Digestin de DNA usando

Enzimas de Restriccin

Objetivos
El cortar el DNA con enzimas de restriccin es muchas
veces el primer paso de los investigadores para estudiar
un gen. En este laboratorio se har lo siguiente:

Usar enzimas de restriccin para cortar el DNA.

Separar los fragmentos usando electroforsis.
Analizarn un gel con DNA cortado con diferentes
enzimas de restriccin.

En bacterias, un plsmido, una pieza circular de DNA,

constituye una gran parte del material gentico.

El plsmido tiene que hacerse linear para poder

recombinarse.

En bacterias, un plsmido, una pieza circular de DNA,

constituye una gran parte del material gentico.

Muchos tipos diferentes de bacterias tienen dos formas de ADN:

(1) un solo cromosoma compuesto por una molcula grande de ADN
que contiene toda la informacin que necesita el organismo para sobrevivir y
reproducirse
(2) plsmidos, que son pequeas molculas circulares de ADN, con un
tamao que vara de 1,000 a 200,000 pares de bases (dos bases nitrogenadas
unidas para conectar cadenas complementarias de ADN) que se encuentran en
diversas copias separadas del ADN cromosmico. Algunas bacterias
tienen hasta 500 plsmidos en cada clula

El plsmido tiene que hacerse linear para poder

recombinarse.

Las enzimas de restriccin reconocen secuencias

especficas en el DNA.

Enzimas de restriccin

Tambin conocidas como endonucleasas, cortan los enlaces

fosfodiester a partir de ua secuencia que reconocen..

Endonucleasas

Endonucleasas de restriccin.

Las bacterias poseen las endonucleasas de

restriccin como un sistema enzimtico de defensa
en contra de la invasin de DNA exgeno, como por
ejemplo; el ataque de un bacterifago.

Enzimas de restriccin

La secuencia que reconocen es una secuencia palindrmica

(secuencia que se lee igual en ambas direcciones).

Secuencias Palindrmicas:

Amad a la dama
Adn no calla con nada

Las enzimas de restriccin al cortar DNA

pueden producir dos tipos de cortes:

Cohesivos o pegajosos: cortan a manera

escalonada en dos puntos diferentes.

Abruptos o romos: cortan en un slo punto.

Extremos cohesivos

Es cuando la enzima de restriccin rompe la

cadena del ADN en posiciones no
simtricas y producen fragmentos con
secuencias complementarias de una cadena.

Extremos romos

Es cuando la enzima de restriccin corta

exactamente sobre los dos ejes de simetra.

Las enzimas de restriccin al cortar DNA

pueden producir dos tipos de cortes:

Frecuencia de reconocimiento
Las enzimas que reconocen una secuencia de 4 bases,
cortan con ms frecuencias que las que reconocen una
secuencia de 6 bases
La frecuencia esta determinada por la probabilidad:
Una secuencia de 4 bases tiene la probabilidad de ocurrir
en un genoma cada 256 pb (44 = 256)
Una secuencia de 6 bases tiene la probabilidad de ocurrir
en un genoma cada 4,096 pb (46 = 4096).
Una secuencia de 8 bases tiene la probabilidad de ocurrir
en un genoma aproximadamente cada 65,000 pb (48
65,000).

E coli vs H. influenza

Descubiertas por Stewart Lynn y Werner Arber

en 1960 en la bacteria Echerichia coli.
Se speraba que esta cortara cualquier DNA en
una secuencia de nucletido especfico
No ocurri como ellos esperaban, la enzima no
cumpli con sus expectativas.
Ms adelante, Hamilton Smith descubri una
endonucleasa de restriccin en la
bacteria Haemophilus influenza sepa Rd (figura
1), llamada HindII.

Nomenclatura

La primera letra del nombre de la enzima proviene

del gnero

Las prximas dos letras de la especie

La cuarta letra de la sepa.

El nmero romano hace referencia a la cantidad de

endonucleasas de restriccin que han sido extradas
de la misma bacteria.

Enzimas de restriccin
La

enzima toma el nombre de las bacterias que la produce:

EcoRI: E = gnero Escherichia.
co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

Corte cohesivo con EcoRI:

Enzimas de restriccin
Endonucleasa de restriccin Secuencia de
reconocimiento
AluI
AGCT
BamHI
GGATCC
EcoRI
GAATTC
HaeIII
GGCC
HindII
GTPyPuAC
HindIII
AAGCTT
PstI
CTGCAG
HpaII
CCGG
NotI
GCGGCCGC

Endonucleasa de restriccin Secuencia de

reconocimiento
AluI
AGCT
BamHI
GGATCC
EcoRI
GAATTC
HaeIII
GGCC
HindII
GTPyPuAC
HindIII
AAGCTT
PstI
CTGCAG
HpaII
CCGG
NotI
GCGGCCGC

Electroforesis de DNA:

Despus de tratar el DNA con las diferentes

enzimas, los fragmentos son separados por su
tamao usando un gel de electroforesis.

Despus de la carrera del DNA en el gel, este se

tie para revelar los patrones de bandas formados
en el gel que corresponden a fragmentos de
diferentes tamaos.

Principios de electroforesis

Tcnica usada para separar y purificar

macromolculas (i.e. proteinas, cidos
nucleicos) que varan en tamao, carga o
conformacin.
Cuando molculas cargadas son colocadas
en un campo elctrico, estas migran hacia el
polo positivo (nodo) o polo negativo
(ctodo) de acuerdo a su carga.

Permite producir fragmentos definidos que

se pueden separar mediante una
electroforesis horizontal.

Geles comnmente usados:

Agarosa: polisacrido extraido de algas. No

txico. Poco poder de resolucin pero alto
grado de separacin. Separa fragmentos de
DNA de 200 a 50,000 pb.

Poliacrilamida: polmero de acrilamida.

Txico. Menor grado de separacin pero alto
poder de resolucin. Usado para fragmentos
de DNA de 500 pb. Usado para separar
mezclas de protenas.

Preparacin de gel:

La mezcla de agarosa y
buffer tiene que
ponerse a calentar,
agitando
frecuentemente hasta
que llegue al punto
donde comience a
hervir.

Una vez que el frasco

con la agarosa ya
pueda tocarse sin
quemarse, verter con
cuidado la mezcla en la
bandeja.
Dejar que se torne
opaco y slido.

Prctica de uso de micropipetas:

Apoye brazo que est

agarrando micropipeta en
superficie firme.
Utilice la mano contraria
para apoyar la micropipeta
Introduzca punta de
micropipeta dentro de fosa,
sin tocar el gel
Vierta el contenido en fosa,
presionando botn de la
pipeta hasta primer punto
de resistencia

Cuando la gel
solidifique y se torne
opaca, sacar la peinilla
y poner gel en cmara
de electroforsis con
fosas del lado del polo
negativo.
Proceder a pipetear las
muestras en las fosas.
Correr gel.
Teir.

Resultados luego
de teir:

A: marcador con
pedazos de tamao
conocidos.
B: Lamda cortado con
Eco R1.
C: Lamda sin cortar.

Mapa de restriccin

Es un diagrama de la molcula de DNA en

donde se muestra los sitios de corte de las
enzimas de restriccin.
Se puede localizar secuencias de bases
especificas en un cromosoma para estimar el
grado de diferencia entre los cromosomas

En la prctica se utilizaran una mezcla de

varias enzimas de restriccin

EJERCICIO n 1
1.- Si estuviramos trabajando con un DNA lineal como el que se muestra en la
figura siguiente, cul es el tamao en pares de bases (pb) de los fragmentos de
DNA que se obtienen al realizar las digestiones con la enzima d, con la enzima e,
con la enzima f y con las distintas combinaciones entre las mismas? Los nmeros
corresponden al nmero de pares de bases del DNA (en total su tamao es de
1500 pares de bases).

EJERCICIO n 1

EJERCICIO n 1

EJERCICIO n 1

EJERCICIO n 1

EJERCICIO n 1

EJERCICIO n 2
En la figura se muestra un plsmido, con un tamao de 4000 pares
de bases. En el mismo hay cinco sitios de restriccin, que
corresponden a tres enzimas (a, b y c). Al lado se muestra el
resultado de una electroforesis en un gel de agarosa, de los
productos de las digestiones con las enzimas de restriccin.

EJERCICIO n 2

La clonacin es la tcnica central de la tecnologa de

DNA recombinante.
permite replicar (clonar) en grandes cantidades un
pedazo especfico de DNA.
El DNA de inters es cortado y ligado a un elemento
gentico, vector de clonacin, que se puede replicar
autnomamente cuando se introduce a una bacteria
en crecimiento, en la mayora de los casos E. coli.
El vector de clonacin puede ser un plsmido o
un bacterifago.

Tanto el DNA de inters como el

vector de clonacin deben ser
cortados con la misma enzima.

Las enzimas ms utilizadas en esta

tcnica son aquellas que producen
terminales pegajosos. En esencia,
dos fragmentos de DNA generados
por la misma endonucleasa de
restriccin pueden unirse por el
pareo de las bases complementarias
en los fragmentos sencillos de cada
terminal.

2) DNA fingerprinting
Los

anlisis de los patrones formados por los

fragmentos que se producen cuando el DNA es
cortado por las endonucleasas de restriccin han sido
utilizados,
para estudiar en detalle los genomas de diversos
organismos,
diagnosticar enfermedades genticas
resolver crmenes violentos.
Estos anlisis tienen como base el hecho de que dos
personas que no son gemelos idnticos poseen diferente

Aunque la diferencia en la secuencia de bases en el DNA

entre dos personas sea pequea, los fragmentos
producidos por las endonucleasas de restriccin son de
diferentes tamaos.
Esta diferencia en el tamao de los fragmentos, conocido
como patrones polimrficos de endonucleasas de
restriccin (restriction fragment length
polymorphisms, RFLPs), pueden ser analizados por
electroforesis
Los resultados en los patrones son distintivos para cada
persona, por lo que funcionan como huellas dactilares
(DNA fingerprinting).