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Universidad Autnoma de Quertaro || Facultad de Qumica || Ingeniera en
Biotecnologa
PRACTICA 4
TRANSFORMACION BACTERIANA CON EL
PLASMIDO pGLO
Delgado Snchez Luis Felipe1, Hernndez Rojas Albo Josu2, Prez Prez Carlos Alberto3.
Universidad Autnoma de Quertaro 26 de febrero del 2016. Santiago de Quertaro,
Quertaro.
RESUMEN:
PALABRAS CLAVE:
ABSTRACT:
KEYWORDS:
Ingeniera en Biotecnologa
4tr SemestreLaboratorio de Biologa Molecular
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Biotecnologa
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1. INTRODUCCIN
La transformacin gentica ocurre cuando
una clula capta y expresa una nueva
porcin de material gentico (ADN). Esta
nueva informacin gentica suele
proporcionar al organismo una nueva
caracterstica que es identificable despus
de la transformacin. Transformacin
gentica significa literalmente cambio
causado por genes, e implica la insercin
de uno o ms genes en un organismo, con
el objetivo de modificar las caractersticas
de dicho organismo.
La transformacin gentica se usa en
muchas reas de la biotecnologa. En
agricultura, se pueden introducir en las
plantas, por transformacin, los genes que
codifican
caractersticas
como
la
resistencia al fro, a los pesticidas o a la
sequa. En biodegradacin, las bacterias
se pueden transformar con genes que las
hagan capaces de digerir los vertidos
accidentales de petrleo. En medicina, las
enfermedades originadas por genes
defectuosos se estn empezando a tratar
con terapia gnica, mediante la
transformacin de las clulas del paciente
con copias del gen que carecen de la
anomala que produce la enfermedad.
Los genes se pueden obtener de ADN de
humanos, animales o de plantas, e
introducirse en las bacterias. En las
condiciones adecuadas, esas bacterias
pueden producir autntica insulina
humana, la cual se puede usar para tratar
a los pacientes con diabetes, una
enfermedad gentica en la que los genes
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responsables de producir insulina no
funcionan correctamente.
En esta prctica se realiz un
procedimiento
denominado
transformacin gentica. Se us un
protocolo para transformar bacterias con
un gen que codifica una protena
denominada GFP (Green Fluorescent
Protein). La fuente natural de este gen es
una medusa fosforescente llamada
Aequorea victoria, en el cual la GFP es la
responsable de que la medusa brille o
emita fluorescencia en la oscuridad.
Despus de la transformacin, las
bacterias expresaron el gen de la medusa
y sintetizaron la protena, lo que les
permiti emitir un color verde brillante
cuando son expuestas a luz ultravioleta.
El plsmido pGLO de BioRad contiene el
gen para la sntesis de la protena GFP y
un gen de resistencia al antibitico
ampicilina. pGLO tambin contiene un
sistema especial de regulacin de genes
que se puede usar para controlar la
expresin de la protena fluorescente en
las clulas transformadas. El gen para
sintetizar GFP se puede activar en las
clulas
transformadas
simplemente
aadiendo arabinosa al medio de cultivo.
La seleccin de las clulas que se han
transformado con el plsmido pGLO se
realiz observando el crecimiento en
placas con antibitico. Las clulas
transformadas
aparecern
blancas
(fenotipo salvaje) en placas que no
contengan arabinosa, y de color verde
fluorescente cuando se aada arabinosa al
agar.
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2. METODOLOGIA
Se dej que solidificaran las cajas y se
refrigeraron.
2.1 Preparacin de medios
Las placas de agar se prepararon con 1
semana de antelacin antes de realizar la
transfeccin.
Se deben etiquetar 4 cajas de la siguiente
manera:
1.
2.
3.
4.
LB/amp +pGLO
LB/amp/ara + pGLO
LB/amp/-pGLO
LB - pGLO
Se prepararon 250 mL de agar LB estril
(BioRad) al 4% de agar. Una vez disuelto
y esterilizado el medio, se dej que se
enfriara hasta que fuera posible tocarlo
sin quemarse (50C aproximadamente).
(Esta cantidad de agar se realiz para 3
equipos). As que la manera de realizar las
cajeras fue la siguiente:
1. Primero se vaco el agar LB en las
cajas que se marcaron como LB
-pGLO y se dejaron que
solidificaron.
2. Luego se vacio agar en las cajas
marcadas como LB/amp/+pGLO y
LB/amp/-pGLO, y se les agrego
1mL de ampicilina (30mg/L)
mientras todava estaban liquidas
y se mezclaron.
3. Por ltimo, se vacio el medio
sobrante en las cajas que estn
marcadas como LB/amp/ara +
pGLO y a estas se les agregaro
1mL de ampicilina (30 mg/mL) y
100L de arabinosa (200 mg/mL)
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2.2 Transfeccin de plsmido
Se rotularon 2 tubos Eppendorf con
+pGLO y otro con -pGLO y a cada uno se
le agrego lo siguiente; 250L de CaCl2, a
cada tubo se le agregaron 10L de
Escherichia coli, por ultimo al tubo
+pGLO se le agrego 4L del plsmido
pGLO.
Se cerraron los tubos y se incubaron en
hielo por 10 minutos, despues se realizo
un choque termino al transferir los tubos a
un bao de agua caliente a 42C/50s. Se
pasaron inmediatamente al hielo y se
incubaron por 2 min, pasado el tiempo se
le agregaron 250 L de Caldo LB en cada
tubo y se incubaron por 10 min a
temperatura ambiente.
De los tubos se tomaron 100L y se
vaciaron a las respectivas cajas, los tubos
con +pGLO con las cajas que tienen
+pGLO y los tubos con -pGLO con las
cajas que tienen -pGLO. Una vez vaciado
los 100L de los tubos, con un asa esteril
se extienden por la superficie de la placa
con movimientos de izquierda a derecha.
Se incubaron a 37C. Los cajas se
observaron bajo luz normal y luz UV.
3. RESULTADOS Y DISCUSION
CONCLUSIONES
4. BIBLIOGRAFIA
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