PRCTICA 7:
RECUENTO
TOTAL DE
HONGOS Y
Microbiologa Agroindustrial
Paulino Ninaquispe
III.
MATERIALES
Lenteja
verde
(Muestra).
Tubos de ensayo.
Placas Petri.
Matraz.
Agar nutritivo.
Pipetas.
Solucin
salina
fisiolgica.
Rejilla.
Oxitetraciclina
(Capsula).
Marcador.
Asa Drigalsky.
Agua destilada.
Mecheros.
Autoclave.
Algodn y pabilo.
Cocina elctrica.
Balanza electrnica.
Estufa.
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Paulino Ninaquispe
IV.
MTODOS
PRIMERA PARTE.
Preparamos la cantidad de solucin de agar Nutritivo necesaria.
1000 ml65 gr
400 mlx
x=26 gr
Se dividi 400ml de agua destilada en dos matraces cada uno
con 200ml.
Luego diluimos 13 gr de agar en cada matraz con 200ml de
agua destilada.
Aseguramos la solucin de agar, con algodn y pabilo.
Llevamos a punto de ebullicin las dos soluciones y movemos la
muestra, para obtener una homogenizacin.
Luego llevamos a autoclave las soluciones de agar.
Primero dejamos las vlvulas abiertas hasta que salga vapor,
despus de eso cerramos las vlvulas y apretamos el botn
calentar, hasta que llegue a una temperatura de 121C (pasos
para usar la autoclave).
Finalmente sacamos las soluciones de agar y las dejamos
enfriar por un tiempo aproximado de 20min, evitando la
formacin de grumos.
Preparamos la solucin del antibitico de oxitetraciclina usando
una capsula para 100ml de agua destilada.
Luego
agregamos
10ml
de
solucin
del
antibitico
oxitetraciclina a cada matraz, para evitar el crecimiento de
bacterias.
Microbiologa Agroindustrial
Paulino Ninaquispe
Y las vertimos sobre 12 placas Petri, de manera cuidadosa,
siempre acompaando un mechero cerca para esterilizar la
zona de trabajo.
Solucin de
Agar Nutritivo.
Agregado de Agar
Nutritivo a las Placas
Placas Petri con
solucin de Agar
Nutritivo.
Solucin de
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SEGUNDA PARTE.
En un matraz agregamos 90ml de SSF y 10gr de muestra y
diluimos, esta sera nuestra primera dilucin de 10-1.
Y preparamos 12 tubos de ensayo con 9ml de SSF.
Y agregamos un 1ml de la primera dilucin a 3 tubos de ensayo,
a cada uno respectivamente. Y esta seria nuestra segunda
dilucin de 10-2.
Y luego realizamos el mismo paso para el segundo, tercer y
cuarto trio de tubos de ensayo. Obteniendo as las diluciones de
10-3, 10-4 y 10-5.
Luego de realizar las diluciones, sembramos por superficie con
el asa Drigalsky, en cada siembra introducimos el asa en
alcohol, y finalmente flameamos el asa y la dejamos enfriar, de
esta manera esterilizamos el asa para cada uso.
Las placas sembradas se incuban finalmente a temperatura
ambiente, pero envueltas en papel.
Solucin de la
Tubos de ensayo con
Solucin Salina
Fisiolgica.
Microbiologa Agroindustrial
Paulino Ninaquispe
Siembra por
superficie con el Asa
Drigalsky.
Incubacin a
Temperatura ambiente y
envueltas en papel.
NOTA: Todos los materiales usados (matraces, pipetas, placas
Petri) fueron esterilizados por calor seco, de tal manera que el
resultado de sta prctica de laboratorio sea la correcta y sin
ningn error.
V. RESULTADOS
RECUENTO DE COLONIAS POR DILUCIONEN PLACAS.
DILUCIONES/RECU
ENTO EN PLACAS
Placa N1
Placa N2
Placa N3
10-2
10-3
10-4
156
10-5
TOTAL DE COLONIAS POR DILUCIONEN PLACAS.
DILUCIONES/RECUEN
TO DE PLACAS
Placa
N1
Placa
N2
Placa
N3
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Paulino Ninaquispe
PROMEDIO
RECUENTO
DE
10-2
400gr/colonias
10-3
3000gr/colonias
10-4
156
533333,33gr/colo
nias
10-5
266666,66gr/colo
nias
a. Si las placas de 2 diluciones consecutivas presentan recuentos
menores de 30 y mayores que 300, tomar el promedio de los 2
recuentos.
b. Si el nmero de colonias de las placas de 2 diluciones
consecutivas estn dentro del rango 30-300 computar el
recuentro para cada una de las diluciones y establecer la
relacin de los 2 recuentos. Si el cociente es menor que 2,
reportar el promedio de los 2 valores, pero si el recuento mayor
contiene ms de 2, en este caso se reportara el recuento
menor.
VI. DISCUSIN
Segn Bossert y Kosson (1997)
El conteo de poblaciones microbianas por dilucin en placa es un mtodo
simple y rpido para la cuenta viable de clulas microbianas en el suelo. Sin
embargo, la cuenta obtenida es generalmente 10 a 100 veces menos que
aquella determinada por cuenta directa por microscopia.
En la prctica realizada, las razones para esta discrepancia incluyen los
errores ms frecuentes que se cometen, como por ejemplo: que durante la
realizacin de las diluciones no se logre separar perfectamente los
agregados bacterianos y ms de una bacteria forme una colonia, que el
personal que est trabajando no cumpla con los requerimientos necesarios,
que no se aplique una buena esterilizacin, que durante el recuento se
pueden producir dificultades ocasionadas por la carencia de uniformidad en
la extensin de los microorganismos, etc.
Segn Ramrez (1992)
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Paulino Ninaquispe
El mtodo de dilucin en placa se fundamenta en que cualquier clula
viable inoculada en un medio de cultivo se multiplica y produce datos de
fcil identificacin, como la formacin de colonias en placas de agar. Este
mtodo consiste en la preparacin de una serie de diluciones de una
muestra de suelo en un diluyente apropiado, esparciendo una alcuota de
una dilucin sobre la superficie de un medio de cultivo slido e incubando la
placa de agar bajo condiciones ambientales apropiadas. La dilucin debe
permitir generar colonias separadas, cada colonia puede proceder de una
sola clula o de una agrupacin (unidad viable), la cual se contar como una
bacteria. Bajo este fundamento, estas placas pueden ser usadas no slo
para el conteo de poblaciones microbianas, sino tambin para el aislamiento
de organismos.
En nuestro caso podemos afirmar que las diluciones son uno de los mejores
procesos a utilizar, siempre y cuando sea bien efectuado, ya que nos dio
resultados en un pequeo tiempo determinado.
Segn Edwards D. Nitroimidazoles (2003)
Para inhibir el crecimiento de las bacterias en los medios diseados
para el recuento de mohos y levaduras, en los ltimos 20 aos se han
utilizado con eficacia los antibiticos. Entre ellos puede citarse la
penicilina + estreptomicina, el cloranfenicol, la clorotetracilina, la
Oxitetraciclina y la gentamicina. Para fines generales, han
sido muy utilizadas la oxitetraciclina, que se refiere al a
clorotetracilina debido a su mayor estabilidad. La gentamicina
suprime el crecimiento de las bacterias Gran negativas y es efectiva
por ellos en alimentos tales como la carne refrigerada. Sin embargo,
tambin inhibe algunas levaduras.
En nuestra prctica realizada utilizamos el antibitico de
Oxitetraciclina, que dio buen resultado cumpliendo con su funcin de
inhibir el crecimiento de la carga bacteriana.
VII. CONCLUSIONES
Once de las doce placas Petri cultivadas no se encuentran en el rango
de 30-300 colonias, y el mximo que creci fue de 8 colonias y el
mnimo 1. Excepto la tercera placa con dilucin 10 -4 en la cual
crecieron 156 colonias, lo cual se encuentra en el rango.
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Con respecto a las diluciones, se deba obtener que por cada
dilucin que vaya en aumento, la cantidad de colonias por cada trio
de placas va disminuyendo, pero en nuestra prctica eso no sucede
y las cantidades de colonias no llevan un orden descendiente.
El uso del antibitico de oxitetraciclina, cumpli la funcin de inhibir el
crecimiento de bacterias.
La determinacin de mohos y levaduras en muy importante en la
industria alimenticias ya que estos son agentes que deterioran los
alimentos y causan prdidas materiales y monetarias.
VIII.
REFERENCIA
BIBLIOGRFICA
Bossert I. D. and Kosson D. S. 1997. Measurement of hydrocarbon
degradation in soils. In: Manual of environmental microbiology. C. J. Hurst, G.
R. Knudsen, M. J. McInerney, L. D. Stetzenbach, M. V. Walter (Eds). American
Society for Microbiology Press, pp. 738-752.
Edwards D. Nitroimidazoles. En: Finch RG, Greenwood D, Norrby SR, Whitley
RJ, editors. Antibiotic and chemotherapy. 8th ed. Philadelphia: Churchill
Livingstone, 2003; p. 385-92.
Ramrez (1992) Toxigenic Aspergillus Species. In: Food Microbiology.
Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M. Beuchat L. & Montville T.
(Eds.) ASM Press. USA. 451-465.
IX. ANEXOS
FORMULAS.
c. Tomar el promedio de los 3 recuentos de las placas y multiplicar
por el factor de dilucin utilizada.
Placa N x : N de colonias x factor de dilucion
Promedio de colonias=
Placa N 1+ Placa N 2+ Placa N 3
3
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Paulino Ninaquispe
DILUCION 10-2.
PlacaN 1 :8 x 102 = 800
PlacaN 2 : N 1 x 102 = 100
PlacaN 3 : N 3 x 102 = 300
Promediodecolonias=
800+100+300
=400 gr /colonias
3
DILUCION 10-3.
PlacaN 1 :4 x 103 = 4000
PlacaN 2 : N 3 x 103 = 3000
PlacaN 3 : N 2 x 103 = 2000
Promediodecolonias=
4000+3000+2000
=3000 gr /colonias
3
DILUCION 10-4.
PlacaN 1 :2 x 104 = 20000
PlacaN 2 : N 2 x 104 = 20000
PlacaN 3 : N 156 x 104 = 1560000
Promediodecolonias=
20000+ 20000+ 1560000
=533333,33 gr /colonias
3
DILUCION 10-5.
PlacaN 1 :6 x 105 = 600000
PlacaN 2 : N 1 x 105 = 100000
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Paulino Ninaquispe
PlacaN 3 : N 1 x 105 = 100000
Promediodecolonias=
600000+ 100000+ 100000
=266666,66 gr /colonias
3
TECNICA RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA EN
PROFUNDIDAD
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