekin et al. (2006). Inmediatamente despus, se
realizaron preparaciones con glicerol para diferenciar las estructuras de los
microorganismos bajo observacin al microscopio electrnico, apoyndose en las
claves de Barnett (Barnett y Hunter, 1987). Para la identificacin de especies, entre

123
octubre del 2011 y marzo del 2012, las colonias de microorganismos se dejaron
crecer hasta invadir completamente la caja Petri, conforme a Oztekin et al. (2006).
Las cepas se aislaron y se transfirieron a un medio de cultivo nuevo para su
purificacin y conservacin en aceite mineral estril hasta su utilizacin. Finalmente,
en febrero del 2012, las cepas fueron enviadas a la empresa conocida como
Mycrogen, para la extraccin de ADN y secuenciacin. En mayo del 2012, durante la
estancia doctoral realizada en el Donald Danforth Plant Science Center de Saint
Louis Missouri, se realiz la identificacin de las especies de microorganismos, con
base en las secuencias enviadas por la empresa, utilizando la herramienta BLAST
del banco de genes ([Link]).

Diseo experimental y anlisis estadstico

Para la identificacin de los microorganismos causantes de las prdidas postcosecha
de los frutos de higo, se utiliz un diseo experimental completamente al azar con
cuatro tratamientos conformados por el tipo de fungisttico utilizado: 1 (testigo), 2
(cido actico en agua al 1 %, v:v), 3 (bicarbonato de sodio en agua al 1 %, p:v) y 4
(cloruro de calcio al 1 % en agua, p:v). Cada tratamiento const de 20 repeticiones.
La unidad experimental fue un fruto. Para la efectividad fungisttica de los
compuestos seguros, se utiliz un diseo experimental factorial con dos factores (A y
B). El primer factor A estuvo conformado por los compuestos seguros (Bloques): 1
(testigo), 2 (cido actico en agua al 1 %, v:v), 3 (bicarbonato de sodio en agua al 1
%, p:v) y 4 (cloruro de calcio al 1 % en agua, p:v), mientras que el segundo factor B
lo conformaron los tratamientos, dados por las colonias de hongos identificados: 1
(Cladosporium spp.), 2 (Fusarium spp.), 3 (Hyphopichia spp.), 4 (Penicillium spp.) y 5
(Rhizopus spp.). Cada tratamiento const de 20 repeticiones. En ambos casos, los
datos fueron sometidos a pruebas de normalidad (Kolmogorov-Smirnov) y
homogeneidad de varianzas (Bartlett) en el paquete estadstico SAS. Se verific que
cumplieran con los supuestos bsicos del anlisis de varianza. Se realiz un anlisis
de varianza y pruebas de comparacin de medias con la prueba de Tukey (P0.05),
en el paquete estadstico SAS (SAS, 1999-2000, versin 8.1). La representacin

124
grfica de los datos se realiz en el programa SigmaPlot (versin 10.1) para
computadora personal.

Variables respuesta

Infestacin de frutos (%). Se determin con base en el nmero de frutos totales

evaluados (NFT) y el nmero de frutos infestados (NFI) con algn tipo de
microorganismo, mediante la ecuacin: Infestacin de frutos (%)= [(NFI *
100)/NFT].

Nmero de colonias desarrolladas. Fue determinado con base en la coloracin

del micelio desarrollado, aplicando la metodologa de Rondn (1974).

Gnero de microorganismos desarrollados. Fue determinado por observacin

de las estructuras de los microorganismos bajo microscopio electrnico,
apoyndose en las claves de Barnett (Barnett y Hunter, 1987).

Especie de microorganismos desarrollados. Fue determinada por anlisis de

secuenciacin de ADN obtenido a partir de las cepas de los microorganismos
conservados en aceite mineral.

Efectividad fungisttica (%). Fue determinada con base en el nmero de frutos

totales evaluados (NFT) y el nmero de frutos infestados (NFI) con algn tipo de
microorganismo despus de aplicar los tratamientos fungistticos, mediante la
ecuacin: Efectividad (%)= [(NFI *100) NFT].

125
 7.5. Resultados y Discusin

Identificacin de los microorganismos causantes del deterioro postcosecha de

higo
En Mxico se desconocen las causas que ocasionan prdidas postcosecha de hasta
el 30 % en el cultivo del higo. Sin embargo, este es el principal problema
postcosecha por el que la vida de anaquel del fruto se reduce a tan solo dos das
(Venditti et al., 2005). Nosotros plantemos la hiptesis de que los frutos de higo son
atacados por diversas clases de microorganismos que demeritan su calidad. Para
probar esta hiptesis, cultivamos las plantas de higo de la variedad Neza en
invernadero bajo las mismas condiciones ambientales y de manejo agronmico, y
realizamos un estudio de efectividad de diferentes compuestos seguros.

La incubacinn a 24 ( 0.6) oC mostr que la infestacin de los frutos de higo de la

variedad Neza encontrada en este estudio, estuvo constituida nicamente por
hongos. Estos resultados pueden ser explicados porque los frutos de higo fueron
cultivados en invernadero, y cuando las plantas estn protegidas y crecen en un
microambiente, disminuye la posibilidad de contaminacin con patgenos externos.
Adems de hongos, los frutos de higo son atacados por bacterias, coliformes y
levaduras, que demeritan la calidad y disminuyen la vida de anaquel de los higos (El-
Gharably et al., 2009; Demirbuker et al. 2004; Isman y Biyik, 2008; Oztekin et al.,
2006; Venditti, et al., 2005; Yelsicimen y Ozdemir, 2008). Sin embargo, es ste
estudio nosotros no detectamos la presencia de bacterias ni levaduras en los frutos
de higo evaluados.

El porcentaje de infestacin de los frutos fue mayor en el testigo. Los tratamientos

fungistticos a base de cido actico, bicarbonato de sodio y cloruro de calcio al 1 %,
redujeron significativamente el porcentaje de infestacin de los frutos. Sin embargo,
no hubo diferencias estadsticas entre ellos (Figura 16).

126
Figura 16. Infestacin (%) de frutos de higo de la variedad Neza, producidos en invernadero, tratados
con diferentes compuestos seguros al 1 %. Letras distintas indican diferencia estadstica
con la prueba de Tukey (P 0.05, n=20).

El nmero de colonias desarrolladas vari de una a cinco, observndose el mayor

nmero en el testigo. Sin embargo, no hubo diferencias estadsticas en el nmero de
colonias desarrollas entre los tratamientos fungistticos (Figura 17). Los cinco
gneros identificados pertenecen al grupo de los hongos imperfectos, que se
caracterizan por desarrollar un micelio no cenoctico y septado con conidios (Barnett
y Hunter, 1987).

Figura 17. Colonias de hongos desarrolladas en frutos de higo de la variedad Neza, producidos en
invernadero, tratados con diferentes compuestos seguros al 1 %. Letras distintas indican
diferencia estadstica con la prueba de Tukey (P 0.05, n=20).

127
El cultivo de los microorganismos y los anlisis de secuenciacin de ADN indicaron
que las cinco colonias de hongos desarrolladas en los higos de la variedad Neza
pertenecen a los gneros y especies: Cladosporium sphaerosporum, Fusarium
equiseti, Hiphopichia burtonii, Penicillium citrimun, y Rhizopus niger (Figura 18).
Interesantemente, C. sphaerosporum, F. equiseti y R. niger, fueron identificados en
el exocarpio de los frutos, mientras que H. Burtonii y P. citrimun, fueron identificados
en el mesocarpio de los frutos. Es importante resaltar que esta es la primera vez que
se reporta la presencia de Hiphopichia burtonii en frutos de higo.

Figura 18. Hongos causantes del deterioro postcosecha de frutos de higo de la variedad Neza,
producidos en invernadero.

128
Uno de los hongos toxignicos que ms atacan a los frutos de higo de la variedad
Craxiou de Porcu y Rampelina es Botrytis cinerea (Venditti et al., 2005). En esta
investigacin este tipo de patgeno no fue detectado, lo cual es bueno, pues indica
que la produccin de fruta bajo cubierta es menos atacada por microorganismos
dainos a la salud humana.

El anlisis de efectividad fungisttica mostr variacin en el control (Figura 19) de los

diferentes tipos de hongos identificados en este estudio. Interesantemente, ninguno
de los compuestos seguros evaluados fue efectivo en el control de H. burtonii. Sin
embargo, el cloruro de calcio mostr una efectividad del 100% en la inhibicin del
crecimiento de la mayora de los patgenos.

Figura 19. Efectividad fungisttica de diferentes compuestos seguros (1 %) aplicados en frutos de higo
de la variedad Neza, producidos en invernadero. Letras distintas indican diferencia
estadstica con la prueba de Tukey (P 0.05, n=20).

La nula eficiencia de los compuestos seguros evaluados en este estudio para el

control de H. burtonii y P. citrinum pudiera deberse a que son patgenos que se
desarollan en el interior del fruto, y por lo tanto el contacto con las soluciones

129
fungistticas es muy bajo. En contraste, cuando los frutos son tratados con los
compuestos seguros, quedan en contacto directo con la piel del fruto, que es donde
se encuentra la mayor cantidad de esporas.

El uso del cloruro de calcio se aplica en frutos porque es completamente soluble en

agua. En concentraciones de 0.5 a 6 % es totalmente inocuo, es fuente de calcio
(Espinoza et al., 2006), no causa efectos dainos en la salud de los consumidores ni
en el medio ambiente, y no altera la calidad organolptica de los frutos (Venditti et
al., 2005). Nosotros recomendamos su uso como tratamiento previo para prevenir la
contaminacin del fruto con microorganismos durante su almacenamiento y
conservacin.

6.6. Conclusiones

La principal causa del deterioro postcosecha de los frutos de higo de la variedad

Neza son los hongos identificados como C. sphaerosperum, F. equiseti, H.
burtonii, P. citrinum y R. niger. No se detect la presencia de Botrytis cinerea en
este estudio.

Los compuestos seguros son una alternativa para el control de microorganismos,

disminucin de las prdidas postcosecha y extensin de la vida til de los frutos
de higo.

El cloruro de calcio al 1 % es un compuesto altamente efectivo para controlar la

mayora de gneros de hongos causantes del deterioro postcosecha de los frutos
de higo de la variedad Neza.

130
 6.7. Literatura Citada

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132
 VIII. DISCUSIONES GENERALES

La gua tcnica internacional del IPGRI (2003) result ser de gran utilidad en la
caracterizacin morfolgica de frutos de higos negros colectados en el centro de
Mxico. La caracterizacin morfolgica de especies y variedades debe ser realizada
con plantas que crecen bajo un mismo ambiente (Gallegos et al., 2005). Por esta
razn, nuestras plantas fueron cultivadas en invernadero bajo las mismas
condiciones ambientales y de manejo agronmico. Bajo estas condiciones, nosotros
pudimos detectar caractersticas claramente distintas que permitieron describir a
cada una de las poblaciones de higo evaluadas. De un total de diez atributos
cuantitativos y cuatro atributos cualitativos evaluados en este estudio, solo cuatro
fueron los que marcaron las principales diferencias entre poblaciones: el tamao o
peso del fruto, la forma del fruto, el color de la pulpa, y la longitud del cuello del fruto.

Es ampliamente conocido que el clima juega un papel muy importante en la

expresin de las caractersticas morfolgicas de las plantas (Storey, 1977). Sin
embargo, con los resultados de la caracterizacin morfolgica de frutos de higo
cultivados en invernadero, nosotros corroboramos que las poblaciones de higo
identificadas en este estudio (Ixmiquilpan, Salvatierra, Tecmac, Tetela, Neza y
Zacapala), expresan caractersticas morfolgicas claramente distintas que no se
deben nicamente al ambiente en el que crecieron las plantas. Con base en estas
observaciones, nosotros formulamos la hiptesis de que las diferencias morfolgicas
entre frutos de higos negros del centro de Mxico se deben tambin a diferencias
genticas. Para probar esta hiptesis, nos dimos a la tarea de estandarizar
primeramente un protocolo para la extraccin de ADN de higo, para posteriormente
realizar una caracterizacin molecular.

Con las modificaciones al protocolo del CTAB de Weising et al. (2005), realizadas en
este estudio, se obtuvo ADN en concentracin y calidad ptimas (Weir, 1996; Doulis
et al., 2000) para poder llevar a cabo un anlisis con marcadores moleculares,
mediante anlisis de huellas de ADN tipo RAPDs, ISSRs, y RFLPs. Con estas

133
modificaciones el ADN obtenido de las hojas jvenes y maduras estuvo libre de
contaminantes como polisacridos o protenas, y presentaron un patrn de bandas
claramente visibles en geles de agarosa. En cambio, el ADN de frutos jvenes y
maduros present un patrn de bandas difusas en geles de agarosa.

Nuestros resultados muestran que las poblaciones mexicanas de higo en el centro

de Mxico son genticamente distintas. Esa variabilidad es indicada por la
distribucin amplia de los agrupamientos observados en los rboles filogenticos
generados con las huellas de ADN tipo ISSRs y RFLPs obtenidas en este estudio.
An cuando se asume que las seis poblaciones de higo se derivaron inicialmente de
la variedad Black Mission, cada una presenta caracteres genmicos claramente
distintos que les permiten mantenerse en agrupamientos independientes entre s en
los rboles conformados.

Los resultados de la caracterizacin morfolgica se complementan con la

caracterizacin molecular de las seis poblaciones de higo evaluados en este estudio.
Esta informacin nos permite concluir que todas las poblaciones son diferentes entre
ellas, por lo que con esta investigacin establecemos las bases para la futura
caracterizacin agronmica y el registro de variedades de higo ante la UPOV. Hasta
la fecha, en nuestro pas no existe registro de variedades de higo. Solo se cuenta
con el banco de germoplasma de higo establecido por nosotros en la Universidad
Autnoma Chapingo, por lo que la variabilidad morfolgica y gentica observada
entre las poblaciones de higo de diferentes partes de Mxico ha comenzado a ser
reconocida y valorada.

Los RAPDs son una herramienta utilizada ampliamente en el anlisis de huellas de

ADN (Becerra y Paredes, 2000). Diversos investigadores han logrado amplificar ADN
de higos silvestres o tipo Caprifig a partir de indicadores tipo RAPDs (Galderisi et al.,
1999; Cabrita et al., 2001; De Masi et al., 2003; De Masi et al., 2005; Dalkilic et al.,
2011). Sin embargo, en este caso nosotros utilizamos ADN de higos del tipo comn o
partenocrpicos, y los resultados no fueron satisfactorios. Es probable que los

134
iniciadores RAPDs utilizados no hayan generado informacin porque no encontraron
complementariedad en el genoma de higo. Es ampliamente conocido que los
iniciadores RAPDs generan informacin a partir de cualquier sitio donde encuentran
el complemento de la secuencia utilizada (Semagn et al., 2006). Sin embargo, se
debe considerar que los iniciadores no fueron diseados especficamente para higo y
por ende, la amplificacin del ADN de las seis poblaciones de higo fue nula.

Los anlisis de huellas de ADN tipo ISSRs y RFLPs visualizadas en geles de

poliacrilamida resultaron altamente eficientes en la diferenciacin de poblaciones de
higo. Los ISSRs y los RFLPs proporcionan informacin diferente, y no es posible
hacer que los resultados obtenidos con ambas tcnicas coincidan, debido
principalmente a la naturaleza de cada tcnica (Khadari et al., 2005; Semagn et al.,
2006; Khaled et al., 2010; Mallikarjuna et al., 2010; Satwar, 2012). Nosotros
corroboramos que los ISSRs son ms eficientes en la deteccin de polimorfismos
entre poblaciones. Esos polimorfismos indican diferencias a nivel de genoma
(Martins et al., 2003), las cuales pudimos identificar con base en el tamao de las
bandas observadas en los patrones de electroforesis generadas en los geles de
poliacrilamida.

Los RFLPs permitieron diferenciar las seis poblaciones de higo evaluadas en este
estudio, con base en el gen que controla el tamao del fruto (Fruitfull) y que fue
identificado por primera vez en la planta modelo A. thaliana (Roeder y Yanofsky,
2006). Estos resultados son de gran importancia porque demuestran por primera vez
que, a nivel de especie, el higo tiene un gen homlogo del Fruitfull. Adems, los
higos mexicanos derivados, inicialmente de la variedad espaola Black Mission,
presentan diferencias genticas especficamente en el gen homlogo del Fruitfull.
Interesantemente, la diferenciacin de las poblaciones de higo realizada con base en
el rbol filogentico obtenido de los perfiles electroforticos obtenidos con los RFLPs,
est altamente correlacionada con las caractersticas morfolgicas del fruto.

135
Las huellas de ADN de higo de las poblaciones mexicanas (Ixmiquilpan, Salvatierra,
Tecmac, Tetela, Neza y Zacapala), obtenidas a partir de los ISSRs y los RFLPs, se
obtuvieron bajo las mismas condiciones electroforticas, digestin enzimtica y
revelado de los productos amplificados, por lo que los resultados obtenidos pueden
ser comparados. Al analizar los rboles filogenticos generados con cada tipo de
iniciadores, se observa que la agrupacin de las poblaciones es distinta. Sin
embargo, los ISSRs indican variacin en zonas desconocidas del genoma, que
pueden ser responsables de un sin nmero de caractersticas. En cambio, los RFLPs
muestran variacin a nivel del gen que controla el tamao del fruto, lo que los hace
ser ms especficos. Por esta razn, nosotros consideramos que los anlisis de
huellas de ADN tipo RFLPs conforman una base slida para la bsqueda de
caracteres cuantitativos que puedan ser de utilidad en el mejoramiento de higo y,
probablemente, de otras especies cultivadas.

Los resultados de esta investigacin representan tres lneas de evidencias que

muestran que las poblaciones de higos negros en Mxico pertenecen a variedades
claramente distintas:

1) Caractersticas morfolgicas del fruto (Figura 5).

2) Huellas de ADN and a nivel genmico basadas en anlisis de ISSRs (Figura
9).
3) Huellas de ADN a nivel especfico de un gen basadas en anlisis del Fruitfull
(RFLPs) (Figura 11).

Sabemos que Mxico no es el centro de origen del higo. Sin embargo, nuestros
resultados muestran claramente que nuestro pas es una fuente de diversidad
gentica del higo muy importante. Dicha diversidad es todava desconocida en su
mayora, pero la metodologa y los parmetros establecidos en esta investigacin
pueden ser utilizados para la caracterizacin morfolgica y molecular de variedades
de higo en otros estados de la Repblica Mexicana, as como para conocer la

136
distancia gentica que existe entre las variedades de higos mexicanos y la variedad
Black Mission.

Es importante recalcar que la metodologa desarrollada en esta investigacin para

identificar al gen responsable del tamao del fruto en higo (Fuitfull), ya fue aplicada
por la Dra. Ernestina Valadez Moctezuma y estudiantes del Postgrado en
Biotecnologa del Departamento de Fitotecnia, de la Universidad Autnoma
Chapingo, para la caracterizacin gentica de accesiones de nopal, chile, frijol,
garbanzo y biznaga. Interesantemente, la metodologa funcion adecuadamente,
permitiendo diferenciar a las accesiones evaluadas, adems de encontrar que estas
cinco especies tambin presentan el gen llamado Fruitfull. Estas evidencias nos
llevan a concluir que la metodologa desarrollada para la caracterizacin gentica de
variedades mexicanas de higo, puede extenderse a cualquier otra especie de
plantas.

Los anlisis del contenido mineral y de fenoles y antocianinas totales de la variedad

Neza, mostraron que los frutos de higo son muy nutritivos, independientemente de la
poca del ao en que se cosechen. En esta investigacin se realiz una
caracterizacin inicial de la composicin mineral de los higos de la variedad Neza,
encontrando que los frutos son fuente de calcio y potasio, principalmente. Sin
embargo, an queda mucho por hacer, ya que el valor nutritivo de los frutos se debe
a la presencia de vitaminas, minerales, carbohidratos, protenas y fibra diettica
(Baccaunaud et al., 1995; Ersoy et al., 2007). Nosotros solo evaluamos el contenido
mineral, por lo que los dems componentes siguen siendo desconocidos hasta el
momento.

El elevado contenido de fenoles y antocianinas (1804.45 mg por 100 g de tejido

fresco), nos permiti corroborar que los higos de la variedad Neza son fuente
extraordinaria de 12 antioxidantes naturales como la rutina, cianidina y lutena. Sin
embargo, an falta identificar y cuantificar la concentracin de los otros nueve
compuestos fenlicos detectados en los anlisis de HPLC.

137
La caracterizacin morfolgica, gentica y bioqumica realizada en este estudio, nos
permiti tener una descripcin ms completa de la variedad de higo conocida como
Neza. Sin embargo, en este estudio se incluyeron seis variedades de higos
mexicanos, por lo que la lnea de investigacin sobre la caracterizacin bioqumica
puede ser extendida tambin a las variedades identificadas como Ixmiquilpan,
Salvatierra, Tecmac, Tetela y Zacapala.

El estudio de efectividad fungisttica de los compuestos seguros como el cido

actico, bicarbonato de sodio y cloruro de calcio al 1 %, fue suficiente para controlar
al 100 % las poblaciones de F. equiseti y R. niger. Sin embargo el cloruro de calcio
fue el nico compuesto eficaz en el control del 100 % de las poblaciones C.
esphaerosperum. Con el cido actico se logr un control del 90 % de las
poblaciones de P. citrinum, pero ningn compuesto fue efectivo en el control de H.
burtonii. Con base en estas evidencias, sugerimos que en estudios futuros se
incremente la concentracin de los compuestos seguros, para lograr un mayor
control en las poblaciones de los microorganismos causantes del deterioro
postcosecha de los frutos de higo.

8.1. Literatura Citada

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140
 IX. CONCLUSIONES GENERALES

Los higos negros se han adaptado a condiciones ambientales locales en el centro

de Mxico, fijando genticamente tales adaptaciones, por lo que se han generado
variedades claramente distintas que representan diversidad morfolgica valuable.

Las principales diferencias morfolgicas entre las variedades mexicanas de higo

identificadas en este estudio como Ixmiquilpan, Salvatierra, Tecmac, Tetela,
Neza y Zacapala, son el tamao o peso del fruto, el color de la pulpa, la longitud
del cuello y la forma del pednculo.

Con la caracterizacin morfolgica de los higos negros identificados en este

estudio, establecemos las bases para la futura caracterizacin agronmica y
molecular de variedades mexicanas de higo.

ADN de higo de buena calidad y cantidad se pudo extraer con el mtodo del
CTAB al 4 %.

La edad y el tipo de rgano utilizado para la extraccin de ADN de higo influyen

en la concentracin y calidad del ADN obtenido.

Las hojas jvenes de las plantas de higo son el rgano ms recomendado para la
extraccin de ADN por su concentracin y calidad ptimas para su amplificacin y
anlisis de huellas de ADN.

El higo presenta un gen homlogo del gen Fruitfull de A. thaliana que determina
el tamao del fruto.

141
 Las huellas de ADN indican que las poblaciones mexicanas de higo identificadas
en este estudio (Ixmiquilpan, Salvatierra, Tecmac, Tetela, Neza y Zacapala) son
genticamente diferentes entre ellas a nivel genoma y a nivel especfico del gen
responsable del tamao del fruto.

La distancia gentica que existe entre las variedades mexicanas de higo y la

variedad Black Mission puede ser determinada utilizando los primers
Fruitfull_F131, Fruitfull_R1218 y Fruitfull_R3056, diseados en este estudio.

Los higos mexicanos de la variedad Neza presentan el mismo valor nutritivo y

nutracutico en cualquier poca de ao.

Los minerales ms abundantes de los frutos de higo de la variedad Neza son el

potasio, calcio, fsforo y magnesio.

Los higos de la variedad Neza son ricos en compuestos fenlicos, con mayor
proporcin de fenoles que antocianinas.

La principal causa del deterioro postcosecha de los frutos de higo de la variedad

Neza son los hongos identificados como C. sphaerosperum, F. equiseti, H.
burtonii, P. citrinum y R. niger. No se detect la presencia de Botrytis cinerea en
este estudio.

Los compuestos seguros son una alternativa para el control de microorganismos,

disminucin de las prdidas postcosecha y extensin de la vida til de los frutos
de higo.

El cloruro de calcio al 1 % es un compuesto altamente efectivo para controlar la

mayora de gneros de hongos causantes del deterioro de los frutos de higo de la
variedad Neza.

142