Tiselius y la electroforesis: un breve
repaso histrico.
Para inaugurar la seccin de Historia de la Ciencia, voy a dedicarle una
entrada del blog a Arne Wilhelm Kaurin Tiselius, considerado el padre
de la electroforesis, tcnica de separacin de partculas, ampliamente
conocida por todos los que se dedican al trabajo en
el laboratorio.
El trmino de electroforesis proviene de dos
palabras griegas, elektro que significa electricidad
y phoros que significa movimiento. Se trata de una
tcnica de separacin de partculas basada en la
velocidad diferencial de migracin que se observa
en las partculas cargas, neutras o pasivas
dispuestas en un medio acuoso, debido a la
atraccin y/o repulsin que sufren en un campo
elctrico.
Aunque sea Tiselius el verdadero protagonista de la entrada y padre de la
tcnica de la electroforesis, es de recibo reconocer el trabajo anterior
realizado por numerosos cientficos como Michael Faraday que fue el que
postul la Ley de la electrolisis, los experimentos realizados por el
cientfico Ferdinand Reuss, Johann Wilhelm Hittorf , Walther
Nernst y Friedrich Kohlrausch quienes trataban de dar una explicacin
al comportamiento de los pequeos iones, que se desplazan en soluciones
acuosas bajo la influencia de un campo elctrico, principio bsico de la
electroforesis. A destacar, la funcin de Kohlrausch, donde se describa el
orden de migracin electrofortica y las concentraciones relativas de los
iones en disolucin, de importancia en los aos posteriores para el anlisis
de iones de gran tamao y/o protenas. Sin embargo y a pesar de los
grandes avances realizados, eran grandes los problemas e inconvenientes a
la hora de abordar el tema de la separacin de partculas. Es aqu donde
entra en accin el protagonista de la entrada, Arne Tiselius.
Arne Tiselius, nacido el 10 agosto de 1902 en Estocolmo, era un estudiante
del laboratorio de Theodor Svedberg en el Instituto Karolinska de
Estocolmo. Es de esta forma como, gracias a una propuesta de su profesor
y posterior jefe, como Tiselius entra en contacto con el estudio de la
electroforesis. Svedberg, ante el xito obtenido en sus trabajos sobre
protenas utilizando la tcnica de la ultracentrifugacin (lo que dara luego
dio lugar a lo que conocemos como la S de las subunidades de las
ribosomas), le propuso a Tiselius trabajar en la electroforesis de protenas
utilizando la tcnica de frente mvil y los mismos medios de deteccin
ptico empleados por Svedberg. Con todas estas permisas y los
conocimientos sobre fotografa de estras de August Toepler (complejo
mtodo de deteccin ptico), Tiselius realiz su tesis doctoral El mtodo
de frente mvil en el estudio de electroforesis de protenas donde
Tiselius trataba de presentar una nueva tcnica que permitira analizar las
propiedades fsico-qumicas de estas molculas entre otras. Sin embargo, la
tcnica presentaba inicialmente dos problemas:
la conveccin trmica que se produca por el calentamiento trmico del
aparato, que originaba una prdida de resolucin de los frentes de
protenas.
la dificultad de aislamiento de las partculas que no tenan una
velocidad de migracin muy elevada.
Estos problemas se veran solucionados tras la estancia de post-doctorando
de Tiselius en el laboratorio de S.A. Taylor en Princeton, donde entr en
conversaciones con miembros del Instituto Rockefeller. A su vuelta,
Tiselius mejor la tcnica con la introduccin de una celda
electrofortica de seccin rectangular en un recipiente con agua a 4C.
Adems se realizaron otros aadidos para hacer la tcnica ms reproducible
siendo una de ellas, la adiccin de una cmara que permita el registro
directo sobre una pelcula fotogrfica de las variaciones de los ndices de
refraccin (proporcionales a los gradientes de concentracin de las
protenas presentes en la celda electrofretica).
Aparecieron as los primeros aparatos de electroforesis denominados como
Tiselius, en honor a su creador y financiados en su mayor parte por el
Instituto Rockefeller. A pesar de ser aparatos enormes, difciles de usar y
caros, en los aos 50 lleg a haber cientos de ellos en diversos laboratorios.
Con todo ello, el mtodo de electroforesis de frente mvil pas a
considerarse un mtodo de anlisis con una alta precisin.
As pues, el mismo Tiselius sera quin posteriormente, en colaboracin
con Anthony Kabat y Michael Heidelberger y utilizando la tcnica del
frente mvil en la electroforesis de protenas, sera capaz determinar y
purificar en 1937, los cuatro frentes mviles las protenas del suero:
la albmina, la alfa-globulina, la beta-globulina y la gamma-
globulina. Tambin L.G. Longworth, del Instituto Rockefeller, pudo
observar a travs de esta tcnica de separacin, que adems se distinguan
diferencias de movilidad en las mismas protenas entre personas sanas y
personas enfermas, lo que supuso la apertura de una va para el estudio
molecular de ciertas enfermedades.
Debido a su gran contribucin en el desarrollo de la tcnica de
electroforesis y por la importancia de su hallazgo sobre la naturaleza
compleja de las protenas del suero, Arne Tiselius recibi el Premio
Nobel en 1948.
A pesar del bien merecido avance a nivel tcnico realizado por Tiselius, la
tcnica de electroforesis de frente mvil tena serias limitaciones: remezcla
de los componentes por diferencias de densidad, difusin de las sustancias
tras desconectar la corriente y otros problemas relacionados con el diseo
de los tubos en forma de U. Esto hara que la tcnica poco a poco fuera
quedando en desuso, siendo sustituida, por orden cronolgico, por los
siguientes avances:
1950. La electroforesis de zona que utilizaban papel de filtro como
soporte. El principal valedor de la tcnica fue H. Svenson, dscipulo de
Tiselius, pero sin embargo, la tcnica tuvo un corto recorrido, ya que al
igual que la de su predecesor, este avance de la electroforesis presentaba
tambin grandes limitaciones (escasa resolucin o evaporacin de
electrolito).
1959. La electroforesis en gel de poliacrilamida, siendo los
principales valedores de esta tcnica Raymond, Weintraub, Davis y
Ornstein, aunque no debemos olvidar el trabajo realizado por Stellan
Hjertn en la sombra.
1964. La electroforesis discontinua (usando tampones con valores de
pH diferentes e iones de distinta movilidad para favorecer la concentracin
de las bandas y facilitar la separacin posterior) por parte de Ornestein y
Davis.
1967. La electroforesis SDS-PAGE o electroforesis en gel de
poliacrilamida en dodecil-sulfato sdico, siendo los
valedores Shapiro, Viuela y Maizel. Con esta tcnica se puede
determinar en condiciones desnaturalizantes (inactivan la protena) el
tamao molecular de las protenas y determinar su grado de pureza. Es de
las ms habituales en el trabajo de rutina del laboratorio.
1970. El isoelectroenfoque, tcnica de electroforesis basada en el
principio del punto isoelctrico de las protenas. Iniciado por Tiselius en
1947 en sus estudios sobre la naturaleza de las protenas del suero, sera
finalmente demostrada por Svensson, cientfico tambin del Instituto
Karolinska.
A da de hoy se han realizado numerosas mejores a nivel terico y tcnico,
pero eso ya ser objeto de estudio en otra ocasin.
Electroforesis de protenas y de cidos nucleicos
Definicin
La mayora de las biomolculas poseen una carga elctrica, cuya magnitud depende del
pH del medio en el que se encuentran. Como consecuencia, se desplazan cuando se
ven sometidas a un campo elctrico.
Se denomina electroforesis a la tcnica mediante la cual se separan las biomolculas
en disolucin cuando se ven sometidas a un campo elctrico. Se trata de una tcnica
fundamentalmente analtica, aunque tambin se puede realizar con fines preparativos.
Cada molcula se desplaza por efecto del campo, alcanzando rpidamente una
velocidad constante al equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo elctrico) con
la resistencia al avance (fuerza de friccin o rozamiento) impuesta por el medio en el
que se desplaza.
Fuerza del campo elctrico = Fuerza de friccin
qEqE = fvfv
=
qq = carga (C)
ff = coeficiente de friccin (CVs / m = kg/s)
2
EE = intensidad del campo (V/m =
vv = velocidad de la molcula (m/s)
N/C)
El coeficiente de friccin mide la resistencia intrnseca debida a las caractersticas de
cada molcula, siendo stas esencialmente su forma y su tamao. As, por ejemplo, las
molculas grandes y de forma irregular poseen un mayor coeficiente de friccin que las
pequeas y compactas.
La velocidad por unidad de campo recibe el nombre de movilidad electrofortica,
vE==qf=ZefvE==qf=Zef
(ZZ = nmero entero; ee = carga del electrn)
En unas condiciones determinadas de electroforesis, la diferente movilidad de cada
molcula definir su separacin en el espacio; al ir transcurriendo el tiempo, se van
separando progresivamente unas de otras.
Al ser el medio de soporte a su vez un polielectrolito, est constituido por iones, que
son atrados y as recubren los iones de la muestra, lo que altera el comportamiento de
stos en el campo. Todo ello hace que el tratamiento terico cuantitativo de la
electroforesis sea muy difcil y que esta tcnica resulte poco til para obtener
informacin precisa sobre la estructura de las molculas. Sin embargo, es
enormemente til como tcnica analtica y preparativa.
Se suele hablar de 3 tipos de electroforesis:
1. De frente mvil: los componentes de la muestra estn presentes en toda la
disolucin y se determina pticamente la posicin del frente de avance o
frontera con el disolvente.
2. Zonal: la muestra se aplica como una mancha o banda y sus componentes
migran a travs de un disolvente, utilizando adems un medio que da soporte a
ste. En este caso no se determina la movilidad, sino que el nico objetivo de la
tcnica es separar los componentes de la muestra.
3. Continua: la muestra se aplica tambin en una zona, pero se suministra
continuamente a lo largo del proceso (para ms informacin, vanse las
pp.250-2 de Freifelder, 1999).
Estudiaremos nicamente la electroforesis zonal, de uso ms extendido.
Finalmente, debe sealarse que, aunque es menos frecuente, tambin se puede aplicar
la electroforesis para la separacin de clulas.
Medios de soporte para realizar la electroforesis
La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte, principalmente para evitar
perturbaciones mecnicas y corrientes de conveccin durante la separacin. En algunos
soportes (papel o similares) la muestra queda sobre la superficie y avanza a lo largo de
ella, con escasa friccin, por lo que el mecanismo principal de separacin es la
magnitud de la carga de cada componente de la muestra. Otros medios de soporte
(geles, medios semislidos o gelatinosos) estn formados por polmeros que forman
una malla, matriz o red tridimensional a travs de la cual deben avanzar las molculas
de la muestra, que queda embebida en el medio de soporte electrofortico. Como
consecuencia, la friccin es notable y los factores de forma y tamao adquieren una
alta relevancia en la separacin.
Medios de baja friccin Medios de elevada friccin
gel de
gel de poliacrilamida
papel almidn
gel de
acetato de celulosa gel de
agarosa+poliacrilamida
agarosa
separacin principalmente por
separacin por carga, tamao y forma
carga
Papel: sencillo, pero con elevada adsorcin debido a los grupos hidroxilo de la
celulosa.
Acetato de celulosa: los grupos OH estn acetilados, lo que reduce la adsorcin;
baja tincin de fondo; es posible transparentarla o disolverla para detectar y recuperar,
respectivamente, los componentes separados.
Almidn: pasta de almidn cuyos granos se han disgregado en un tampn caliente (se
hinchan). Actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la poliacrilamida.
Agarosa: polisacrido, producto purificado de algas (composicin similar al agar-
agar). Se disuelve en caliente (50-60C) y al enfriar solidifica formando un gel, de alta
porosidad.
Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerizacin qumica de una mezcla de
acrilamida y bisacrilamida. Regulando la concentracin de ambas y su proporcin se
consiguen distintas porosidades, siempre menores que la de los geles de agarosa.
acrilamida: (forma polmeros lineales)
N,N-metileno- (introduce uniones cruzadas entre
bis(acrilamida): cadenas de poliacrilamida)
poliacrilamida:
(vista parcial)
Agarosa+poliacrilamida: se consigue una porosidad intermedia.
Poliacrilamida con SDS: el dodecilsulfato sdico (Sodium Dodecyl Sulphate;
sinnimo: laurilsulfato sdico) es un detergente aninico que se une a las protenas,
desnaturalizndolas en una conformacin extendida recubierta de molculas de SDS.
Como consecuencia, el tamao de la molcula de protena es directamente
proporcional a su longitud en aminocidos y su carga queda enmascarada por la mayor
carga del SDS que la recubre, que es tambin proporcional a la longitud. Por lo tanto,
la movilidad electrofortica de la protena depende exclusivamente de su masa
molecular.
H-(CH2)12-SO4
Modos de disposicin del soporte
Horizontal
En papel, para aminocidos u otras molculas pequeas; en soportes similares
(especialmente, acetato de celulosa), para protenas.
En gel de almidn o de agarosa, para protenas y especialmente para cidos nucleicos.
Casi siempre el tampn cubre el gel (para evitar que se seque debido al calentamiento
sufrido al pasar la corriente), denominndose por ello electroforesis submarina.
El soporte se impregna por capilaridad de disolucin tampn, que disuelve la muestra y
mantiene el contacto elctrico.
Se aplica la muestra depositndola (con pipeta o un aplicador especfico) como una
gota sobre el soporte (papel, acetato de celulosa) o dentro de un pocillo creado en
el gel.
Vertical
Se usa casi exclusivamente con gel de poliacrilamida (ms resistente fsicamente, no
se desliza), para protenas o para cidos nucleicos de pequeo tamao.
El gel puede rellenar tubos de vidrio (este formato ya apenas se usa) o estar contenido
entre 2 placas rectangulares.
Contacto elctrico y disolvente gracias al tampn que embebe el gel y llena las cubetas
o compartimentos del nodo y ctodo.
La muestra se deposita con micropipeta llenando un pocillo creado al polimerizar el
gel.
En cuanto a la composicin del gel hay dos variantes: electroforesis continua (un
solo tipo de gel) y electroforesis discontinua(2 tramos de gel de composicin
ligeramente diferente).
Ejemplos de separacin electrofortica
Separacin de protenas por SDS-PAGE discontinua vertical
SDS-PAGE = SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, electroforesis en gel de
poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sdico.
Gel de poliacrilamida, en placa, vertical.
Separacin de acuerdo con la masa molecular (estrictamente, con la longitud de la
cadena polipeptdica).
La muestra se trata con SDS (a mayor concentracin que en la composicin del gel) y
se calienta brevemente a 90-100C, para provocar la desnaturalizacin. Se suele
aadir tambin -mercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro, separando as las
subunidades de la protena y permitiendo que se extiendan por efecto del SDS.
En la preparacin del gel se mezclan:
un tampn de pH (comnmente Tris-HCl)
acrilamida y bisacrilamida
un agente iniciador de la polimerizacin, como el persulfato amnico (genera
radicales libres)
un agente catalizador de la polimerizacin, como el TEMED (N,N,N,N-
tetrametiletilenodiamina)
SDS
Permite obtener una estimacin de la masa molecular de las protenas separadas. Para
ello es preciso analizar en la misma electroforesis unas protenas patrn, de tamao
conocido, con las que se construye una curva de calibrado, representando movilidad
frente a logaritmo de masa molecular.
Para controlar el avance del frente de electroforesis (posicin
de mxima movilidad) se aade a la muestra un colorante marcador (tracking dye),
molcula cargada y de pequeo tamao que avanza ms que cualquier componente de
la muestra; el ms habitual es el azul de bromofenol.
Para mejorar la resolucin (obteniendo bandas ms compactas) se suele emplear
electroforesis discontinua:
En la parte superior, un gel acumulador o concentrador (stacking gel), que
tiene como efecto concentrar la muestra en una banda estrecha.
Ocupando la mayor parte de la placa, un gel separador (resolving gel) en el
que tiene lugar la separacin de los componentes.
El efecto concentrador se debe a una mayor porosidad del gel acumulador combinada
con una diferente composicin de los tampones de cubeta (Tris-glicina) y de gel (Tris-
HCl) y distinto pH para ambos geles.
Nota: Tris es tris(hidroximetil)aminometano, una sustancia habitual para preparar
disoluciones tampn de pH prximo a 7.
Separacin de DNA en geles de agarosa, electroforesis horizontal
submarina
composicin del gel resolucin
conseguida:
% de % de tamao
acrilamida agarosa de DNA (kb)
20 0,006 - 0,10
15 0,025 - 0,15
12 0,04 - 0,2
8 0,06 - 0,4
5 0,08 - 0,5
3,5 1-2
2 0,1 - 2
1,5 0,2 - 3
1,2 0,4 - 6
0,9 0,5 - 7
0,7 0,8 - 10
0,6 1 - 20
0,3 5 - 60
Las molculas de DNA de las clulas son excesivamente grandes para avanzar a travs
de un gel de electroforesis normal, pero pueden analizarse si previamente se han
fragmentado de forma controlada. Se suelen emplear geles de agarosa (concentracin
entre 0,3% y 2%), ms porosos que los de poliacrilamida. Las caractersticas
mecnicas de estos geles hacen aconsejable la realizacin de la electroforesis en
horizontal, habitualmente submarina. Las muestras se aplican en pocillos practicados
dentro del gel.
Una de las formas ms comunes de fragmentar el DNA es el empleo de endonucleasas
de restriccin, que cortan en secuencias diana caractersticas.
La carga elctrica de una molcula de DNA depende de sus grupos fosfato, y el nmero
de stos es igual al doble del nmero de pares de bases. La forma de todas las
molculas de DNA es esencialmente la misma. En consecuencia, resulta que la
movilidad en electroforesis depende exclusivamente de la longitud de la molcula
(medida habitualmente como nmero de pares de bases, pb): la electroforesis
separa los fragmentos de DNA de acuerdo con su longitud en pb. De forma
similar al caso de protenas en SDS-PAGE, se suelen aplicar patrones en uno de los
pocillos para hacer una curva de calibrado de tamaos.
El avance del frente de electroforesis se observa gracias a colorantes como azul de
bromofenol y xileno cianol, aadidos a la muestra.
Cuando los fragmentos de cido nucleico analizados son de tamao muy pequeo se
utilizan geles de poliacrilamida, o de mezclas de agarosa y poliacrilamida cuando el
tamao es intermedio.
Revelado o deteccin
Tincin de protenas y de cidos nucleicos
Bromuro de etidio: Agente intercalante, se introduce entre las bases apiladas del DNA, abre un poco la doble hlice,
provoca un desenrollamiento local. Su fluorescencia (color naranja al iluminar con UV) aumenta mucho cuando se une al
DNA: mtodo de tincin o revelado del DNA, especialmente usado en electroforesis y en centrifugacin.
Se pueden emplear sustancias coloreadas o fluorescentes que se unan a las protenas
o los cidos nucleicos.
En el primer caso suelen ser colorantes orgnicos que interaccionan con las protenas
de forma poco selectiva, principalmente electrosttica. Ejemplos: azul brillante de
Coomassie, negro amido, rojo Ponceau.
Para los cidos nucleicos se usa el azul de metileno o, ms frecuentemente,
compuestos fluorescentes e intercalantes, como el bromuro de etidio (vase figura).
Un compuesto intercalante es aqul que se introduce entre los pares de bases apilados
del DNA.
Tras la electroforesis, el gel se sumerge en un recipiente con una disolucin del
colorante y se espera a que aqul se impregne y as el colorante se una a las molculas
separadas en el gel. Tras lavar el gel para eliminar el exceso de tincin no unida
especficamente, se observa, fotografa o cuantifica mediante densitometra.
deteccin por tincin con un agente
fluorescente y observacin bajo luz
ultravioleta
deteccin por autorradiografa
Ensayo enzimtico
Si entre las molculas separadas hay una enzima, se puede detectar aadiendo sus
sustratos (naturales o sintticos) y sus cofactores, y detectando la aparicin del
producto, generalmente coloreado.
Autorradiografa
Tanto protenas como cidos nucleicos pueden marcarse isotpicamente previamente a
la electroforesis, en cuyo caso la deteccin se hace mediante autorradiografa del gel
(vase figura).
Inmunoensayo (Western)
En caso de disponer de ellos, los anticuerpos permiten la deteccin selectiva del
componente de inters (protena o grupo marcador unido qumicamente a la protena o
al cido nucleico antes de la electroforesis). La permeabilidad de los geles para el
acceso del anticuerpo es limitada, por lo que se hace una transferencia de las
molculas separadas en el gel hacia una membrana de nitrocelulosa o de nailon, la cual
se somete luego a la disolucin que contiene el anticuerpo. Los detalles de esta tcnica
deinmunotransferencia o ensayo Western blot se tratarn en un tema posterior.
Deteccin de cidos nucleicos con sondas (Southern y Northern)
Las molculas con una secuencia determinada de nucletidos se pueden detectar
mediante hibridacin con sondas especficas, pequeas molculas de cido nucleico
monocatenario (oligonucletidos) con la secuencia complementaria a la buscada y
marcadas con un istopo radiactivo, un grupo fluorescente, etc. Para llevar a cabo con
xito la hibridacin se requiere tambin la transferencia desde el gel a una membrana
de nitrocelulosa o nailon. Los detalles de estos ensayos (Southern blot para DNA
y Northern blot para RNA) se estudian en un tema posterior.
Tcnicas especiales
Isoelectroenfoque
(Tambin se llama enfoque isoelctrico o IEF, de isoelectrofocusing). Se trata de una
variante de electroforesis en la que el gel (poliacrilamida) posee un gradiente de pH
fijado en su estructura. Esto se consigue incluyendo en su preparacin molculas
ionizables con valores de pK diferentes. Como consecuencia, al avanzar los
componentes de la muestra a lo largo del gel se encuentran en entornos de pH
diferente, y eventualmente alcanzan una regin en la cual el pH local es igual al punto
isoelctrico de la molcula muestra y, en consecuencia, sta detiene su avance. Se
alcanza, pues, un equilibrio y se consigue la separacin de los componentes de la
muestra de acuerdo con su punto isoelctrico, que adems se puede medir, pues se
conoce la geometra del gradiente de pH fijado al gel.
Electroforesis bidimensional
Tras realizar una primera separacin su resultado se somete a otra de diferente
mecanismo en direccin perpendicular. Generalmente la primera es un
isoelectroenfoque en un gel cilndrico estrecho que luego se coloca como muestra para
una SDS-PAGE. Se obtienen as mapas complejos de bandas, muy caractersticos de
cada muestra, cuya utilidad principal es la comparacin con el obtenido de otra
muestra similar pero conocida.
Electroforesis de campo pulsante
Las molculas o fragmentos de DNA de longitud superior a 20-40 kb no se pueden
resolver (separar) empleando la electroforesis convencional en gel de agarosa. Esto se
debe, en primer lugar, a la dificultad de manejo de los geles preparados con las bajas
concentraciones de agarosa que requeriran (inferior al 0,4%). Adems, las molculas
de DNA, que adoptan una conformacin ms o menos globular, poseen un tamao
excesivamente grande para atravesar los poros del gel y no se separan en funcin de
su tamao. Para solventar este problema se ha ideado una modificacin de la tcnica,
conocida como electroforesis de campo pulsante (o pulsado, pulsed-field gel
electrophoresis , PFGE). Se emplean geles de agarosa al 1%, pero se altera
peridicamente la orientacin del campo elctrico aplicado, activando alternativamente
dos pares de electrodos. El frecuente cambio de direccin del campo elctrico consigue
que las molculas se desplieguen y avancen a travs de los poros en conformacin
extendida. A mayor tamao, se reorientan con ms dificultad, por lo que avanzan ms
despacio.
As se consigue separar fragmentos de DNA de hasta varias
megabases, lo que supone un avance significativo pero an no sirve para estudiar los
cromosomas humanos enteros (de 50 a 250 Mb cada uno). S se han podido analizar
as los cromosomas de levadura (figura derecha).
Las muestras han de contener el DNA sin fragmentar, por lo se requiere una
preparacin especial (al purificar el DNA por los mtodos habituales se fragmenta por
debajo de 100 kb). Para obtener preparaciones con los cromosomas intactos se
mezclan las clulas con agarosa caliente (37C) y se vierte en pequeos moldes de
unos milmetros, de forma que al solidificarse la agarosa (4C) forma bloques
(insertos) que incluyen las clulas intactas. En stos se realiza la lisis celular y la
digestin de las protenas (p.ej., con EDTA, SDS y proteinasa K, que difunden a travs
de los poros del gel) sin que se alteren las grandes molculas de DNA. Tras una dilisis
para eliminar los restos de la digestin, se consigue un bloque de agarosa con el DNA
intacto en su interior, y se deposita el bloque entero en un pocillo del gel de
electroforesis.
Electroforesis preparativa
Se han desarrollado variantes preparativas, es decir, que permiten la obtencin de
cantidades significativas de los componentes de la muestra por separado. No se
detallarn aqu (vase Freifelder 1991, pp.256-7)
Inmunoelectroforesis
Combina una separacin electrofortica con una deteccin por inmunodifusin.
Aplicaciones
Determinacin de la masa molecular
Como se ha indicado, se puede obtener una estimacin de la masa molecular (en kDa)
de protenas empleando SDS-PAGE, y de fragmentos de DNA (en pb) empleando
electroforesis en agarosa. En ambos casos, en uno de los pocillos del gel se carga una
mezcla de molculas patrn de tamao conocido, con el fin de poder trazar la curva de
calibrado. Para las protenas, la validez del dato obtenido depende de que la
desnaturalizacin con SDS haya sido completa y de que se hayan separado las
subunidades gracias a la reduccin con mercaptoetanol; adems, la presencia de
oligosacridos en las glicoprotenas altera la movilidad, que ya no proporciona valores
de masa molecular fiables.
Ejemplo 1:
Se aplica en
uno de los
pocillos del
gel una
mezcla de
fragmentos
de DNA de
tamao
conocido,
denominados
patrones,
marcadores
de masa
molecular o
escalera de
DNA (DNA
ladder). Tras
su separacin
en la
electroforesis
, se revelan y
se representa
para todas
las bandas la
movilidad
(distancia
avanzada o,
mejor,
cociente
entre sta y
el avance del
frente de
electroforesis
) frente al
logaritmo del
tamao
(longitud en
pb). Sobre la
lnea de
regresin se
interpolan las
distancias de
avance de las
muestras
problema,
calculando
as su
tamao en
pb.
En este
ejemplo, los
patrones
empleados
son
fragmentos
bien
conocidos,
aquellos
obtenidos a
partir del
DNA del
virus por la
accin de las
endonucleasa
s de
restriccin Ec
oRI e Hin
dIII.
Ejemp
lo 2:
Se
aplica
en uno
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pocillo
s de
un gel
SDS-
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una
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bandas
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mejor,
cocient
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sta y
el
avance
del
frente
de
electro
foresis
)
frente
al
logarit
mo del
tama
o
(masa
molecu
lar
relativ
a, M ).
r
Sobre
la lnea
de
regresi
n se
interpo
lan las
distanc
ias de
avance
de las
muestr
as
proble
ma,
calcula
ndo
as su
masa
molecu
lar
aparen
te.
Determinacin del punto isoelctrico
Como se ha indicado, mediante isoelectroenfoque [] se obtiene una medida del punto
isoelctrico de las protenas (pHI o pI).
Isoenzimas
Las variantes de una enzima, con pequeas diferencias en su estructura y en su
actividad enzimtica, se analizan rutinariamente mediante electroforesis o, en especial,
mediante isoelectroenfoque. De hecho, los nombres de las isoenzimas derivan a veces
de su movilidad electrofortica. Se puede aplicar anlogamente a las isoformas de
protenas no enzimticas.
Mapas de restriccin
Una de las formas de estudiar la secuencia de los cidos nucleicos, en especial el DNA,
consiste en tratarlo con distintas enzimas de restriccin, analizar mediante
electroforesis en gel de agarosa los fragmentos resultantes e intentar reconstruir la
secuencia de la molcula original formando su mapa de restriccin, uno de los tipos de
mapa fsico.
Secuenciacin de cidos nucleicos
La obtencin de la secuencia completa, nucletido a nucletido, tambin depende del
anlisis electrofortico de fragmentos de DNA, tanto en el mtodo qumico de Maxam y
Gilbert como en el mtodo enzimtico de Sanger. Se utilizan en este caso geles de
poliacrilamida, debido al tamao pequeo de los fragmentos, pudindose resolver
fragmentos que se diferencian en un solo nucletido.
