PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS
Departamento de Gentica Molecular y Microbiologa
Laboratorio de bioqumica, biologa celular
BIO297E-2
Preparacin de bacterias competentes y transformacin por el mtodo del CaCl2
INFORME N4
Profesora
: Mara Estela Andrs
Instructora
: Marcela Gonzlez
Jefe de ayudantes
: Vernica Noches
Integrantes
: Brbara Arias
: Vera Maksaev
: Francisco Santander
: Max Santelices
21 de Abril de 2016
Santiago de Chile
1.- INTRODUCCIN
La transformacin bacteriana es un proceso en el que las bacterias pueden captar fragmentos
de DNA exgeno e integrarlos a sus propios cromosomas por recombinacin. La
transformacin ocurre naturalmente en algunos gneros de bacterias como Bacillus,
Haemophilus, Neisseria, Acinetobacter y algunas cepas de Streptococcus y Staphylococcus.
Cuando una bacteria receptora se encuentra en un estado fisiolgico apropiado para recibir el
DNA forneo se denomina competente (1).
Sin embargo, la competencia puede inducirse en bacterias usando soluciones de CaCl2 fras
(entre 0C y 4C para E. Coli) cuando estas se encuentran en una fase temprana de
crecimiento (fase logartmica). Aparentemente, el CaCl2 daa las paredes celulares (2)
facilitando que, despus, con un tratamiento de heat shock (el calentamiento de la muestra
repentino, de 42C para E. Coli) se altere la permeabilidad de la bacteria, de forma que esta
sea ms propensa a incorporar DNA externo (3).
El objetivo de inducir competencia es que la bacteria integre un plasmidio de inters. Los
plasmidios son trozos circulares de DNA de doble hebra; adems, son elementos
extracromosomales, o sea, pueden replicarse independientemente del cromosoma bacteriano
y suelen codificar para enzimas que brindan propiedades importantes para el crecimiento
bacteriano, como la resistencia a antibiticos o metales pesados. Al ser elementos
extracromosomales transmisibles entre las bacterias, se usan como vectores de clonacin (4).
Para amplificar un gen de inters en la bacteria, este se inserta en un plasmidio que confiere
resistencia a un antibitico: dicho plasmidio funcionar como un vector. Luego, al inducir la
competencia, las bacterias integrarn el plasmidio a su genoma y lo amplificarn. Las
ventajas del uso de plasmidios son su tamao pequeo y la facilidad con la que pueden
insertarse fragmentos de DNA; su origen de replicacin independiente; su circularidad, que
hace que el DNA se vuelva ms estable en la extraccin, y sus marcadores seleccionables ,
que permiten detectar mejor a las bacterias que lo incorporaron. Especficamente, al usar
plasmidios que confieren resistencia a antibiticos y cultivar las bacterias en un medio con el
antibitico al que confiere resistencia el plasmidio, se puede determinar fcilmente que las
bacterias que crecieron en ese medio (resistentes) son las que incorporaron el plasmidio.
Generalmente, todos los plasmidios usados en el laboratorio tienen un origen de replicacin
capaz de producir un gran nmero de clones, marcadores selectivos y un sitio de clonamiento
mltiple que tienen sitios de corte con enzimas de restriccin sumamente especficos (4).
Ms tarde el nivel de competencia logrado puede estimarse a partir del nmero de colonias de
bacteria que se produjeron por cada microgramo de DNA (en forma de plasmidio) agregado.
A mayor nmero de colonias, mayor es la eficiencia de transformacin (5).
El objetivo principal de inducir competencia es amplificar las secuencias insertadas en los
plasmidios. Posteriormente, y para poder estudiar esas secuencias, se hace una digestin con
enzimas de restriccin del DNA del plasmidio. El beneficio del sitio de clonacin mltiple
(en el que se insert el plasmidio) es justamente el nivel de especificidad de digestin que
puede lograrse. Normalmente, se usa la misma enzima de restriccin que se us en la
clonacin y as las secuencias deseadas son liberadas del plasmidio (4).
1.1.- OBJETIVOS:
-
Conocer en qu consiste la transformacin de bacterias
Conocer la importancia que tiene para una bacteria adquirir un plsmido foraneo
Aprender como convertir una bacteria no competencia en una competente
1.2.-MATERIALES Y MTODOS
Se utilizaron los materiales y mtodos sealados en la gua de laboratorio de bioqumica y
biologa celular (6). Se reemplaz bacteria E. coli DHa5 por E. coli TOP10.
2.- RESULTADOS:
Densidad celular:
La incorporacin de plsmidos en la tcnica utilizada se lleva a cabo en la fase logartmica de
crecimiento. Para obtener un cultivo en dicha fase se utiliz espectrofotometra para
determinar la densidad celular se calcul la absorbancia a 600 nanmetros hasta obtener un
densidad ptica entre 0,5 nm y 0,7 nm de absorbancia.
Tabla 1: Densidad celular
TIEMPO
(min)
DO(600nm) (nm)
0,183
30
0,297
60
0,509
75
0,630
Tabla 1. DO: Densidad ptica, nm: Nanmetros, Min: Minutos
Competencia:
Una vez obtenido un cultivo con la densidad celular deseada, se realizaron dos
centrifugaciones sucesivas, en la ltima se agreg CaCl2 para aumentar la permeabilidad de la
membrana y posteriormente un golpe de calor a 42C por 90 segundos. Luego se tomaron
100 uL de cultivos y se agregaron alcuotas de plsmidos, finalmente se siembran en LB-agar
con kanamicina.
Para calcular la competencia se debe realizar el siguiente cociente (10):
Competencia=
unidad formadora de coloni n as en placa
concentracin de ADN en placa
Tabla 2.: Cuantificacin de colonia
PLACA (plsmido)
COLONIAS
FD
UFC/ ug
COMPETENCIA
Control (sin plsmido)
100
Paca 1, 10 ng/uL
1080
100
1,1x105
1,1x104 ng DNA
Placa 2, 1 ng/uL
120
100
1,2x104
1,2x104 ng DNA
Tabla 2: UFC/ug: unidad formadora de colonias por miligramos, FD: factor de dilucin
Para determinar si estos valores son significativamente similares es recomendable realizar una prueba
T de Student para dos medias de medidas independientes, sin embargo esta medida no pudo ser
llevado a cabo por la naturaleza del muestreo, este consisti nicamente en contar un cuadrante al azar
multiplicar por 4, lo que no permite establecer medias ni desviacin estndar.
3.- DISCUSIN
Se nos indica en la gua que ocuparemos cepas competentes de E. coli DH5a: Ff80lacZDM15 D(lacZYA-argF)U169 deoR recA1 endA1 hsdR17 (rk - , mk + ) phoA supE44
thi-1 gyrA96 relA1 l la cual no se utiliza, sino que otra cepa la cual fue desconocida, de
todas maneras se pide averiguar lo que significa la jerga en base a nmeros letras y alfabeto
griego, estos son el genotipo de la bacteria inicial. Con esto podemos identificar los procesos
que ocurrirn y elegir de acuerdo a nuestras intenciones investigativas el mejor genotipo para
la bacteria, por ejemplo tenemos lacZ lo que significan que en el cromosoma bacteriano se
encuentra el gen que codifica para -D-galactosidasa, tenemos recA1 que es responsable de la
recombinacin del ADN, y as con todas las dems nomenclaturas. A pesar de no ocuparse
esa cepa en especfico, es importante conocer el genotipo para poder inferir un fenotipo y
establecer la mejor estrategia de investigacin.(7)
Para el crecimiento de fase logartmica de la bacteria se utiliza un Agar LB el que
corresponde a un Caldo Luria-Bertani. Este agar se caracteriza por ser uno de los medios ms
utilizados para el mantenimiento y cultivo de diferentes cepas recombinantes de E. coli, este
medio posee diversas frmulas adecuadas para cada cultivo, pero podemos diferenciar
elementos obligados como Triptona el cual entrega aminocidos esenciales y peptonas,
extracto de levaduras el cual enriquece con vitaminas y oligoelementos y finalmente NaCl el
cual entrega los iones de sodio necesarios para el transporte y equilibrio osmtico.(8) (9)
Una vez en cultivado se pide monitorear cada 30 minutos la densidad ptica dada por la
absorbancia a 600 nm como sale en la Tabla 1. Al llegar a los 60 minutos encontramos una
DO se 0,5nm siendo el ptimo entre 0,5nm y 0,7nm por lo que encontramos que entrando en
fase logartmica esperar 15 minutos aumentara lo suficiente para estar entre los rangos
pedidos de crecimiento de las bacterias en su mejor estado, lo que se ve llegando a los 0,630
nm de absorbancia. (11)
Luego de esto se procede a centrifugar para separar fracciones (laboratorios pasados) para
finalmente agregar el pelet en la solucin de CaCl 2 la cual estando en fro genera iones Ca +2
los cuales neutralizarn la repulsin entre las cargas negativas de los grupos fosfatos del ADN
y los fosfolpidos de la membrana celular, permitiendo la entrada del ADN en las clulas (12).
A pesar de ello la literatura es bastante contradictoria en los mtodos de entrada del plsmido
ya que pueden interactuar molecularmente poros o iones, concluyendo que an no se conoce
el mecanismo por el cual estos iones ayudan en la permeabilizacin de la bacteria. (9)
Luego de tener el tiempo de crecimiento suficiente se procedi a colocar 3 concentraciones
de plsmido como est explicado en la Tabla 2. Donde tenemos el control con 0 ng, otro con
1 ng y el tercero con 10 ng, para generar la entrada del plsmido y aumentar la fluidez de la
membrana se utiliza un choque de calor por una corta duracin de tiempo, esto permite la
entrada del ADN y la integracin del plsmido al cromosoma bacteriano.(9)A pesar de que
aumenta la permeabilidad de la membrana celular al ADN se desconoce por qu, se sabe que
la duracin del choque trmico es crtica para el proceso, por lo que se ha optimizado para el
tipo de bacteria y condiciones utilizadas.(12)
Segn la gua de pasos prcticos (6) se considera una pobre preparacin al orden de 1x10 4
colonias por ug de DNA. Se pudo apreciar que existe un efecto significativo en la
concentracin de plsmido en relacin a la formacin de colonias (ver Tabla 2) a diferencia
de otras cepas como E. coli JM109 donde la concentracin del plsmido no es significativo
en un medio de cultivo con LB con dimetilsufoxido, polietilenglicol y Mg2+. (9)
ANEXO
1.- Averige qu otros medios de transformacin bacteriana existen, compare con el mtodo
utilizado en el pasa prctico, resaltando ventajas y desventajas de las distintas tcnicas.
Otros medios de transformacin bacteriana son:
Mtodo con DEAE dextrano (diethyl aminoethyl dextrano), consta de un polmero catinico
derivado del dextran y su carga positiva le permite unirse a los enlaces aninicos fosfodiester
del ADN. Estos complejos formados entre el ADN y el dextrano mantienen su carga positiva,
lo que le permite unirse a la superficie de la clula cargada negativamente y pasa al interior
de la clula mediante endocitosis. Tiene como ventajas su sencillez, reproducibilidad y bajo
costo, adems de que se requiere de pocas cantidades de ADN. Entre sus desventajas se
puede sealar el nmero limitado de lneas celulares en las cuales se pueden obtener
resultados eficientes, ya que el DEAE es txico. El mtodo utilizado en el paso prctico no
tiene este problema de toxicidad, pero al utilizar centrifugacin el tamao y la calidad del
precipitado es crtico para el xito del proceso, que se ve afectado por factores tales como
pequeos cambios en el pH de la solucin.(13)
Mtodo de Lipofeccin, el cual se basa en la formacin de complejos entre lpidos catinicos
y ADN, llamados liposomas. Dicho complejo tiene afinidad por la membrana y permite la
entrada del ADN en el citosol. Es fcilmente reproducible y se describe tanto para expresin
transitoria como estable, resultando la expresin estable 5-100 veces ms eficiente, que por el
resto de los mtodos descritos anteriormente. Las desventajas del mtodo son, aparte del
elevado precio de los lpidos, el hecho de que no todos los lpidos funcionan en todos los
tipos celulares, y que hay que optimizar el ensayo para cada tipo celular.(13)
2.- Cul es el mecanismo que confiere resistencia a la kanamicina?
El ms importante es la inactivacin enzimtica, en donde diversas enzimas pueden inactivar
estos antibiticos por accin a distintos niveles. As, pueden acetilar, adenilar o fosforilar, por
intermedio de acetiltransferasas, adeniltransferasas y fosfotransferasas. La inactivacin
enzimtica se produce en el proceso de transporte del antibitico hacia el interior de la clula
para alcanzar el ribosoma. La resistencia a cada aminoglucsido es el resultado del balance
entre dos velocidades: la de captacin intracelular y la de inactivacin enzimtica. La
velocidad de inactivacin depende de la afinidad de la enzima por el antibitico. (14)
3.-Cul es el mecanismo que confiere resistencia a la ampicilina? Qu son las colonias
satlites y porqu se producen?
La hidrlisis enzimtica es el mecanismo que confiere resistencia a ampicilina. Este implica
la inactivacin de los betalactmicos como consecuencia de la accin de enzimas que reciben
el nombre de betalactamasas, y es el principal mecanismo de resistencia a betalactmicos.
Estas enzimas son un claro ejemplo de la plasticidad de la gentica bacteriana.(14)
Las colonias satlites son diminutas colonias que crecen en torno a una colonia resistente a
los antibiticos, cuando se ha incubado la muestra por aproximadamente 16 hrs. Estas se
producen porque la colonia resistente a los antibiticos libera enzimas que degradan el
antibitico y por lo tanto beneficia a las bacterias circundantes.(15)
4.- BIBLIOGRAFA
(1) Introduccin a la microbiologa, Gerard J. Tortora, Berdell R. Funke, Christine L. Case, Ed.
Panamericana, 2007, p. 241-242
(2) An Introduction to Molecular Biotechnology, Wink. M, John Wiley & Sons, 2006, p. 221.
(3)
Microbiology:Application Based Approach, Pelczar, M.J, Tata McGraw-Hill Education,
2010, p. 374.
(4)
Prcticas de biologa molecular, Puerta, C & Urea, C., Pontificia Universidad Javeriana,
2005, p.31-32.
(5) Gentica molecular bacteriana, Jimnez, A. Reverte, 1982, p.77
(6)Laboratorio de bioqumica y biologa celular. Andrs M.E. (2016). Pontificia universidad
catlica de Chile, Pgs. 35-37
(7)
Thermo Fisher Scientific Inc. Instructivo del uso de Genotypes of Competent Cells,
Genotypes of Invitrogen. Catalog no. 18265-017, Mxico, 2015.
(8) Bertani, G. (s.f.). CALDO LURIA MEDIO DE CULTIVO, Bacteriologa General Catlogo
1236, DIBICO S.A. DE C.V. MEXICO, D.F.
(9)
Chan, W. T., Verma, C. S., Lane, D. P., & Gan, S. K. E. (2013). A comparison and
optimization of methods and factors affecting the transformation of Escherichia coli.
Bioscience reports, 33(6), e00086.
(10) Kit de transformacin bacteriana con pGLO (2016) Biotechnology Explorer Nmero de
catlogo 166-0003EDU.
(11) Rojas, T., & Castillo, Z. (2003). Supervivencia de un aislado de Escherichia coli 0157: H7
en jugos de naranja no pasteurizados de expendio comercial. Rev. Soc. Venez. Microbiol,
23(1), 16-20.
(12) Kischinevzky, C. A. S. (2005). Manual de Prcticas Biologa Molecular de la Clula L.
UNAM.
(13) Gonzlez M,. Vega A.(2007)Cmo superar la membrana celular?. Scielo, v.29 n.1
(14) Snchez J.S., (2006) Resistencia a antibiticos, Revista latinoamericana de microbiologa,
Vol. 48, N. 2
15) Esko J.D. y Raetz C.r. (1998). Replica plating and in situ enzymatic assay of animal cell
colonies established on filter paper. vol. 75 N.3
