Escuela de Ingeniera
Ambiental
Reconocimiento de material microbiolgico
INTRODUCCIN
La microbiologa es la ciencia del estudio de los microrganismos, tambin
antiguamente conocidos como microbios. Se dedica a estudiar los organismos que
son solo visibles a travs del microscopio: organismos procariotas y eucariotas.
Los microrganismos (bacteria, virus, hongos microscpicos, protozoarios y algas
microscpicas) pueden encontrarse en cualquier parte del medio ambiente, estn
presentes en aire, agua, suelo alimentos, organismos, etc. Estos organismos son
extremadamente importantes en la salud humana y en el ambiente.
Para ello las prcticas de laboratorio ayudaran al estudiante a conocer y manejar
adecuadamente algunas de las tcnicas que se utilizan en la realizacin del anlisis
microbiolgico de diversas, muestras del medio ambiente y conocer los principales
grupos de microrganismos objeto de estudio de la Microbiologa Ambiental.
Los conocimientos que el estudiante adquiera en este laboratorio se consideran
necesarios para la correcta interpretacin y conocimiento de los procesos ambientales
profesionales en carrera de la ingeniera ambiental y comprenda la importancia de los
microorganismos en la biosfera y su papel en el mantenimiento del equilibrio de los
ecosistemas.
El objetivo de este manual es complementar las sesiones tericas de la asignatura de
microbiologa ambiental. Durante las sesiones de laboratorio, el estudiante
desarrollara habilidades y aptitudes en el aislamiento e identificacin de algunos
microorganismos y conocer las tcnicas para su aislamiento del aire, suelo, agua.
RECONCIMIENTO DE MATERIAL
MICROBIOLOGICOS
INTRODUCCION
En esta prctica se dan a conocer los instrumentos y equipos de laboratorio
microbiolgico bsicos, con el fin de tener en cuenta que instrumentos tenemos que
utilizar adecuadamente en nuestras prximas practicas del presente semestre 2016.
Un laboratorio de microbiologa es un lugar convenientemente habilitado donde se
puede habilitar, manejar y examinar microorganismos. Este tipo de trabajo debe ser
llevado a cabo con una buena tcnica asptica y por tanto se requiere un ambiente
limpio y ordenado. Adems de un ambiente microbiolgico, el laboratorio de
microbiologa requiere una instrumentacin bsica para llevar a cabo estudios
elementales. En la presente prctica se describir detalladamente algunos
instrumentos fundamentales en el laboratorio de microbiologa
Objetivos:
Reconocer y manejar el material de uso comn en el laboratorio de
microbiologa.
Tomar conciencia y aplicar las indicaciones de seguridad en el laboratorio de
microbiologa.
MATERIALES DE LABORATORIO
El laboratorio de microbiologa requiere una instrumentacin bsica como los
siguientes:
Tubo de ensayo
Destinados a conservar medios de cultivo en pequeos volmenes. Se utilizan tubos de
vidrio de diversos tamaos con tapa o rosca o a presin. El vidrio debe de ser de buena
calidad, transparente y redondeado, que se utiliza en los laboratorios para contener
pequeas muestras liquidas. Aunque puedan tener otras fases. Como realizar reacciones
en pequea escala, etc.
METODOLOGIA DE USO
Para calentar durante intervalos cortos a llama directa puede sostenerse el tubo por la
mano por su parte superior. Si se desea exponerlo ms intensamente el calor es necesario
la utilizacin de pinzas. En ambos casos debe tenerse la precaucin de no apuntar con la
boca del tubo hacia alguna persona (para evitar proyecciones de la muestra).
PLACAS DE PETRI
Cajas de vidrio de seccin circular, con tapa. Existen de diferentes tamaos segn su
uso, aunque las ms frecuentemente utilizadas tienen 10cm de dimetro.
TECNICAS DE USO
Se utiliza en los laboratorios principalmente para el cultivo de bacterias y otros
microorganismos, solindose cubrir el fondo con distintos medios de cultivo (por
ejemplo agar agar) segn el microorganismo que se quiera cultivar.
IMPORTANTE EN EL USO DE LA PLACA PETRI
Si se quieren observar colonias, durante el tiempo de incubacin del microorganismo
sembrado en la placa esta se mantiene boca abajo, es decir, apoyada sobre la tapa. De
este modo, el agar queda en la parte superior y al condensarse el vapor de agua que
generan los microorganismos por su metabolismo, cae sobre la tapa, evitando que los
microorganismos se diluyan, mantenindose fijos al sustrato y formando colonias.
PIPETAS GRADUADAS
Se utilizan para realizar inoculaciones y diluciones. Para manejar pequeos
volmenes (menores de 1 ml) se recomienda el uso de pipetas automticas que miden
exactamente el volumen deseado (500, 150,50 U), en el extremo se colocan puntas o
tipos estriles que se reemplazan cuando se desea.
La pipeta est formado por un tubo hueco transparente que termina en una de sus
puntas de forma cnica, y tiene una graduacin (una serie de marcas grabadas)
indicando distintos volmenes.
METODOLOGIA DE USO
o Se introduce la pipeta (con la punta cnica para abajo) en el recipiente del cual
se desea extraer un volumen determinado de muestra.
o Se disminuye leve y lentamente la presin ejercida por el dedo, hasta que el
lquido comience a descender. Se vuelve a presionar cuando el menisco del
lquido llego a 0. Si el lquido descendi demasiado, se comienza nuevamente.
o Se traslada la pipeta al recipiente destino.
o Se disminuye nuevamente la presin del dedo hasta llegar a la cantidad de
mililitros necesarios.
PROBETA
La probeta o cilindro graduable es un instrumento volumtrico, que permite medir
volmenes superiores y ms rpidamente que las pipetas, aunque con menor
precisin.
Esta formulado por un tubo generalmente transparente de unos centmetros de
dimetro, y tiene una graduacin (una serie de marcas grabadas) desde 0 ml (hasta el
mximo de la probeta) indicando distintos volmenes. En la parte inferior est cerrado
y posee una base que sirve de apoyo, mientras que la superior est abierta (permite
introducir el lquido a medir) y suele tener un pico (permite verter el lquido medido).
Generalmente miden volmenes de 25 o 50 ml, pero existen probetas de distintos
tamaos; incluso algunas que pueden medir un volumen hasta de 2000 ml.
Puede estar constituido de vidrio (lo ms comn) o de plstico. En este ltimo caso
puede ser menos preciso; pero posee ciertas ventajas, por ejemplo; es ms difcil
romperla.
PIPETAS PASTEUR
Tambin conocidos como goteros, terminados en capilar (angosto), Se usan para
transportar pequeos volmenes de lquido o para sembrar a partir de medios de
cultivo lquidos.
ESPATULA DE DRIGALSKY
Se construye con una pipeta Pasteur larga o con una varilla de vidrio.
Se calienta el extremo en la llama del mechero y se dobla en ngulo recto unos 4cm,
esta ltima porcin se dobla nuevamente del mismo modo. Se utiliza para distribuir
una muestra liquida que se siembra sobre la superficie de un medio de cultivo slido.
ASA KOLLE
Se llama asa cuando el extremo libre se dobla en forma de anillo bien cerrado y con
el dimetro de ms o menos 4mm, de bronce cromado y mango con bakelita. Son de
un material inoxidable, se utiliza para sembrar en la superficie de los medios solidos
o para tomar pequeas porciones de cultivo lquido para su traspaso a otro medio.
MARCADOS PERMANENTE AL SOLVENTE
Son marcadores resistentes al agua, se utilizan para marcar o escribir sobre superficies
de vidrio.
PORTAOBJETOS
Lamina rectangular de vidrio incoloro de 2.5 cm x 7.5 cm y aproximadamente 1cm
de espesor. Se utilizan para hacer observaciones microscpicas de los
microorganismos, ya sea enfrasco o fijados.
CUBREOBJETOS
Pequeas lminas de vidrio transparente, de poco espesor (0,11 a 0.23 mm), usados
para cubrir los preparados realizados sobre el portaobjetos para su posterior
observacin microscpica.
TUBOS O CAMPANITAS DE DURHAM
Pequeos tubos (de unos 5x30mm) que son colocados en forma invertida dentro de
los tubos de ensayo que contiene medio de cultivo lquido, sirven para verificar la
produccin de gas por parte de los microorganismos. Los tubos de ensayo Durham se
utilizan en microbiologa para determinar la produccin de gases de
microorganismos.
Fabricados de vidrio sdico-clcico
Con borde recto
Con fondo redondo
ERLENMEYER
Se utilizan para preparar los medios de cultivo.
VASO DE PRECIPITADOS
Un vaso de precipitados es un simple contenedor de lquidos, usado muy comnmente
en el laboratorio. Son cilndricos con un fondo plano; se les encuentra de varias
capacidades.
Debido a que su graduacin es inexacta, es comnmente usado para transportar lquidos
hacia otro recipiente como a una probeta o a un tubo de ensayo por un embudo. Son
resistentes a los caminos bruscos de temperatura. Tiene mltiples usos en el laboratorio:
calentar, disolver, etc.
CONTADOR DE COLONIAS
Un contador de colonias es un instrumento utilizado para contar colonias de bacterias o
de otros microorganismos que crecen en una placa de agar.
EQUIPO DE FILTRACION MANUAL
El equipo de filtracin consiste en una tcnica de filtracin por membrana se basa en
hacer pasar la muestra de agua a presin manual a travs de un filtro de membrana
micropors, en cuya superficie quedan retenidos los microorganismos.
MANIFOLD O EQUIPOS DE FILTRACION MULTIPLE
Este equipo acelera la realizacin de pruebas de filtrado por membrana y es prctica para
los analistas que deben evaluar grandes volmenes de muestra o que tienen que efectuar
varios ensayos de Coliformes al da. El elector puede filtrar hasta tres muestras en forma
simultnea.
Las vlvulas de control para el embudo tambin permiten la operacin independiente del
embudo. Los colectores se pueden conectar en seria. El colector cuesta menos que el
acero inoxidable u es fcil de manejar y esterilizar.
BOMBAS DE VACIO PARA CONECTAR A MANIFOLD
El filtro de membrana consiste en un disco delgado con tamaos del poro desde 0,45
micras hasta 8 micras que permite el paso de grandes volmenes liquidos gracias a la
aplicacin de presion, pero que impide de bacterias. Las bacterias que permanecen en la
superficie de la membrana, pueden cultivarse sobre una placa de agar.
INCUBADORA
La incubadora nos sirve para mantener un lugar ptimo para el desarrollo y crecimiento
de microorganismos, tiene dos divisiones, en el se ponen microorganismos y se regula a
que temperatura se debe mantener por lo general s a una temperatura de 38
Es un equipo con funciones especficas que permite controlar, segn su diseo,
temperatura y humedad para crear un ambiente adecuado apto para la reproduccin y
desarrollo de organismos vivos. Algunas de las aplicaciones ms comunes son los
cultivos microbiolgicos, micolgicos y virales, entre otros.
ESTERILIZADOR
Especialmente para la destruccin de los microorganismos, sean cuales sean sus
caractersticas, siendo lo mismo que sean patgenos o no, que estn sobre el material o
dentro de el mediante el calor seco.
Se trabaja a una temperatura de 180 C por un tiempo de 2 horas con determinados
materiales ya sean de vidrio, madera o metal.
AUTOCLAVE
La autoclave es un equipo de laboratorio que se utiliza para esterilizar. Por esterilizar se
entiende la destruccin o eliminacin de toda forma de vida microbiana (incluyendo
esporas) presente en objetos inanimados.
Una autoclave es un equipo de laboratorio, utilizando vapor de agua a alta presin y
temperatura. El fundamento de la autoclave es que coagula las protenas de los
microorganismos debidos a la presin y temperatura.
Las autoclaves funcionan permitiendo la entrada o generacin de vapor de agua pero
restringiendo si salida, hasta obtener una presin interna de 15 libras/pulgada2, lo cual
provoca que el vapor alcance una temperatura de 121 grados centgrados. Un tiempo
tpico de esterilizacin a esta temperatura y presin es de 15-20 minutos.
Ciertos materiales no pueden ser esterilizados en autoclave, como el papel y muchos
plsticos(a excepcin del polipropileno).
CAMPANAS DE FLUJO LAMINAR
Las campanas de flujo laminar proporcionan un rea delimitada por superficies fciles
de limpiar y desinfectar con un flujo de ir filtrado a travs de pre filtros, que retienen
las partculas ms grandes que estn presentes en el aire, Cuando todo el aire que entra
a la zona de trabajo es filtrado a travs de los filtros denominado HEPA se produce un
flujo unidireccional, ya que en el aire se mueve a travs del rea de trabajo con una
velocidad uniforme a lo largo de lneas paralela logrando un barrido o eliminacin de las
partculas presentes en el mismo. Anteriormente este movimiento se llamaba lamina, por
esa razn los equipos se denominaron campanas de flujo de laminar, sobre que se sigue
utilizarlo.
Otros
Mechero de Bunsen, gradilla, papel Graf, pinza de madera o metlica.
TIPOS DE MICROSCOPIOS
Actualmente existen dos tipos de microscopios: el ptico y el electrnico.
El microscopio ptico
El microscopio ptico es un instrumento que sirve para aumentar el tamao de un objeto
a travs de un sistema de lentes .Puede conseguirse con este mtodo un aumento de hasta
1000 veces.
Las partes de las que se compone un microscpio se pueden dividir en parte mecnicas y
en parte pticas:
PARTE MECANICA
pie: Sirve de apoyo y para darle estabilidad al
microscopio .En la est integrada la fuente
luminosa.
brazo: es una columna que parte del pie sirve
para sujetar el tubo, puede ser recto o arqueado
Tubo: Es una cmara oscura que esta unida al
brazo .En su parte inferior esta el revolver son
los objetivos y en su parte superior los oculares.
Platina: Es una plataforma horizontal
Revolver : Sujeta los objetivos y gira para
permitir el cambio de objetivo.
SISTEMA DE AJUSTE
Tornillo micromtrico :Tornillo de enfoque que mueve la platina hacia arriba y
hacia debajo de forma brusca y poco precisa
.Tornillo micromtrico; Tornillo de enfoque que mueve la platina hacia arriba y
hacia debajo de forma lenta y muy precisa
Parte ptica
Fuente de iluminacin: E s una lmpara halgena que permite el encendido o el
apagado con un interruptor y cuya intensidad puede ser graduada. Puede tener su
parte superior un anillo para permitir la colocacin de filtros que facilitan la
visualizacin
Condensador: Es un sistema de lentes situado bajo la platina que permite
concentrar la luz de la fuente de iluminacin hacia la preparacin.
Oculares: Estn colocados en la parte superior del tubo y su funcin es captar y
ampliar la imagen obtenida por los objetivos. Actualmente se suelen usar los
microscopios binoculares que tienen dos oculares unidos por un mecanismo que
permite ajustar la sepacion interpupilar. Son normalmente de x10 y x12.
Objetivos: Estn colocados en la parte inferior del tubo insertados en el revlver
y obtienen la imagen real aumentada e invertida. Sobre su superficie esta
indicado su aumento y su apertura numrica, Suelen llevar dibujado un anillo de
color que indica su aumento y suelen ser de x4(rojo), x10 (amarillo), x40(azul) y
x100(blanco).
2.- EL MICROSCOPIO ELECTRONICO
Para estudiar la estructura interna de los microorganismos es esencial el uso del
microscopio electrnico. En este microscopio se utilizan electrones en vez de rayos de
luz, y como lentes funcionan unos electroimanes. Todo el sistema opera en el
vacio.Cuando los electrones pasan a travs de la preparacin algunos son difractados
creando entonces una imagen que se hace visible en una pantalla sensible a los
electrones. La resolucin obtenida con el microscopio electrnico es mucho mayor que
la conseguida con el microscopio ptico. Mientras que con estructuras mas pequeas que
pueden observarse tienen unos 0,2 um , con el microscopio electrnico pueden verse
fcilmente objetos de 0,001 um (= 1nm= 109m). Con el microscopio electrnico es
posible ver muchas sustancias incluso de tamao molecular. Sin embargo, a causa de la
naturaleza de este instrumento solo pueden examinarse objetos muy delgados .Si se est
interesado en ver estructuras internas, incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para
ser observada directamente. Por consiguiente, para preparar muestras para el
microscopio electrnico se necesita tcnicas especiales de cortes ultrafinos.Para
seccionar las clulas primero deben ser fijadas y deshidratadas ,realizndose
habitualmente esto ltimo transfiriendo las clulas a un disolvente orgnico .Despus de
la des hibridacin la muestra es incluida en plstico y en este plstico se cortan secciones
finas utilizando un ultra micrmetro ,por lo general equipado con una cuchilla de
diamante .Una sola clula bacteriana ,por ejemplo , puede cortarse en cinco o seis
secciones muy finas ,que son examinadas despus individualmente con el microscopio
electrnico .Para obtener suficiente contraste
,las preparaciones se tratan con colorantes
especiales de la microscopia electrnica, talvez
como cido
osmico,permanganato,uranio,lantano o plomo
.Estos materiales estn compuestos por tomos
de elevado peso molecular y , por ello,
dispersan bien los electrones. Las estructuras
celulares teidas con uno de esos materiales
presentan un contraste muy aumentado y , por
tanto. Se ven mejor.
L a fina seccin es montada sobre una rejilla
metlica de colodin y es incorporada al
instrumento, luego se aplica el alto vacio.Una
vez evacuada la cmara de la muestra , se
enfoca el haz electrnico y la imagen se
observa en una pequea pantalla .Se toman
fotografas de las imgenes interesantes, ya
que solo en la placa fotogrfica se obtiene la
resolucin ultima del microscopio electrnico. El intenso haz electrnico causa el
deterioro gradual de la muestra, de forma que no es posible una observacin a largo
plazo.
El microscopio electrnico es un arte altamente desarrollado y con esta tcnica somos
capaces de observar estructuras celulares que no pueden verse de ninguna otra manera.
La resolucin mucho mayor que puede obtenerse justifica el cuidado, el tiempo y el gasto
que representa la preparacin de micrografas electrnicas.
MEDIOS DE CULTIVO
El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el
crecimiento de los microorganismo, factores de crecimiento y otros componentes
que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos.
Es decir, es un soporte que proporciona sustancias nutritivas que permitan el
desarrollo y reproduccin de microorganismos. La diversidad metablica de los
microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo tambin lo
es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos.
El conocimiento de las necesidades nutritivas y fsicas de los microorganismos es
fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado .Los requisitos que debe
reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el ambiente natural en
el que se desarrollan.
CUESTIONARIO
A-Qu tipos de desinfectantes se debe utilizar para las manos en el laboratorio de microbiologa?
Antispticos y desinfectantes ms frecuentes
B.-Cundo se utiliza una campana de flujo laminar?
Dentro de estas cabinas o campanas se trabaja con obleas de semiconductor, cultivos
celulares o cualquier otro sistema que deba mantenerse limpio y deba evitarse la
contaminacin con partculas minsculas. Estas cabinas estn diseadas para
proporcionar un aire limpio y constante a una velocidad de paso de aire de 0.30 a
0.50 metros por segundo para as barrer la superficie de la zona de trabajo y evitar la
suspensin de partculas as como una posible contaminacin de las muestras.
El aire es inyectado a la zona de trabajo a travs de un filtro HEPA o ULPA e
insuflado en forma de un flujo laminar o flujo unidireccional, muy suave, hacia el
usuario. La superficie de trabajo de la cabina se construye generalmente de acero
inoxidable grado 304 o superior para facilitar su limpieza y aumentar su durabilidad
por el uso, con acabados sanitarios, sin espacios o juntas donde las esporas pueden
llegar a acumularse.
Las cabinas de este tipo existen tanto en configuracin vertical como en horizontal,
segn que la posicin del filtro est en la parte superior o en la parte trasera de la
zona de trabajo sin embargo el flujo de aire siempre va hacia el operador por lo cual
estos equipos ofrecen proteccin nicamente a la muestra que se maneja en su
interior, pero nunca al operador.
La norma reguladora que establece el estndar comnmente aceptado para estas
cabinas es la norma IEST-RP-CC002.3 aunque tambin se emplea la norma
NSF/ANSI-49.3
Las cabinas de flujo laminar pueden tener una lmpara de rayos ultravioleta-C con
accin germicida para esterilizar el recinto y su contenido, cuando no se utiliza. Es
importante apagar la lmpara durante la utilizacin de la cabina, ya que rpidamente
se produciran quemaduras de sol en la piel expuesta, y tambin puede
causar cataratas oculares
BIBLIOGRAFIA
Rodrguez AU. Tcnicas de vigilancia de infecciones hospitalarias. En:
Rodrguez C, ed. Procedimientos tcnicos en microbiologa clnica. La
Habana: Editorial Ciencia y Tcnica; 2003.
Rutala WA. Disinfection, sterilization and waste disposal. In: Wenzel RP,
ed. prevention and control of nosocomial infection. Baltimore: William and
Wilkins. 2nd. Edition; 1999.
Rodrguez AU, LLamos RA. Vigilancia microbiolgica en la atencin
primaria de salud. MG Rev Mex Patol Clin. 2004;51(3):178-81.
MINSAP. Programa Nacional de Prevencin y Control de las Infecciones
Hospitalarias. La Habana; 2001.
Rodrguez AU. Infeccin hospitalaria. Resistencia bacteriana in vitro a
los antimicrobianos en uso de instituciones de salud de Ciudad de La
Habana. Ao 2003. Rev Panam Infect. 2004;6(3).
