éQué son los Ss Hy Le protoplastos ss y para qué sirven? Wilberth Poot-Poot y Teresa Hernandez-Sotomayor Intreduccién as plantas, ademés de ser fuente de alimentos, generar oxigeno y retirar diéxido de carbono del ambiente, pueden utilizarse como materia prima en el érea de la biotecnologia. A través de ésta se ha logrado obtener diferentes especies vege- tales con un alto grado de produccidn de alimentos, y especies con resistencia al ataque por patégenos. Sin embargo, para obtener culvos vegetales con las cualidades antes mencionadas es necesario apli- cat procesos de transformacién que demandan largos tiempos para evaluar la transformacién y la regenera- cidn de la planta Por otro lado, las diferentes partes de las plantas (hojas, raices, polen, etcétera) o los diferentes tejidos vegetales que se originan a partir de éstas, pueden ulizarse para obtener células que carecen de pared ce- lular, denominadas protoplastos. Estos, junto con pro- cedimientos de transformacién transitorios, pueden aplicarse como una altemativa para evaluar la funcién de uno 0 varios genes en respuesta a un cambio bid- tica 0 abidtico. En este trabajo nos enfocamos a describir qué son, cémo son y dénde se pueden utilizar los protoplastos. {Qué es la pared celular? Las células vegetales, a diferencia de las animales, presentan una cubierta que las rodea en casi todas las (66 clencia - je sepuembve 2015 etapas de su desarrollo. En animales, las células em- brionarias tienen la habilidad de moverse de un lugar 2 otro para formar tejidos y érganos. Las células vege- tales, en cambio, carecen de este movimiento debido a la pared celular, compuesta de lignina y celulosa, que las rodea; ésta es una de las diferencias mas im- portantes entre las células vegetales y las animales. La pared celular vegetal se divide en pared prima- ria y pared secundaria, que varian en composicién qui- mica, grosor y propiedades fisicas (Figura 1 y Cuadro 1) En el genoma de la planta Arabidopsis thaliana se ha determinado que existe un nimero muy grande de ge- nies que codifican proteinas involucradas en el meta- bolismo de la pared. La pared celular, ademas de ser una estructura com- pleja, dinémica, que proporciona rigidez y protege a la membrana plasmatica de dafio fisico y mecénico, fun- ciona como mediadora en todas las relaciones de la célula y su entorno, y permite asi a las células mante- netse viables. Pero en ocasiones, cuando se desea hacer experimentos de transformacién genética ~que requie- ren introducit ADN (Acido desoxirribonucleico) fo- raneo en una célula vegetal la pared puede ser un problema, por lo que es necesario eliminarla Rie son los protoplastes? Un protoplasto es una célula vegetal a la cual se le ha removido completamente la pared celular, medianteLe ee ee et ee ec ee eee)Comunicaciones libre Pared primar Limira meda Pred primar Pared secundara Membrana pasmitica Fiqurat, Cuadro 1. Composicién general de la pared celular de las plantas Polisacirides 90% 55-85% Celulosa 3086 50-85% Hemicelulosa 30% 530% Pectina 30% - Proteina 10% - Lgnina - 15.35% métodos mecénicos o enzimaticos. Observados al mi croscopio, los protoplastos presentan una forma esfé rica, con el citoplasma rodeado por una membrana plasmatica: en el interior de la célula se puede visua- lizar el niicleo (Figura 2). En 1960, Cocking fue el primero en producir, con métodos enzimaticos, pro- toplastos a partir de plantas superiores. En sus experi. mentos utli2é extractos crudos con actividad de celulasa obtenidos del hongo Myrothecium varrucana. Actual Figura. 68 Ciencia - jlo sepiembre 2013 mente, por este método es posible obtener protoplastos de érganos completos de las plantas y de tejidos en cultivo. resets: de protoplastos Como ya se menciond, es posible obtener pro- toplastos a partir de cualquier érgano, tejido y tipo de planta, Las fuentes mas comunes son las hojas (meséf- lo foliar) y tejidos cultivados in vitro, como suspensiones celulares, callos, etcétera. Sin embargo, dependiendo de las necesidades experimentales, se pueden utilizar tejidos diferenciados o no diferenciados para obtener protoplastos. Uno de los factores que también afecta el aisla- miento, rendimiento y viabilidad de los protoplastos (Figura 3) es el estado fisiol6gico del tejido de la plan- ta de la cual se parte, Para obtener protoplastos de excelente calidad, las plantas deben ser cultivadas en condiciones contraladas, y en ocasiones es necesa- rio proporcianarles un pretratamiento con hormonas vegetales (fitohormonas). Normalmente, para aislar protoplastos, el material vegetal (hoja, callo y suspen- siones celulares) debe incubarse con la mezcla enzim: tica durante 4 a 18 horas, a una temperatura de 28 °C, en oscuridad y con agitacién ligera para liberar los pro- toplastos del tejido Métodos para preparar protoplastos Los protoplastos pueden aislarse por medios meca- nicos, por métodos enzimaticos 0 por una combina- cién de ambos. Para lograr éxito al aislar protoplastos se ha reco- mendado exponer el material de partida (hoja,raiz, sus pensiones celulares, etcétera) a un medio ligeramente hiperosmiético para que la membrana se contraiga y se separe de su pared celular. Esta contraccién se logra mediante el uso de soluciones salinas como cloruro de potasio, sulfato de magnesio o aziicares-alcohales (ma- ritol). El proceso de separacién de la membrana plas- rmatica de la pared celular es llamado plasmélisis Klercker (1892) fue el primero en utilizar el méto- do mecénica para aislar protoplastos vivos utlizandoFigura. cebolla como fuente de partida. Dicho métoda consis- te en aplicar un choque osmético para producir plas- mélisis en las oélulas, las cuales se rompen luego de un corte, Posteriormente, los protoplastos son liberados de las células mediante el restablecimiento de su nivel osmética Actualmente, este método ha sido reemplazado casi en su totalidad por el enzimatico. En el mercado exis- ten preparaciones comerciales de enzimas para aislar protoplastos (pectinasas, celulasas 0 hemicelulasas) cuyas fuentes pueden ser de origen fingico o bacte- riano. Usando una mezcla de estas enzimas se puede hidrolizar las paredes celulares y obtener altos ren- dimientos de protoplastos viables, adecuados para di ferentes fines en la investigacién Transformacién de protoplastos La primera metodologia desarrollada para la trans- formacién genética de plantas (introduccién de ma- terial genético ajeno) fue la de A tumefaciens. Sin embargo, esta tecnologia no fue de utilidad para abordar la transformacin de especies de importancia econémica como los cereales, debido @ que no son hos- pedantes naturales de esta bacteria, y por tanto no se lograba un mejoramiento genético. Esto originé que se buscaran métodos alternatives, lo que condyjo al desarrollo de los métodos fisicos de transformacién. En ellos, el transgen (gen fordneo) es introducido en la célula vegetal mediante distintas técnicas, que men- cionaremos a continuacidn En 1983 se informé sobre los primeros experimen- tos de expresin de un transgen en células vegetales, y al afio siguiente se obtuvieron las primeras plantas transgénicas (tabaco y petunia). Desde entonces se ha extendido la aplicacién de esta tecnologia a un gran numero de especies. Entre sus aplicaciones se encuen- tran la obtencién de plantas con resistencia a virus insectos, hongos y bacterias; la tolerancia @ herbicidas ya diferentes tipos de estrés abidtico, yla modificacién de la calidad nutriva de los cultivos, entre otras. A continuacidn se mencionan algunos de los méto- dos mas comunes para la transformacidn de protoplastos: Agrobacteriunt La transformacién vegetal mediada por Agrobacterium consiste en hacer cortes circulares del tejido vegetal, generalmente hoja, y dejarlos en contacto con una suspensién bacteriana por el tiempo necesario, y luego evaluar si se llevé a cabo la trans- formacién. Sin embargo, este métoda también se ha aplicado para transformar protoplastos vegetales. De igual manera que en hoja, los protoplastos son puestos en contacto con la bacteria Agrobacterium, y luego son lavados con una solucién adicionada con antibticos, para eliminar a la bacteria, Dependiendo de las necesi- dades experimentales, ls protoplastos pueden observar se con un microscopio de florescencia, sil gen foréneo tiene fusionada una proteina fluorescente, o también cuttivarse en un medio sdlido, para regenerar plantas. Poltilengicot La introduccién y expresién de ADN foréneo en protoplastos fue el primer método de trans- ferencia directa claramente demostrado en plantas, y esto se debié a que se disponia, para algunas especies, de procedimientos eficientes para regenerar las plantas a partir de protoplastos. Se basa en el hecho de que la pared celular es la principal barrera para introducir ADN, en las células vegetales, por lo que ésta tiene que ser temporalmente removida. La transformacién mediada por poliatilenglicol (PEG) es el método mas comiinmen- te usado. ElPec genera orficios en las membranas plas- rmaticas, lamados poros, debido a que altera la polaridad de la misma, y por ellos penetra el ADN fordneo. Electroporacién: Consiste en aplicar una cortiente eléctrica con un aparato llamado electroporador a una poblacién de protoplastos depositados en una celda, la alo septerive 20% clencia 69Comunicaciones libres cual presenta dos electrodos de aluminio localizados a tna distancia definida. El principio de este método con- siste on desestabilizareléctricamente la membrana ce- lular, generando agujeros transitorios en ella, lo que permite que el ADN viaje al interior de la célula. Microinyeccién: Este método de transfor- macién consiste en la introaduccién de ADN en el nicleo o citoplasma mediante tun microcapilar de inyeccién y un mi cromanipulador. Durante la introduc- cién del ADN en el nucleo, las células son inmovilizadas con una pipeta de sujecion y tuna pipeta de succién, La transformacién por este método es ampliamente utilizada en células grandes de animales. En células vegetales su aplicacién es complicada debido a que presentan tuna pared celular compuesta por lignina y celulosa y, como consecuencia, representa una barrera para las he- rramientas de vidrio utlizadas en microinyeccién. Sin ‘embargo, el uso de protoplastos para la transformacion vegetal pudiera ser adecuado para contrarrestar el efec- to de la pared celular. En este caso, se utiizan polime- ros de lisina 0 agarosa para fjar los protoplastos @ un soporte de vidrio. Aunque este método se puede apl- car a células vegetales desprovistas de su pared celular, no deja de ser un sistema poco usado y laborioso. Aplicacién de los protoplastos Eluso de los protoplastos como modelo en el area de la ciencia se debe a que, como se ha mencionado en las secciones anteriores, éstos no presentan pared celular y, por consiguiente, dejan expuesta a la mem- brana plasmética, la cual es blanco para iE #/ cualquier modificacién. Los protoplastos ‘se han aplicado en estudios de procesos de transporte y divisién celular, morfogénesis, mutagénesis, seleccién, transformacién genética por hibridacién o fusién somé- tica, ¢ introduccidn de ADN foréneo por métodos biolégicos y directos, entre otros (Cuadro 2). Sin embargo, tal vez las aplicaciones mas recientes de estas células sin pared sean en el estudio de meca- nismos de ARN (Acido ribonucleico) de interferencia y en el aislamiento de nucleos para la localizacién de metales téxicos, como cadmia y aluminio, entre atros. Conclusiones El cultivo de tejido vegetal fue desarrollado a par- tir de la investigacién de boténicos y fisidlogos vegeta- les y se ha convertide en una herramienta importante en la seleccién, el cruzamiento, el control de enferme- Cuadro 2. Aplicaciones del uso de los protoplastos en diferentes procesos celulares ‘thalana/Zea mays 2001 Elucidacion de los mecanismos de transducci6n de sefales en plantas a g > Brassica chinenss __-2003_—Estudios electrofsioligicos de canales de potasio lianthus annuus 2002 _Importe de un péptido sinético a través de la membrana plasmética Zhou Hordeum vulgare 2000 Comparacién de mecanismos de estrés entre plantas y células humanas cancerigenas Ding Nicotiana tabacum 2004 _ Regulaci6n del transporte de agua a través de las membranas celulares kira Vigna radiata 2004 Respuesta intracelular a sequlay salinidad Bart Ona sativa 2006 _Silenciamiento genético mediante siRNA (pequefios ARN interferentes) 3 i e ‘dades y la produccién en masa de cultivos agricolas, harticolas, forestales y frutales Desde que el investigador Klercker (1892) obtuvo por primera vez preparaciones crudas de protoplastos, hoy es posible obtenerlos a partir de cualquier parte de las plantas y cualquier especie. Estos sistemas celulares actualmente son utiizados como herramientas para rea- lizar estudios de localizacién de proteinas, de canales iénicos, y evaluacién de funcién de genes mediante ARN de interferencia demas, su aplicacién en la hibridacién somética puede permitir que diferentes especies de la misma fa- mia sean cruzadas. Esto normalmente es imposible siguiendo el proceso convencional de regeneracién se- ual de las plantas. Esta técnica se realiza mediante el cuttivo de los protoplastos de cada una de las especies de interés, su mezcla yla seleccién de aquellos que pre- sentan fusién. Mediante una cuidadosa seleccién y cuttivo, se padran regenerar pléntulas a partir de estos protoplastos hibridos, para evaluar sus caracteristicas deseables in vivo. Sin embargo, plantas como los cerea- les son recaleitrantes a la gran mayoria de los procesos de transformacién y de cuttivo, lo que he dificultado en cierta manera su mejora genética La obtencién de protoplastos, en teorfa, puede rea- lizarse en cualquier planta; no obstante, su cuttivo y conservacién son tediosos. Cuando los procesos de recalcitrancia sean superados en todas las especies vegetales, sera posible obtener plantulas a partir de protoplastos y, como consecuencia, intraducir 0 majo- rar las caracteristicas de interés Agradecimientos El trabajo desarrollado en el laboratorio de Ia Dra. Teresa Hemdndez Sotomayory la beca posdoctoral han sido apo- vyados por el proyecto de Conacyt (98352). Se agradece al M. C. José Armando Mufioz Sanchez por a revision cr tica de este trabajo y a la M. C. Gabriela Herrera por la edicién ortoipografica y gramatical + LQué son los protoplasto Wilberth Poot-Poot extudié Ia lcenciatura en la Facultad de Ingenieria Quimica (Universidad Auténoma de Yueatsn), [a maes- ‘rit en el sttuto Tecnolégico de Mérida, Yueatin ye! doctors do en el Centro de Investigacién Cientfea de Yueatin (cer, ‘Actualmente realza una estene'a posdoctoral en la Unidad de Bioguimca y Biologie Molecular de Plantas del cic. waflaco@yahoo comme Teresa Hernandez: somayor es profesora titular del cic, Tiene los grados de maestria y doctorado en investigaciin bio- médica bisa Ha publicado mis de 80 wabsjos en el dren de in de sefiles y ha formado recursos humanos a nivel de licenclatura, macstria y doctorado, Ee miembro del SN Su linea de invesigacin actual versa sobre los mecaniemes de trane- dducciin de seals en plantas en respuesta al extrés abistico, shseecicy me Lecturas recomendadas Bart, R., M. Chern, C. J. Park, L Bartley y P.C. Ronald (2006), “A Novel System for Gene Silencing using SIRNAS in Rice Leaf and StemDerived Protoplasts Plant Methods, 21-9, Cocking, EC. (1960), “A Method for Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles”, Nature, 187:962-963, Davey, M.R., P. Anthony, J.B. Powery K.C. Lowe (2008), “Plant Protoplasts: Status and Biotechnological Pers- ectives’, Biotechnology Advances, 23:131-171 Fosket, D. E. (1994), Plant Growth and Development. A ‘Molecular Approach, San Diego, California, Academic Press. George, EF, M.A. Hally G. J. de Klerk (2008), Plant Propagation by Tissue Cutture, 3° edicién, Springer Kercher, J. (1892), "Eine Method 2ur Isolierung lebender Protoplasten’, Ofvers. Vetensk Akad. Forh Stock, 49: 462.475, Ranirez-Benitez, J. E,, 8. M. T. Hemandez-Sotomayor y JA Mufioz-Sanchez (2009), “The Location of Alum rium in Protoplasts and Suspension Cells Taken from Coffea arabica L_ with Different Tolerance of Al’, Journal of Inorganic Biochemistry, 103:1491-1496, Somervil, C., 8. 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