OBJETIVO
Desarrollar la metodologa del ensayo de EUG en condiciones alcalinas
pH > 13, en leucocitos humanos en G0, tratados n vitro con algn
frmaco de efecto genotxico conocido.
INTRODUCCIN
El ADN est compuesto por grupos fosfato y desoxirribosa que es un
azcar unidos a bases nitrogenadas como adenina, timina, citosina y
guanina. Existen diversos agentes que pueden causar dao al ADN como
agentes qumicos, rayos X y radiacin solar, en esta ltima se encuentra
presente la radiacin ultravioleta el dao que produce en el ADN
consiste en la introduccin de enlaces covalentes entre dos timinas
adyacentes dando como resultado un dimero de pirimidina.
Otros tipos de dao que puede sufrir el ADN son el rompimiento de la
cadena, modificacin de bases, uniones cruzadas ADN-ADN y ADNPROTEINA. Los compuestos genotoxicos ocasionan rompimiento en el
ADN induciendo a la apoptosis.
Asimismo las clulas tambin cuentan con mecanismos de reparacin
del ADN daado, estos de pueden dividir de manera general en
reparacin directa donde simplemente se elimina el dao y la reparacin
por escisin que se inicia con una enzima que reconoce alteraciones de
las bases o la estructura habitual de ADN, tras el reconocimiento se da la
escisin de la secuencia donde se encuentran las bases daadas.
Un mtodo para detectar el dao en el ADN es la electroforesis en gel de
una sola clula mejor conocido como ensayo cometa este detecta los
rompimientos en las cadenas de ADN y los sitios lbiles a los lcalis
midiendo la migracin de ncleos de ADN inmovilizados. El ensayo
consiste en que las clulas situadas sobre el gel de agarosa se lisan con
detergentes y alta concentracin de sal para formar nucleoides que
contienen asas sper enrolladas de ADN unidas a la matriz nuclear,
cuando estos nulcleoides se someten a electroforesis a un pH alcalino
se forman estructuras muy similares a los cometas que se pueden
observar por microscopia de fluorescencia y medirse para determinar el
grado de dao considerando que la longitud de la cola del cometa en
relacin al ncleo refleja el nmero de rompimientos en la molcula de
ADN.
Entre las ventajas de realizar el ensayo cometa se encuentran el Ensayo
Cometa se distingue por una demostrada sensibilidad para detectar
bajos niveles de dao al DNA, Rpida realizacin, Un anlisis de los
datos a nivel de clulas individuales, Requerir un pequeo tamao de
muestra, Flexibilidad y bajo costo y es aplicable a cualquier poblacin de
clulas eucariotas.
La tcnica de ensayo cometa se fundamenta en que la corriente
elctrica arrastra al ADN presente en el gel desde el ncleo en direccin
al nodo y se generan las imgenes caractersticas de un cometa.
MTODO
Se mezcla la
muestra con
agarosa de bajo
punto de fusin
y se coloca otra
capa sobre la
laminilla.
Preparar las
laminillas con un
capa de agarosa
regular.
Se realiza la
tincin con
bromuro de
etidio y se hace
el analisis de
100 nucleos.
Se adiciona la
solucin de lisis
por una hora a 4
o
C.
Se produce el
desenrollamient
o en solucin
buffer pH=13
durante 20
minutos.
Se realiza la
electroforesis a
20 minutos a 25
volts. lavado con
buffer pH 7.5
RESULTADOS
Tabla 1. Tamao de ncleos y colas.
Ncleo
m
Cola m
Ncleo
m
Cola m
10
12
10
10
10
12
12
10
10
26
14
12
20
12
16
16
4
14
2
20
18
40
24
18
Ncleo
m
Cola m
18
20
16
28
24
26
28
16
12
18
Ncleo
m
Cola m
16
14
20
18
10
20
16
12
14
22
Ncleo
m
Cola m
20
17.5
20
25
17.5
15
22.5
12.5
20
27.5
7.5
Tabla 2. RESULTADOS ESTADISTICOS
Ncleos
x
S
cv
16.79
5.34
31.81
Colas
x
S
cv
13.68
12.96
94.75
ANALISIS DE LOS RESULTADOS
De las 50 clulas observadas 8 presentaron cometas por lo que se puede
decir que en dichas celular hubo un dao en el ADN aunque este es muy
variable pues el coeficiente variacin resulto ser muy elevado de 94.75
esto indica que el dao se present en proporciones diferentes entre las
distintas celulas. en promedio la longitud de las colar fue de 13.68 m.
Algunas clulas resultaron con un dao muy severo en su ADN pues el
tamao de sus colas sobrepasaba al de los ncleos tal fue el caso de tres
clulas presentndose mayor dao en una donde el ncleo midi 14 m
y la cola 40 m.
CONCLUSIN
Se logr producir dao de ADN en los leucocitos de un persona por
medio de exposicin a un agente genotxico , el dao de pudo observar
por medio de ensayo cometa por electroforesis unicelular alcalina en
microscopio de fluorescencia. La longitud de la cola del cometa es
proporcional al grado de dao que sufri el ADN del leucocito.
REFERENCIAS
Pierce A. Fundamentos de gentica conceptos y relaciones.
Argentina: Medica panamericana, 2011.
Solari A. Gentica humana fundamentos y aplicaciones en
medicina. Mxico: medica panamericana, 2013.
EVALUACIN POR ENSAYO COMETA DE DAO CELULAR
INDUCIDO CON PERXIDO DE HIDRGENO A
LINFOCITOS DE SANGRE PERIFRICA IN VITRO Camacho
Banda G. S. (1); Morn Martnez J. (2); Betancourt
Martnez N. D. (2); Monreal de Luna K. D. (2) ; Bentez
Muos M. A. (3) (1)Facultad de Qumica, Universidad
Autnoma de Quertaro.
UNIVERSIDAD NACIONAL
AUTONOMA DE MEXICO.
FACULTAD DE ESTUDIOS
SUPERIORES ZARAGOZA.
LABORATORIO DE GENTICA
CLNICA.
ENSAYO COMETA .
De la Rosa Rivas Maria de Lourdes.
Espinosa Medina Isabel.
Fln Ayala Aline Esther.
Jimnez Respardo Antonio Everardo.
Equipo 11
Semestre 2016-2
