PRACTICO DE LABORATORIO N6

ENZIMAS 1:
KM DE LA -GALACTOSIDASA

Integrantes
Patricio Romn
Camila Sandoval

Carrera
Licenciatura en Biologa
Biologa Ambiental
Fecha
24/11/2015

INTRODUCCIN
En el prctico anterior se estudi la velocidad con que la -galactosidasa catalizaba la
ONFG a ONF, para demostrar experimentalmente que en un rango determinado de concentraciones
de sustrato, existe una relacin directamente proporcional entre esta variable y la formacin de
productor, hasta alcanzar un punto de equilibrio, en donde se observa que la velocidad de la reaccin
detienen su crecimiento lineal y tiende a un valor independiente de la concentracin de sustrato. Esto
se puede comprobar al comparas diferentes tratamientos enzimticos incubado en una misma unidad
de tiempo, pero a distintas concentracin de sustrato. El producto formado se puede expresar en
trminos de velocidad de reaccin.
Este comportamiento particular de las enzimas fue descrito por primera vez en 1905 por Henri.
Luego, los cientficos Michaelis y Moud perfeccionaron las conclusiones de Henri. Sin embargo, a
pesar del extraordinario acercamiento de Michaelis y Menten, Briggs y Haldane en 1925 derivaron la
ecuacin de velocidad de catlisis que se utiliza en la actualidad [1].
Briggs y Haldane definieron la velocidad inicial cuando el sustrato (S) es mucho mayor al
producto (P), por lo que la velocidad con que producto vuelve a formar el complejo enzima-sustrato
(ES) es descpreciable y la velocidad depende de la concentracin del sustrato. Este estado lo
definieron como no estacionario. Luego, la enzima se satura y el complejo ES se forma y se
consume instantneamente. A este estado lo llamaron estacionario y es cuando la velocidad de
catlisis tiende a un valor constante, que es su valor mximo [2].

V 0=

V max [S ]
K M +[S]

(1)

La Ecuacin 1 corresponde a la llamada Ecuacin de Velocidad de Michaelis-Menten, en la

cual V 0 y V max corresponden a la velocidad inicial y velocidad mxima, respectivamente, ambas
en unidades de mM /min ; K M a la constante de Michaelis, que describe la concentracin de
sustrato a la cual se alcanza

1
V
2 max

y se encuentra en unidades mM; y

[S ]

corresponde a la

concentracin de sustrato en mM.

Sin embargo, la Ecuacin de Michaelis-Menten no es un mtodo eficaz para el clculo de

K M . Una forma fcil de calcularlo es mediante el grfico de los dobles recprocos. Para ello es
necesario calcular el recproco de V 0 y [S ] para posteriormente graficarlo como muestra la
Figura 1.

Figura 1. Relacin entre el recproco de

V max

V0

[S ]

KM
K M

. La pendiente de la recta corresponde la razn entre

, mientras que la interseccin con la ordenada y abscisa corresponde al recproco de

respectivamente.

V max

y
,

La ecuacin que define a la recta es

K
1
1
1
= M
+
V 0 V max [S ] V max

(2)
Los objetivos de este prctico fueron estudiar la relacin de la concentracin de sustrato sobre
la velocidad de la reaccin catalizada por la -galactosidasa y determinar los parmetros cinticos (
K M y V max ).
Para determinar la concentracin de producto se utilizar la Ecuacin de Lambert-Beer de la
curva de calibracin de ONF obtenida en el prctico 1.

A=0, 0,2907 C
(3)
Donde

corresponde a la absorcin y

a la concentracin de la solucin.

MTODO EXPERIMENTAL
Materiales

Amortiguador fosfato de sodio

pH 7,2 0,1 M
o-nitrofenil--galactsido
(ONFG) 0,01 M
o-nitrofenol (ONF) 0,5 mM
H2O destilada
Tubos de ensayo

Carbonato de sodio 1,0 M

Enzima -galactosidasa
Pipetas de parciales de 0,1
mL; 0,2 mL; 1 mL y 2 mL
Espectrofotmetro

Mtodo Experimental
Se diluy 10 veces la solucin de ONFG (0,5 mL de solucin + 4,5 mL de agua), obteniendo
una solucin de 1 mM de ONFG. Primeramente se prepar una solucin blanco enzima y luego 8
soluciones con diferentes concentraciones de ONFG entre 0,06 a 2 mM. Dependiendo del caso se
determin si utilizar la solucin dada a una concentracin de 10 mM o la diluida para la preparacin
de cada tratamiento. Cada tubo contena una porcin de agua, buffer sustrato y enzima, adicionados
en ese orden hasta alcanzar un volumen de 1,5 mL. Las soluciones se incubaron durante 10 minutos
a temperatura ambiente y a un pH de 7,2. Transcurrido el tiempo, se detuvo la reaccin agregando
carbonato de sodio y agua hasta completar un volumen de 3,0 mL. Es importante menciona que la
enzima se agreg a diferentes tiempo, en una distancia de 2 min entre tubo y tubo, con el fin de
contar con el tiempo necesario para adicionar el inhibidor a casa una de las soluciones. Finalmente,
se midi la absorbancia en un espectrofotmetro de cada tubo a 420 nm.

El protocolo del experimento se muestra en la Tabla I.

RESULTADOS BRUTOS
A continuacin se presenta el protocolo del experimento realizado. El experimento fue
realizado en un tiempo de incubacin de 10 minutos a temperatura ambiente. Los tubos destacados
en amarillo corresponden a los preparados con solucin de 10 mM de ONFG.
Tabla I. Protocolo de preparacin de tubos de ensayo. El volumen de incubacin de 1,5 mL y se realiz durante 10 minutos
a temperatura ambiente.
Volumen H2O
Volumen
Volumen
Concentracin
Volumen
Volumen
Volumen
Tubo
incubacin
Enzima
Na2CO3
ONFG [mM]
ONFG [mL] Buffer [mL]
Agua [mL]
[mL]
[mL]
[mL]
1
0,06
0,09
0,5
0,71
0,20
0,30
1,20
2
0,08
0,12
0,5
0,68
0,20
0,30
1,20
3
0,10
0,15
0,5
0,65
0,20
0,30
1,20
4
0,12
0,18
0,5
0,62
0,20
0,30
1,20
5
0,16
0,24
0,5
0,56
0,20
0,30
1,20
6
0,24
0,36
0,5
0,44
0,20
0,30
1,20
7
0,40
0,60
0,5
0,20
0,20
0,30
1,20
7'
0,40
0,06
0,5
0,74
0,20
0,30
1,20
8
2,00
0,30
0,5
0,5
0,20
0,30
1,20

En la Tabla II se presentan las absorbancias obtenidas para cada solucin. La absorbancia se

midi con una longitud de onda de 420 nm. El blanco enzima tuvo una absorbancia de 0,009.
Tabla II. Absorbancia obtenida para cada tubo de ensayo (

=420 nm

Tubo

Concentracin
ONF [mM]

Absorbancia

0,06

0,245

0,08

0,261

0,10

0,307

0,12

0,348

0,16

0,421

0,24

0,513

0,40

0,555

7'

0,40

0,562

2,00

0,710

).

ANLISIS DE RESULTADOS
La siguiente tabla muestra las absorbancia de cada tubo de ensayo restndole el blanco
sustrato. Se observa que a medida que aumenta la concentracin de sustrato, tambin lo hace la
absorbancia. Adems, el tubo 7 y 7 tuvieron absorbancias similares.
Tabla III. Absorbancia neta obtenida para cada tubo de ensayo ( =420 nm ).
Tubo

Concentracin
ONF [mM]

Absorbancia
(420 nm)

0,06

0,236

0,08

0,252

0,10

0,298

0,12

0,339

0,16

0,412

0,24

0,504

0,40

0,546

7'

0,40

0,553

2,00

0,701

La Tabla IV muestra la concentracin de ONFG y de ONF en [mM], la velocidad de reaccin y

actividad enzimtica. Para el clculo de velocidad de reaccin primero se obtuvo la concentracin de
ONF a partir de la ecuacin 1. Luego, se calcularon los moles contenidos en 3,0 mL de solucin y,
posteriormente, esta cantidad se dividi por el tiempo que demor la reaccin (10 minutos).
Tabla IV. Concentracin de ONF, velocidad de reaccin y actividad enzimtica.

Tubo

Concentracin
ONFG [mM]

Concentracin
ONF [mM]

ONF
[moles]

1
2
3
4
5
6
7
7'
8

0,06
0,08
0,10
0,12
0,16
0,24
0,40
0,40
2,00

0,8118
0,8669
1,0251
1,1662
1,4173
1,7337
1,8782
1,9023
2,4114

2,4355
2,6006
3,0753
3,4985
4,2518
5,2012
5,6347
5,7069
7,2343

Velocidad de
Reaccin [
moles/min
]

0,2436
0,2601
0,3075
0,3498
0,4252
0,5201
0,5635
0,5707
0,7234

Actividad
enzimtica
[U/mL]

1,2178
1,3003
1,5377
1,7492
2,1259
2,6006
2,8173
2,8535
3,6171

En la Tabla IV se observa que cuando aumenta la concentracin de sustrato la velocidad de

reaccin y actividad enzimtica tambin lo hace, alcanzando sus valores mximos cuando la
concentracin de ONFG es 2,00 mM. El crecimiento no es lineal.

En el grfico de la Figura 2 se observa mejor lo sealado, en el cual se relaciona la

concentracin de sustrato y la velocidad de reaccin.

Curva de Saturacion -galactosidasa

0.8000

R = 0.95

0.7000
0.6000
0.5000
Velocidad de Reaccin [moles/min]

0.4000
0.3000
0.2000
0.1000
0.0000

0.5

1.5

2.5

Concentracion ONFG [mM]

Figura 2. Curva de Saturacin de -galactosidasa. Las velocidades de reaccin [ moles/min] y concentraciones de

ONFG [mM] corresponden a los datos de la Tabla IV. El ndice de correlacin es 0,9497.

Para obetener los valores de K M y V max experimentales se ocup la ecuacin de

dobles recprocos (ecuacin 2). La Tabla V presenta los valores de los recprocos de V 0 y [S ] .
Tabla V. Valores recprocos de la concentracin de ONFG (

1
[s ]

) y la velocidad de reaccin enzimtica (

V0

de

cada tubo de ensayo.

Tubo
1
2
3
4
5
6
7
7'
8

1
min
1
1
[
]
[mM ]
V 0 moles
[S ]
16,67
12,5
10,0
8,33
6,25
4,17
2,50
2,50
0,50

4,106
3,845
3,252
2,858
2,352
1,923
1,775
1,752
1,382

Los datos de la Tabla V fueron graficados en el grfico de la Figura 3. Para ello no se

consider el punto (4,106; 16,67) por razones que se expondrn en la discusin. Adems Un se utiliz
promedio entre los puntos 1,752 y 1,752 obtenidos a partir de una misma concentracin de sustrato,
ya que la diferencia entre ellos es muy pequea y no sera observable en la grfica.

De acuerdo a la Figura 3, se observa una relacin lineal entre los valores recprocos de la
velocidad de reaccin y la concentracin de sustrato. Tambin se observa que la ecuacin de la lnea
de tendencia es de y = 0,215x +1,1 y el coeficiente de correlacin de los datos es alto, por lo que se
demuestra la alta dependencia de la velocidad de reaccin con respecto a la concentracin de
sustrato.
De acuerdo a la ecuacin de la recta generada, la pendiente es de 0,215 y representa al valor

de

Km
V max

en la ecuacin de dobles recprocos terica. A su vez, interseccin de la recta cuyo valor

1
. Por lo tanto, su recproco es 0,909
V max

moles
, que
min
sera la velocidad mxima experimental. Luego, a partir de la pendiente se puede calcular K M ,
es 1,1 el cual representa el valor de

resultando un valor experimental de 0,195 mM.

Grafico de Dobles Reciprocos

5.000
4.000
3.000

1/Vo [min/moles]

2.000

f(x) = 0.21x + 1.1

R = 1

1.000
0.000

-10.0

-5.0

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

1/[ONFG] [mM-1]

Figura 3. Grfico de dobles recprocos, el cual relaciona los recprocos de velocidad inicial [min/ moles] y de
concentracin de ONFG [mM-1] de la Tabla V. El punto (4,106; 16,67) no fue graficado. Tambin se muestra le ecuacin de la
recta de la lnea de tendencia y el ndice de correlatividad (0,9861).

Para tener una idea de que tan acertado es el clculo de las variables cinticas se contina con otras
transformaciones, no se ilustra su grfico (igual si quieres ponerlo lo deje en el Excel), pero se obtuvo
un Km y V experimental en cada caso para comparar:

S Km
1

S
v
V
V

Para Hanes-Woolf :
Para esta transformacin que es una ecuacin de concentracin de sustrato divido por la velocidad
de reaccin en funcin de la concentracin de sustrato, se obtuvo una recta y = 1,2911x + 0,1821 y
como se observa la pendiente es igual al reciproco de la velocidad mxima, y V = 0,774 moles/min,
y una Km dividida por V, que es igual al punto de interseccin del eje Y, y Km= 0,14 mM.
CUESTIONARIO (lo copie del otro informe hay que revisarlo, y bien porque se equivocan ms que la
mierda)

1.- Determine la fraccin de V que se obtiene con una concentracin de sustrato igual a K m,
2Km y 10 km.
Utilizando la ecuacin de Michaelis-Menten y remplazando el valor de S en cada caso por K m, 2Km
y 10 km segn corresponda, se obtienen los siguientes resultados:

v=

Para una concentracin de sustrato de veces Km se obtiene una velocidad de

Para una concentracin de sustrato de 2 veces Km se obtiene una velocidad

Por ltimo, si la concentracin de sustrato es 10 Km, la velocidad es

v=

v=

V
.
3

2V
.
3

10 V
.
11

2.- Si una enzima tiene una velocidad mxima de 30 moles/min/mg y una k m de 5mM con qu
concentracin de sustrato se obtendr un cuarto de su velocidad mxima?
Calculamos por medio de la ecuacin de Michaelis-Menten:

v
Remplazando v por V se obtiene:

V S
Km S

1
V S
V
4
Km S
1
1
V Km V S V S
4
4
1
1

V K m V S 1
4
4

0,25 K m
S
0,75

Luego, remplazando el valor de Km, se obtiene:

0,25
5
0,75
S 1,67 mM
S

3.- En la reaccin:

La constante de Michaelis se define como (k-1 + K2 / k1). Si se define la constante Ks como K1/K1, en qu condiciones de Km tendera a ser igual que Ks?
Ks es una medida que indica que tan afines son la enzima y el sustrato en un complejo ES. Para que
este valor se igual con la constante de Michaelis, la unin de la enzima y el sustrato debe ocurrir a
una mayor velocidad que la velocidad con la que la enzima cataliza la formacin de los productos de
la reaccin. De esta manera K2 es despreciable con respecto a K-1 pues es demasiado pequeo en
comparacin.
4.- Etapas en la purificacin de una enzima:
Etapa

Volumen (mL)

Actividad
enzimatica
(U/mL)

Proteinas
(mg/mL)

Extracto crudo (1)

DEAE- Celulosa (2)
ATP- agarosa (3)

400
110
30

0,8
2,5
5

1,19
0,81
0,12

Complete la tabla agregando el rendimiento porcentual, la actividad especfica y el grado de

purificacin de la enzima en cada etapa de este procedimiento.
Etapa

Volumen
(mL)

(1)
(2)
(3)

400
110
30

Actividad
enzimatica
(U/ml)
0,8
2,5
5

Proteinas
(mg/ml)
1,19
0,81
0,12

Rendimiento
porcentual
%
100
85,9
46,9

Actividad
especifica
(U/mg)
0,672
3,086
41,67

Actividad
total
(U)
320
275
150

Grado de
purificacion
1
4,59
62,01

BIBLIOGRAFA

[1] Jacques-Paul Borel, Alain Randoux, Francois-Xavier Maquart, Christian Le Peuch &
Jacques Valeyre (1989), Capitulo 16: Enzimas. En: Bioqumica dinmica, Primera edicin,
Editorial Mdica Panamericana S.A. Buenos Aires, Argentina. pp. 291.
[2] Brigg, G. E. and Haldane (1925), J.B.S., Biochem. J, 19, 338.