ANTIBIOGRAMA
DETERMINACIN DE LA SENSIBILIDAD
DE LAS BACTERIAS A LOS
ANTIBIOTICOS (ANTIBIOGRAMA)
Los antibiogramas son mtodos in vitro que
determinan
la
susceptibilidad
de
los
microorganismos a una variedad de agentes
antimicrobianos, bajo condiciones de laboratorio
especficas y estandarizadas
Estndar de McFarland
Los estndares de turbidez de McFarland se usan como
referencia en suspensiones bacteriolgicas para saber el
nmero de bacterias por mililitro, o ms bien en UFC
(unidades formadoras de colonias) segn una escala que
va de 0.5 a 10.
Escala de McFarland
Estos estndares son creados al mezclar soluciones de cloruro
de bario con cido sulfrico en volmenes especficos, los
cuales forman precipitado de sulfato de bario suspendido
La finalidad, es establecer una relacin entre
precipitacin qumica y una suspensin bacteriana
una
Ventaja: realizar suspensiones bacterianas ajustadas a un
patrn
Desventaja : no discrimina a las bacterias vivas de las muertas
en la solucin, por lo que se puede sobreestimar la poblacin
de bacterias.
Escala de McFarland
Los patrones de Mc farland se utilizan como patrones de
turbidez en la preparacin de suspensiones de
microorganismos.
El patrn 0.5 de Mc Farland tiene una aplicacin especial
en la preparacin de inculos bacterianos para
realizacin de pruebas de sensibilidad antimicrobianas.
La realizacin de este tipo de pruebas requieren requieren
el uso de inculos estndar. El patrn 0.5 se emplea para
la preparacin de inculos en diluciones de agar
estandarizado.
La densidad del patrn de turbidez se comprueba
mediante el empleo del espectrofotmetro. La absorcin
a 625 nm debe ser de 0.08 a 0.10.
Preparacin del inculo
Mtodo del medio de cultivo
lquido:
Coger de 3 a 5 colonias iguales
de la placa de cultivo de 18 a
24 horas y sembrarlas en 5 ml
de un medio lquido(BrainHeart, Tripticasa soja, etc.) e
incubar en la estufa a 35C
durante 2 a 6 horas hasta
conseguir o superar una
turbidez del 0.5 de la escala de
MacFarland. Si la turbidez es
superior se realiza el ajuste
necesario con suero salino
estril.
Preparacin del inculo
Mtodo de suspensin directa de colonias:
A partir de una placa de cultivo de 18 a 24
horas coger varias colonias y ajustar el inculo
a una turbidez equivalente al 0.5 de la escala
de MacFarland 0.5 en suero fisiolgico. Agitar
durante 15-20 segundos.
Concentracin inhibitoria
mnima (CIM)
Medida directa de la susceptibilidad
del microorganismo para un
antibitico en particular.
Un antibitico se considera activo
frente a una bacteria cuando inhibe
su multiplicacin.
La actividad del antimicrobiano se
evala in vitro determinando la
concentracin mnima inhibitoria,
que es la mnima concentracin de
antibitico
que
inhibe
al
microorganismo.
Agar Mueller-Hinton
Este medio de cultivo ha sido recomendado
universalmente para la prueba de sensibilidad a los
antimicrobianos.
Se usa en forma rutinaria para la realizacin del
antibiograma en medio slido, debido a una serie de
factores que se detallan a continuacin:
Presenta buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas
de sensibilidad.
No contiene no contiene timina o timidina, que son
inhibidores de sulfamidas y del trimetoprim.
La mayora de los patgenos crece satisfactoriamente y una
gran cantidad de datos han sido evaluados y avalados
usando este medio de cultivo.
Agar Mueller-Hinton
Clasificacin
En el laboratorio, podemos utilizar dos grandes opciones para
ejecutar pruebas que detecten la susceptibilidad y/o resistencia
de las bacterias frente a los antimicrobianos:
1. Mtodos de difusin
- Mtodo de Kirby-Bauer
- Mtodo del E Test (epsiln test)
2. Mtodos de dilucin
- Mtodo de la Macrodilucin
- Mtodo de la Microdilucin
Mtodo de difusin
Difusin disco-placa (Kirby-Bauer)
Mtodo muy usado por su
sencillez para el estudio de
sensibilidad de las bacterias.
El antibiograma disco-placa
consiste en depositar, en la
superficie de agar de una placa
de Petri previamente inoculada
con el microorganismo, discos
de papel secante impregnados
con los diferentes antibiticos.
Entrega un resultado cualitativo.
Tan pronto el disco
impregnado
de
antibitico se pone en
contacto
con
la
superficie hmeda del
agar, el filtro absorbe
agua y el antibitico
difunde al agar.
El antibitico difunde
radialmente a travs del
espesor del agar a partir
del disco formndose un
gradiente
de
concentracin.
Difusin disco-placa
(Kirby-Bauer)
Se incuba a 37C por 18 horas.
El microorganismo crece en la placa ,
pero alrededor del disco se forman
halos de inhibicin dependiendo de la
sensibilidad de la bacteria frente al
antibitico.
R: resistente
I:Intermedia
S: sensible
Interpretacin Resultados
Comparando los dimetros del halo de inhibicin con las
CMIs, y estableciendo las correspondientes rectas de
regresin, se han fijado unos criterios para clasificar las
cepas estudiadas. De esta forma se han fijado tres
categoras: sensible (S), intermedia (I) y resistentes(R).
Anteriormente se aada la categora moderadamente
sensible (MS) que tiende a eliminarse y los resultados
correspondientes a la misma se han situado en la
categora de intermedia.
Las interpretaciones seguirn ciertas normas pero, por regla
general, un dimetro de inhibicin de 30 a 35 mm es
indicativo de una cepa altamente sensible, mientras que
dimetros de zona de inhibicin inferiores a 15 mm son los
que presentan las cepas resistentes.
Sensible indica que la infeccin ocasionada por la cepa
para la que se ha determinado la CMI o su correspondiente
halo de inhibicin puede tratarse de forma adecuada
empleando las dosis habituales de antimicrobiano, en
funcin del tipo de infeccin y de la especie considerada.
Intermedio indica que el halo de inhbicin traducido en
valores de CMI se aproxima a las concentraciones de
antimicrobiano alcanzables en sangre o tejidos y que puede
esperarse eficacia clnica en aquellas localizaciones en las
que se alcanzan altas concentraciones de antimicrobiano
(p. ej. orina) o cuando se emplean dosis ms elevadas de lo
habitual.
Resistente se refiere a aquellos microorganismos que no se
inhiben por las concentraciones habitualmente alcanzadas
en sangre/tejidos del correspondiente antimicrobiano, o a
aquellos microorganismos en los que existen mecanismos de
resistencias especficos para el agente estudiado en los que
no ha habido una adecuada respuesta clnica cuando se ha
usado como tratamiento el correspondiente antimicrobiano.
Mtodo del E Test
(epsiln test)
El principio de este mtodo es una expansin de la tcnica de difusin
en disco. En el mtodo E-test (AB Biodisk, Suecia) podemos, mediante
lectura directa, determinar la concentracin inhibitoria mnima (CMI).
Consiste en una tira de plstico no poroso de 6 cm de largo por 5 mm de
ancho que incorpora un gradiente predefinido de antimicrobiano
equivalente a 15 diluciones.
Mtodos de dilucin
Las tcnicas de dilucin en caldo o agar, se pueden
utilizar para medir cuantitativamente la actividad "in vitro"
de un antimicrobiano frente a un cultivo bacteriano.
Es decir entrega un resultado cuantitativo, ya que permite
determinar la concentracin mnima inhibitoria.
Estos mtodos se basan en la determinacin del
crecimiento del microorganismo en presencia de
concentraciones crecientes del antimicrobiano, que se
encuentra diluido en el medio de cultivo (caldo o agar).
Es un mtodo complejo y de coste alto.
Mtodo de la Macrodilucin
Esta metodologa es muy engorrosa, por la cantidad de
material y de manipulaciones necesarias para su realizacin.
Mtodo de Macrodilucin en medio lquido (caldo)
Metodo de Macrodilicion en medio slido (agar)
Dilucin en agar
En este mtodo se incorpora el antimicrobiano a evaluar a un
medio con agar. El antimicrobiano se aade cuando el medio
an est fundido. Para lograr el rango de dilucin deseado se
prepara una serie de placas, cada una con una determinada
concentracin de antimicrobiano.
Las placas se inoculan una vez que se haya solidificado el
medio de cultivo.
Dilucin en caldo
Se recomienda para la mayora de los microorganismos utilizar
caldo Mueller-Hinton
En esta tcnica se debe preparar una serie de tubos con una
cantidad de determinada de medio de cultivo en cada uno,
a los que se incorpora una cantidad de antibitico creciente
de modo que se obtenga concentraciones dobles
progresivas.
Posteriormente se siembra la bacteria en los tubos, se incuba ,
y a las 18-24 horas se observa el crecimiento.
Tubos con cantidad
creciente de antibioticos
Se podr ver que el caldo
esta transparente en los tubos
donde
hay
mayor
concentracin de antibitico
porque el crecimiento de la
bacteria ha sido inhibido,
pero que existe crecimiento
en los tubos con menor
concentracin de antibitico
El
tubo
con
menor
concentracin de antibitico
que ha inhibido la bacteria
indica la CIM
ATB
Tubo control
(sin
antibitico)
Mtodo de la Microdilucin
Este
mtodo
utiliza
placas
de
microtitulacin
(micromtodo).
Las placas de microdilucin con
diferentes
concentraciones de antimicrobianos se pueden
preparar en el propio laboratorio o bien se pueden
comprar a diferentes compaas que los suministran
congelados, deshidratados o liofilizados.
La tcnica de microdilucion es de gran utilidad practica
para el estudio de la CIM.
No es mas que la tcnica dilucin en medio lquido,
sealada anteriormente, pero realizada en placas de
poliestireno, con micropocillos en lugar de tubos.
Los pocillos de cada columna contiene concentraciones
crecientes de un antibitico en forma de suspensin
liofilizada o desecada, por lo que solo debe aadirse el
medio de cultivo liquido en el que se ha efectuado la
suspensin de la bacteria a estudiar ( generalmente
alrededor de 200 uL de medio por pocillo)
Tras la incubacin se determina la CIM.
Como en la macrodilucion la CIM se lleva a una tabla
que seale si el microorganismo es sensible o resistente.
Placa de
microtitulacin
Existen paneles comercializados, que permiten detectar la
CIM por tcnica de dilucin en caldo, los pocillos de cada
columna
contienen
,
de
arriba
hacia
abajo,
concentraciones decrecientes de antibiticos (cada
columna corresponde a un antibiticos diferente)
Puede observarse el crecimiento y la inhibicin en los
diferentes pocillos .
La CIM de cada columna de antimicrobiano es la del pocillo
con menor cantidad de antibitico que inhibe la bacteria.
ANTIBIOGRAMA
