SINTESIS MICORRICICA DE LACTARIUS DELICIOSUS FR.

Y PINUS SYLVESTRIS L.
P. ROYO
M. FERNANDEZ TOIRAN
C. R. FISCHER
Dpto. de Investigacin Forestal de Valonsadero
Apdo. 175. 42080 Soria (ESPAA)

RESUMEN
Se evala el crecimiento en diferentes medios de cultivo de las especies Boletus edulis Bull.: Fr., Lactarius
deliciosus Fr. y Suillus luteus (L.:Fr.) Gray. Los resultados no permiten determinar el medio nutritivo ptimo para
cada especie fngica estudiada debido a la existencia de interacciones significativas entre los factores cepa y medio
nutritivo. Se describen las micorrizas obtenidas en cultivo puro de Lactarius deliciosus Fr. y Pinus sylvestris L.
PALABRAS CLAVE: Ectomicorrizas
Pinus sylvestris
Lactarius deliciosus

INTRODUCCION
En la provincia de Soria (Espaa), las masas de Pinus sylvestris L. se encuentran localizadas fundamentalmente en la llamada Comarca de Pinares, situada en la parte septentrional del Sistema Ibrico, comprende la vertiente Sur de la Sierra de Urbin y parte de la
Sierra de la Umbra. Con una extensin aproximada de 57.000 ha, y situada entre los 1.000
y 2.000 m de altitud, se trata de una zona con una fuerte tradicin forestal, donde todos los
montes estn ordenados para la produccin de madera.
La explotacin de los recursos micolgicos de estos bosques es un hecho relativamente reciente pero que presenta una gran importancia econmica y social. Segn datos del
Registro de Industrias Agrarias de la Junta de Castilla y Len, existen siete empresas conserveras en la provincia que comercializan aproximadamente 4l7 t anuales de hongos procedentes exclusivamente de Soria. Entre las especies comercializadas destacan: Boletus
edulis Bull.: Fr. y B. pinophilus Pilt & Dermek, con 290 t anuales y con un precio que oscila entre las 600-1.000 pta/kg; Lactarius deliciosus Fr., 100 t anuales, con un precio que
oscila entre 100-500 pta/kg (Fernndez Toirn, 1994). Sealar que gran parte de las producciones recogidas en la provincia se distribuyen directamente o mediante intermediarios
a industrias o mercados fuera de sta, lo que hace que estas cifras sean muy superiores.
Recibido: 16-6-97
Aceptado para su publicacin: 15-1-98
Invest. Agr.: Sist. Recur. For. Vol. 7 (1 y 2), 1998

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P. ROYO et al.

Adems de la importancia econmica, los hongos micorrcicos presentan un elevado

inters ecolgico, reflejando el carcter y condiciones de los ecosistemas forestales. Todas
las actividades derivadas de la gestin forestal producen alteraciones en el suelo y en la
masa arbrea que pueden repercutir en su supervivencia y fructificacin. El empleo de
planta micorrizada en el sector forestal reviste un notable inters desde el punto de vista
tanto econmico como de salvaguardar el equilibrio biolgico de muchas reas forestales.
La posibilidad de producir especies micorrcicas de inters econmico puede aumentar el
inters de los propietarios privados por la reforestacin, de esta forma podran revalorizarse reas marginales actualmente abandonadas. Por otra parte, en un momento en que la
demanda de planta micorrizada con especies de inters comercial es alta, se hace imprescindible la caracterizacin de los principales tipos de micorrizas como base para un control
de calidad de esta planta.
Esta extraordinaria importancia, tanto econmica como ecolgica, indujo el inicio de
un proyecto cuyos objetivos son el seguimiento y cuantificacin de la productividad micolgica en masas forestales, as como la introduccin de planta micorrizada con especies de
inters comercial (proyecto INIA SC94-043-C3), donde se enmarca el trabajo que aqu se
presenta.
En una primera fase se obtuvo una coleccin de cultivos miceliares de distintas
especies para, posteriormente, llevar a cabo la sntesis de micorrizas, lo que permiti
realizar su descripcin anatmica y morfolgica. Estudios similares han sido desarrollados por diversos autores (Poitou et al., 1982, 1984; Meotto, Pellegrino, 1989;
Zucherelli, 1988).

MATERIAL Y METODOS
Caractersticas morfolgicas de las colonias y crecimiento en medio de cultivo
Para la obtencin de cultivos puros se sigui la metodologa propuesta por Molina,
Palmer (1982). Los carpforos de Boletus edulis, Lactarius deliciosus y Suillus luteus fueron recolectados en masas de Pinus sylvestris de la Comarca de Pinares. Los aislamientos
se realizaron en placas Petri que contenan 20 ml Modified Melin Nokrans (MMN) (Marx,
1969) y se incubaron a 23 C en condiciones de oscuridad. De cada especie se evaluaron
varias cepas: Boletus edulis (105, 130, 133, 158); Lactarius deliciosus (197, 198, 263, 274);
Suillus luteus (139, 140.2, 140.5, 146, 179).
Con el objeto de seleccionar el medio nutritivo ms adecuado para el cultivo de
cada cepa se evaluaron cinco medios: Agar-Malta 4 p. 100 (Poitou, 1978), MMN
(Marx, 1969), Oddoux-l (Poitou et al., 1981), PDA (Ferri, 1985) y Raper (Raper,
Raper, 1972). El diseo consisti en seis placas Petri por cada combinacin cepa/medio
nutritivo. En cada placa se midieron los dimetros de las colonias, con stos se calcul el rea de cada colonia. Para determinar el medio nutritivo ptimo los datos se sometieron a un anlisis de varianza, previa normalizacin de los datos de las especies
Boletus edulis y Lactarius deliciosus a travs de la transformacin logaritmo y raz
cuadrada, respectivamente. Para la comparacin de medias se utiliz el test LSD
(P<0,05). Se describen las caractersticas macroscpicas y microscpicas de las colonias de cada especie.

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Sntesis de micorrizas en cultivo puro

Para la sntesis asptica de ectomicorrizas se sigui el mtodo desarrollado por Molina
(1979, 1981) y Molina, Trappe (1982). Los inculos de Boletus edulis, Lactarius deliciosus y
Suillus luteus se obtuvieron a partir del margen de las colonias, que se transfirieron a tubos que
contenan 7 ml de MMN lquido y se incubaron durante 30 das a 23 C. Las semillas de Pinus
sylvestris se desinfectaron en superficie. Para ello se lavaron con agua corriente durante 24 h, se
sumergieron durante 30 min en H2O2 al 30 p. 100 en agitacin y, tras su lavado con agua estril, se sembraron aspticamente en viales que contenan 3 ml de una solucin de agar (l p. 100)
y malta (l p. 100). Las semillas se incubaron a temperatura ambiente hasta su germinacin.
La sntesis se realiz en tubos de vidrio (290x40 mm) que contenan un sustrato formado
por 110 ml de vermiculita (tamao partcula 2 mm) y 10 ml de turba (tamao partcula 1 mm),
humedecido con 70 ml de MMN lquido al que se le haba modificado su composicin reduciendo la cantidad de glucosa a 2,5 g/l. El conjunto fue autoclavado a 120 C durante 30 min.
La siembra e inoculacin de los tubos fue simultnea. Las plantas se mantuvieron a una
temperatura ambiente de 20-30 C y bajo un fotoperodo de 16 h con una luminancia de
11.000 lux, la temperatura radical se mantuvo a 18 C. Pasados seis meses se extrajeron las
plantas de los tubos de sntesis y se limpi el sistema radical sumergindolo en agua corriente, para posteriormente describir las caractersticas morfolgicas de las micorrizas. Se realizan cortes transversales y longitudinales de stas para describir el manto y la red de Hartig.

RESULTADOS
Caractersticas morfolgicas de las colonias y crecimiento en medio de cultivo
Las siguientes descripciones corresponden al aspecto presentado por las colonias en
medio MMN slido:
Boletus edulis: El borde de las colonias vara entre circular irregular a circular regular.
La forma de crecimiento es area, con una textura aterciopelada y ocasionalmente flocosa
en el centro. El color del micelio es blanco, tomando con la edad tonos marrones claros en
los bordes. Hifas de (2) 3-4 (5) m de dimetro, hialinas, presentan fbulas.
Lactarius deliciosus: El borde de la colonia vara de circular irregular a irregular. Textura
funiculada, algunas veces flocosa o plumosa en el centro. El color del micelio vara entre amarillo plido a amarillo rojizo, con matices verdosos; mrgenes hialinos y cordones funiculares
naranja plido o blanquecinos. Hifas de 3-4 m de dimetro, hialinas, no se observan fbulas.
Suillus luteus: Colonias con margen circular irregular, con textura algodonosa o aterciopelada. El micelio, de color blanco al principio, con la edad adquiere un aspecto zonado, con
tonalidades que oscilan entre el gris-rosceo al marrn-grisceo. En ocasiones, por debajo de
la colonia, aparecen ligeras hendiduras en el agar. Un total de cuatro de las cinco cepas evaluadas presentan exudados de color marrn oscuro. Hifas de 2-3 (5) m, hialinas, sin fbulas.
A continuacin, se presentan los valores de crecimiento de las distintas cepas en los
distintos medios de cultivo evaluados. Los resultados del anlisis de varianza indican que
no es posible determinar el medio nutritivo ptimo para cada especie debido a la existencia de interacciones significativas entre los factores cepa y medio nutritivo. Por ello, slo
se ha podido definir el medio ms adecuado para el cultivo de cada una de las cepas aisladas, cuyo resultados se pueden apreciar en las Figuras 1, 2 y 3.
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M
M

Ln (rea mm2)

A
O

R
O

O
R
A

3
A

1
0
105

130

133

158

CEPAS
R = Raper;

O = Oddoux;

M = MMN;

A = Agar-Malta;

P = PDA

Fig. [Link] medio e intervalo de confianza (P<0,05) para las distintas cepas de Boletus edulis
Mean value and confidence limit (P<0.05) for each strain of Boletus edulis

20

(Area mm2)1/2

15

A
A

P
R

10

R
P

P
A

R
M

197

198

263

O M

274

CEPAS
R = Raper;

O = Oddoux;

M = MMN;

A = Agar-Malta;

P = PDA

Fig. [Link] medio e intervalo de confianza (P<0,05) para las distintas cepas de Lactarius deliciosus
Mean value and confidence limit (P<0.05) for each strain of Lactarius deliciosus

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4.900
4.200

A
A

(Area mm2)

3.500

M
A

2.800

2.100

1.400

A P

O
M

140,2

140,5

700
0

139

146

179
CEPAS

R = Raper;

O = Oddoux;

M = MMN;

A = Agar-Malta;

P = PDA

Fig. [Link] medio e intervalo de confianza (P<0,05) para las distintas cepas de Suillus luteus
Mean value and confidence limit (P<0.05) for each strain of Suillus luteus

Sntesis de micorrizas en cultivo puro

De las tres especies evaluadas, slo Lactarius deliciosus demostr su capacidad de
formar ectomicorrizas en condiciones de cultivo puro. Estas presentan las siguientes caractersticas morfolgicas: ectomicorrizas monopodiales, bifurcadas o coraloides, de 2 a 4 mm
de longitud, distribuidas por todo el sistema radical, pero especialmente abundantes en la
parte superior (Fig. 4). Rodeando a la micorriza aparece una capa de aspecto gelatinoso formada por una densa red de hifas hialinas. Los rizomorfos, de color marrn rojizo y 120 m
de dimetro son poco frecuentes y estn formados por hifas apretadas similares a las del
manto, de 10 m de dimetro (Fig. 7). El manto es plectenquimatoso, de superficie suave,
reticulada en algunas ocasiones, de color pardo amarillento, a veces con tonalidades verdosas (Fig. 5), destaca la presencia de hifas laticferas (2-3 m de dimetro) y gotas de ltex
de color rojizo (Fig. 6). La red de Hartig penetra hasta la tercera capa de clulas del crtex
radical.
Con ninguna de las cepas de Boletus edulis o Suillus luteus se ha conseguido la sntesis de micorrizas. Las dos especies han presentado un crecimiento miceliar escaso en el sustrato. En el caso de Boletus edulis, al observar las races terciarias, en algunas se apreciaban formas monopodiales, engrosadas en el pice o bifurcadas, de color blanco grisceo,
pero al observar cortes transversales de stas no se observaba red de Hartig.

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Fig. [Link] de Lactarius deliciosus

Ectomycorrhizae of Lactarius deliciosus

Fig. [Link] del manto de una micorriza de Lactarius deliciosus

Surface view of mycorrhizal mantle of Lactarius deliciosus

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Fig. [Link] transversal. Hifas laticferas y gotas de ltex

Cross-section. Laticiferous hyphae and drops of latex

Fig. [Link] de Lactarius deliciosus

Rhizomorph of Lactarius deliciosus
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CONCLUSIONES
No es posible determinar el medio nutritivo ptimo para cada especie fngica estudiada al existir interacciones significativas entre los factores cepa y medio nutritivo. No obstante, la mayora de las cepas crecen adecuadamente en los medios de cultivo utilizados
como Agar-Malta 4 p. 100 o MMN. Oort (1981) estudi los requerimientos nutricionales
de distintas especies de Lactarius, concluyendo que las especies pertenecientes a la seccin
Dapetes crecen mejor en Baf (Oort, 1981).
El mtodo de sntesis utilizado permite la formacin de ectomicorrizas bien desarrolladas de Lactarius deliciosus y Pinus sylvestris. Ninguna de las cepas de Boletus
edulis y Suillus luteus form ectomicorrizas con Pinus sylvestris, a pesar de tratarse de
especies micorrcicas citadas para esta especie forestal (Trappe, 1962). La imposibilidad
de obtener micorrizas en cultivo puro con la especie Boletus edulis ha sido recogida por
otros autores (Pachlewski, Pachlewska, 1974; Pera, 1992). Sugiere este ltimo autor que
la falta de resultados positivos puede estar relacionada con el crecimiento extremadamente lento de estos hongos o con la edad de la planta; sin embargo, Zuccherelli (1988)
obtiene planta de Castanea sativa y de diferentes especies de Quercus micorrizadas con
esta especie fngica. La sntesis micorrcica de Suillus luteus ha sido obtenida por distintos autores (Torres, Honrubia, 1993; Pera, 1992). Los resultados negativos obtenidos
por nosotros con esta especie indican que las condiciones experimentales no eran las
adecuadas.
La falta de formacin de micorrizas en cultivo puro puede estar relacionada con la
edad de la planta (Pera, 1992; Torres, Honrubia, 1993), el lento crecimiento de los hongos, los niveles de fsforo, nitrgeno y glucosa del medio (Gibson, Deacon, 1990) o el
contenido hdrico del sustrato (Stenstrm, 1991). Segn Torres, Honrubia (1993), es
muy importante para conseguir la sntesis de ectomicorrizas conocer la fase de desarrollo idneo en el que las plantas deben ser inoculadas, de tal forma que, para que la
sntesis se lleve a cabo, las plntulas deben poseer o estar desarrollando races secundarias que son las que sern colonizadas por el hongo simbionte. En nuestro caso, el
trasplante y la inoculacin se realiz al mismo tiempo, por lo que tal vez la plntula no
haba desarrollado suficientemente su sistema radicular. Con los resultados obtenidos
y con las referencias citadas anteriormente, deducimos que se trata de especies poco
infectivas pero cuya sntesis micorrcica es posible modificando las condiciones experimentales.
SUMMARY
Ectomycorrhizal synthesis of Lactarius deliciosus Fr. and Pinus sylvestris L.
Several nutritive media were tested to select the optimal medium for the mycelial growth of Boletus edulis
Bull.: Fr., Lactarius deliciosus Fr., y Suillus luteus (L.: Fr.) Gray. The results show that it is not possible to determine the optimal nutritive medium for each species, because of the existence of a significant interaction between
the strain factor and the nutritive medium. Ectomycorrhizae of Lactarius deliciosus Fr. y Pinus sylvestris L. are
described.
KEY WORDS: Ectomycorrhizae
Pinus sylvestris
Lactarius deliciosus

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