Dual-Bioaumentacin estrategia para mejorar la Remediacin de suelos contaminados

T. M. ROANE, * K. L. Josephson, e I. L. PIMIENTA

Departamento de Suelos, Agua y Ciencias Ambientales de la Universidad de Arizona,
Tucson, Arizona 85721 Recibido el 6 de noviembre de 2000 / Accepted 1 de mayo de de 2001
Aunque se cree que los metales para inhibir la capacidad de los microorganismos para degradar contaminantes
orgnicos, varios Se sabe que existen mecanismos microbianos de resistencia a metal. Este estudio examin el
potencial de microorganismos resistentes a cadmio para reducir los niveles de cadmio solubles para aumentar la
degradacin de 2,4-diclorofenoxiactico cido (2,4-D) en condiciones de cocontamination. Cuatro
microorganismos del suelo cadmio resistente fueron examinados en este estudio. Resistente hasta una
concentracin de cadmio de 275 Captulos 21 mg, estos aislados representado a la Arthrobacter comn del suelo,
Bacillus y Pseudomonas. Los aislados de Pseudomonas sp. Tensin H1 y Bacillus sp. cepa H9 tena un
mecanismo intracelular dependiente del plsmido de desintoxicacin cadmio, la reduccin de los niveles de
cadmio solubles en un 36%. Los aislados cepa de Arthrobacter D9 y Pseudomonas cepa I1a tanto producido una
capa de polmero extracelular que une y reduce los niveles de cadmio solubles en un 22 y un 11%,
respectivamente. Aunque ninguno de los aislamientos resistentes a cadmio podra degradar 2,4-D, los resultados
de doble bioaumentacin estudios realizados tanto con cultivo puro y microcosmos del suelo de laboratorio
mostraron que cada uno de cuatro
aislamientos cadmio resistente apoyaron la degradacin de 500-mg ML21 2,4-D por el cadmio sensible 2,4-D
degradador Ralstonia eutropha JMP134. La degradacin se produjo en presencia de hasta 24 mg de cadmio
ML21 en cultivo puro y hasta 60 mg de cadmio en el microcosmos g21 suelo enmendado. En un estudio de
campo experimental llevado a cabo con biorreactores de suelo de 5 galones, se evalu de nuevo la estrategia de
doble bioaumentacin. Aqu, el cadmiumresistant aislar Pseudomonas cepa H1 degradacin mejorada de 2,4-D
en los reactores inoculados con R. eutropha JMP134 en presencia de 60 mg de g21 cadmio. En general, dual
bioaumentacin parece ser un viable enfoque en la remediacin de suelos cocontaminated. Cocontaminated
suelos, suelos contaminados con metales tanto y los compuestos orgnicos, se consideran difciles de remediar
debido
la naturaleza mixta de los contaminantes. Una alternativa de tratamiento a la excavacin caro y la incineracin
(9) de metal contaminado con suelos es bioaumentacin con el metal-desintoxicante y / o microorganismos que
degradan orgnicos (1, 3, 4, 6, 18). Muchos microorganismos son conocidos para degradar una variedad de
compuestos orgnicos, y
Del mismo modo, un nmero de microorganismos resistentes de metal son conocidos para desintoxicar los
metales, como el selenio, mercurio y cadmio (23, 27). En los sitios cocontaminated, inhibe la toxicidad de
metales la actividad de los microorganismos que degradan orgnicos (24). Por consiguiente, biorremediacin
esfuerzos se centran en la reduccin de la toxicidad de metales en sitios con contaminantes mixtos. Hasta hace
poco, la bioaumentacin Los estudios se centraron en la introduccin de una microorganismo que era a la vez un
metal resistente y capaz de degradacin orgnica. En condiciones de campo, este enfoque es a menudo sin xito.
Una razn puede ser que los requisitos de energa para mantener la resistencia a metales concurrente y orgnica
la degradacin son demasiado altos, y el organismo introducido no puede realizar ambas actividades en
condiciones ambientales.
El tema de la cocontamination es grave, ya aproximadamente el 37% de todos los sitios contaminados en los
Estados Unidos solamente contienen tanto metales y contaminantes orgnicos (20; W. W. Kovalich, Jr.,
conferencia magistral, cuarto Mundial Congr. Chem.
Eng., P. 281-295, 1991).
El enfoque utilizado en este estudio fue coinoculate con una poblacin-desintoxicante de metal y una poblacin
orgnico degradantes que forma cooperativa funcionado para remediar tanto metlicas y los contaminantes
orgnicos en un sistema cocontaminated. La hiptesis que la poblacin resistente de metal podra proteger la
poblacin sensible de metal orgnico de degradacin a partir de metal toxicidad. Stephen et al. (27) que se
utilizan bacterias resistentes de metal a proteger el suelo indgena b-subgrupo proteobacterium amoniaco
oxidantes. Metales, entre ellos el cadmio, el plomo y el mercurio, son, en la mayora casos, microcida; sin
embargo, algunas bacterias han desarrollado la capacidad para resistir y desintoxicar estos metales.
desintoxicacin de metales estrategias, incluyendo los de cadmio, pueden incluir metales el secuestro y la

precipitacin (2, 10, 14, 26), que reducen las concentraciones de metales solubles. A diferencia de los orgnicos,
metales no puede degradarse, y por lo tanto la mayora de los enfoques de remediacin biolgica de metales
confiar en la desintoxicacin y la inmovilizacin de la metales tanto para reducir la toxicidad biolgica y para
retrasar el metal transporte. El objetivo de este estudio fue determinar la eficacia de dual bioaumentacin con el
metal-orgnico desintoxicante y degradadora
bacterias para facilitar la degradacin orgnica dentro cocontaminated sistemas. Este objetivo fue examinado en
coamended Los estudios de soluciones, en suelos cocontaminated en el laboratorio, y en un experimento de
campo piloto. Cuatro diferentes cadmio resistente
aislados bacterianos que no degradan 2,4-diclorofenoxiactico cido (2,4-D) se ensayaron para determinar la
capacidad de permitir la degradacin del 2,4-D a ocurrir en la presencia de niveles txicos de cadmio, utilizando
Ralstonia eutropha JMP134 como el degradador de 2,4-D.

ATERIALES Y MTODOS
Cepas bacterianas. Cuatro bacterias del suelo altamente resistente cadmio fueron elegidos para este estudio:
Arthrobacter sp. D9 cepa Bacillus sp. colar H9, Pseudomonas sp. cepa H1, y Pseudomonas sp. cepa I1a (Tabla
1). El aislamiento y la caracterizacin de estas cepas han sido descritos por Roane y Pepper (22). cadmio
bacterias resistentes se cultivaron en un medio de sales minerales definido (HSH) modificado con cadmio
solubles como CdCl2 en concentraciones 0-45 Captulos 21 mg para representar las concentraciones observadas
en los sitios contaminados. el MSM contena lo siguiente: 0,5 g de citrato de sodio (C6H5Na3O7), 0,1 g de
magnesio sulfato (z 7H2O MgSO4-), 1,0 g de sulfato de amonio [(NH4) 2SO4], 1,0 g de glucosa (C6H12O6), y
0,1 g de pirofosfato de sodio [Na4P2O7 (H2O) 10], tamponado a pH 6,0 con ftalato de potasio (KHC8H4O4). En
la biodegradacin 2,4-D estudios, un MSM modificada se utiliz en el que la glucosa se reemplaz con 500 mg
de 2,4-D ML21, y cido 2-etanosulfnico [N-morfolino] (C6H13NO4S) sustituido ftalato de potasio, que
interfera con el 2,4-D las lecturas de absorbancia.
Todo el cultivo posterior se llev a cabo en 25 ml de MSM modificadas con cadmio
y se incubaron a 28 C en un agitador rotatorio a 180 rpm. El nivel de resistencia mxima (MRL) se defini
como la concentracin ms alta de cadmio en los que al menos 104 clulas cultivables ML21 se mantuvieron
despus de 48 h a partir de una inoculacin inicial de 106 clulas ML21. El LMR de cadmio refleja la grado de
resistencia al cadmio. Se determinaron las concentraciones de cadmio el uso de un espectrofotmetro de
absorcin atmica de llama despus de la centrifugacin en 10000 3 g por 20 min y la filtracin de la muestra
con un filtro de 0,2 mm de tamao de poro. Ralstonia eutropha JMP134 (anteriormente Alcaligenes eutrophus
JMP134) contiene el 80-kb PJP4 plsmido que codifica para la degradacin de 2,4-D a 3-oxoadipate (13). La
degradacin de cido succnico est parcialmente mediada por cromosmicamente enzimas codificadas (19, 25,
28).
experimento destino cadmio. Despus de la inoculacin individuo con cada uno de los aislamientos, cualquier
reduccin en la cantidad de cadmio soluble en el caldo era medido usando absorcin atmica. Por lo tanto,
cualquier reduccin en cadmio biodisponible debido a las interacciones microbianas especficas podran ser

evaluados. En matraces replicados, cada aislado fue crecido en 25 ml de caldo de MSM durante 48 horas a 28 C
en varios cadmio niveles de hasta el LMR. Precipit y se recogi cadmio asociado a clulas Despus de
centrifugar a 10 000 3 g durante 20 min y se acidific con HCl 1 N a solubilizar el cadmio. Una evaluacin
microscpica inicial se realiz para confirmar la lisis celular tras la acidificacin. Tanto el sobrenadante y la
clula acidifica la suspensin se examinaron para el cadmio. Mecanismo de resistencia al cadmio. (I) Deteccin
del opern Cad. Cebadores desarrollado por Endo y plata (7) se utilizaron para detectar el opern cad, que
codifica para una bomba de eflujo de cadmio. El ADN cromosmico fue extrado por medio de celular directa
lisis a 98 C. El procedimiento de lisis alcalina de Kado y Liu (12) se utiliz para aislar y purificar ADN
[Link] PCR con temperaturas de recocido paso que van desde 54 hasta los 67 C se utiliz para
amplificar las secuencias diana en extractos de clulas lisadas y del plsmido DNA. El primer concentracin
usada fue 7,7 pmoles por reaccin. productos de PCR se corrieron en un gel de agarosa Tris-borato-EDTA-1,2%
a 100 V CM21, se tieron con bromuro de etidio (1 mg Captulos 21), y se observa bajo luz UV.
(Ii) Produccin de polmeros extracelulares. Muchos microorganismos tienen extracelular
capas polimricas que confieren resistencia a metales. Estas capas polimricas son de naturaleza aninica y por
lo tanto atraen y secuestran metales catinicos. El rpido mtodo de cribado desarrollado por Liu et al. (17) se
utiliz para detectar la cadmiumresistant aislamientos para la produccin de dos exopolisacridos bacterianos
(EPSS), succinoglicano o galactoglucon (EPS II). El mtodo se basa en el diferencial tincin de polmero que
producen frente a organismos no polimricos que producen. (Iii) TEM. Se utiliz microscopa electrnica de
transmisin (TEM) para evaluar morfolgica cambios en respuesta a la exposicin al cadmio. Las bacterias (1,5
ml) cultivadas en MSM (pH 6,0) que contiene 20 mg de cadmio ML21 para Pseudomonas cepa I1a y
Arthrobacter cepa D9 y 125 mg de cadmio para ML21 cepa de Pseudomonas H1 y cepa de Bacillus H9 fueron
cosechadas durante el crecimiento logartmico por granulacin a 14.000 g durante 3 min 2. Las clulas se
enjuagaron en agua desionizada estril y se fijaron en 3% de glutaraldehdo en tampn de cacodilato 0,1 M, pH
6,0, saturado con oxina (Sigma Inc.), utilizando la fijacin de microondas (8, 16) para minimizar la lixiviacin de
cadmio asociada con la fijacin tradicional. Oxina reacciona especficamente con metales pesados, aumentando
el contraste bajo el TEM (30) de afirmacin visual de los depsitos de metal. Las clulas se fijaron
posteriormente en 2% de osmio en tampn cacodilato 0,1 M, pH 6,0. Siguiendo la fijacin, las clulas se
deshidrataron usando un gradiente de grado reactivo etanol-H2O en cada concentracin: 30, 50, 70, 95, 100, 100,
y 100% (11). Las clulas se infiltraron con resina Spurr a concentraciones de 50% y despus 100% (Ted Pella
Inc., Redding, Calif.). Las muestras se polimerizan durante la noche a 70 C, delgada seccionada con un RCM
MT-7000 microtomo (Research Manufacturing Corp., Tucson, Ariz.), Y vistos a 60 kV con un TEM Philips 420
(Philips Electron Optics Inc., Mahwah, N. J.). acumulacin de cadmio se confirm usando Noran Voyager Series
II X3 elemental espectroscopia de dispersin (Noran Instruments, Inc., Middleton, Wisc.). (Iv) los perfiles de
plsmido y curado. Dado que la resistencia del metal se puede plsmido codificado, los cuatro aislamientos
fueron examinados para la presencia de plsmidos que van en tamao de 2,6 a 350 MDa despus de la
incubacin en presencia de 3 o 12 mg de ML21 cadmio en funcin del nivel de resistencia de la cepa aislada.
extracciones de plsmido usado el procedimiento de lisis alcalina de Kado y Liu (12). aislamientos resistentes a
cadmio que contienen plsmidos fueron curados de sus plsmidos el uso de aumento de la temperatura y un
medio no selectivo. Los aislados se sometieron cuatro transferencias sucesivas (0,1 ml de aislamientos en 25 ml
de caldo nutriente) en caldo (Difco, Baltimore, Md.) que no contiene cadmio, eliminando de este modo
cualquier posible presin de seleccin. Los aislamientos fueron incubadas a 37 C en una rotativa agitador a 180
rpm. extracciones plsmido se realizaron al final de las cuatro transferencias. "Curado" aislados fueron entonces
reinoculado en HSH con y sin cadmio estrs volver a evaluar el LMR de cada aislamiento al cadmio. Los
estudios de degradacin. R. eutropha JMP134 era cadmio sensible en este estudio en el que a niveles superiores a
3 mg de cadmio ML21, no hay clulas viables R. eutropha fueron detectados (, 102 clulas ML21 a partir de un
inculo inicial de 104 clulas ML21). Nota, sin embargo, que la sensibilidad de cadmio es la concentracin
inoculante dependiente, y concentraciones de clulas muy altas de R. eutropha JMP134 son ms tolerantes
cadmio (K. L. Josephson, comunicacin personal). Dado que la degradacin es a menudo inhibida en la
presencia de metal (s), la capacidad de los aislados resistentes a cadmio para apoyar Se examin la degradacin
de 2,4-D de R. eutropha JMP134. La degradacin de 2,4-D por R. eutropha JMP134 fue controlado en la
presencia de varios de cadmio los niveles de la inoculacin con uno de los aislados de cadmio-resistente.
Concentraciones de 2,4-D en los extractos de cultivo se midieron cada 24 horas a 230 nm siguiente

centrifugacin a 14.000 3 g durante 2 minutos para eliminar los desechos celulares. La relacin entre la
concentracin de 2,4-D y su absorbancia a 230 nm era lineal, con y un valor de 2 0.03x 0.07 (r2 5 0,991). (I)
Cultivo puro. En experimentos con cultivos puros de rplica, 25 ml de MSM tamponadas a pH 6,0 con cido 2etanosulfnico [morfolino] (Sigma Inc.) fue modificado con 500 mg de 2,4-D ML21 y, o bien 12 o 24 mg de
cadmio ML21 dependiendo en el LMR de cada aislado individual. Cada frasco de cultivo se inocul con 104
CFU de cualquiera de las cepas Arthrobacter aislado de cadmio resistente a D9, Pseudomonas la cepa H1,
Bacillus H9 cepa, cepa o Pseudomonas I1a Captulos 21 y se incubaron a 28 C durante 48 horas a 180 rpm. (Ii)
microcosmos del suelo. Una vez establecido en cultivo puro, las capacidades de xito aislamientos para proteger
R. eutropha JMP134 se examinaron de la toxicidad del cadmio en artificialmente suelo de metal contaminados.
Para determinar si la degradacin de 2,4-D podra se facilitar en el suelo contaminado con cadmio, 100 g de una
Brazito no contaminada suelo franco arenoso fue modificada, con 1% (p / p) de glucosa, 500 mg de ML21 2,4-D,
y 60 mg de cadmio ML21 (concentraciones finales). La glucosa se utiliza como un fcilmente fuente de carbono
metabolizable para apoyar a las poblaciones de cadmio-resistente. Suelo microcosmos (500 ml frascos de boca
ancha de polipropileno) se incubaron a 28 C y se mantiene a 14% (peso / peso) de humedad del suelo (75% de
capacidad de campo). Similar a la pura experimentos de cultivo, cada microcosmos suelo se inocul con una de
las cadmio aislados resistentes (104 UFC G21) mediante la inclusin de la cepa con la inicial modificacin de
humedad (a la capacidad de campo 75%) seguido de una mezcla de suelo vigorosa. Tras una incubacin de 48 h,
microcosmos apropiadas se inocularon con 104 UFC de R. eutropha JMP134 g21, de nuevo en relacin con la
enmienda a la humedad. microcosmos de control consistieron en suelo modificado con glucosa, 2,4-D, y cadmio
sin inculos y el suelo modificado con glucosa, 2,4-D, y el cadmio inoculado con solamente un aislado de
cadmio-resistentes o R. eutropha JMP134. Las concentraciones de 2,4-D en extractos de suelo se midieron
diariamente para un total de 50 das. Uno a diez suelos fangosos se realizaron utilizando 0,1% (peso / vol) de
pirofosfato de sodio para neutralizar la carga de partculas de suelo, se centrifug a 14.000 3 g durante 10 min, y
leer espectrofotomtricamente a 230 nm. Las muestras se analizaron por duplicado, y el experimento
microcosmos del suelo se realiz tres veces. Las muestras de suelo sin 2,4-D se utilizaron como espacios en
blanco para restar la absorbancia de fondo, que era, 1% de la absorbancia total. (Iii) biorreactores de campo. Los
estudios de laboratorio microcosmos del suelo con el aislado Pseudomonas H1 cepa se repitieron en un nivel
intermedio a escala de campo (otra aislamientos no fueron examinados a escala de campo). Se eligi la cepa
Pseudomonas H1 debido a su resistencia de cadmio (a una concentracin de 225 mg ML21) y culturability. El H9
aislado de la cepa de Bacillus no fue examinado a pesar de que era tambin altamente resistente (a una
concentracin de 275 mg ML21), a fin de evitar complicaciones que resulta de la formacin de esporas.
Biorreactores se establecieron bajo un campo condiciones para confirmar los resultados de microcosmos de
laboratorio. Se inici el estudio de campo en junio de 1998 y concluy en septiembre de 1998.
biorreactores de cinco galones de polipropileno (45,7 por 76,2 cm), que se encuentra en la Universidad de la
Estacin Agrcola de Arizona Campbell Avenue, Tucson, se colocaron en virtud de un rea sombreada construido
de manera que se evite la luz solar directa, ya que durante el da las temperaturas fueron rutinariamente en exceso
de 37,8 C (100 F). Cada reactor contena aproximadamente 27 kg de arena arcillosa Brazito a 14% (peso /
peso) contenido de humedad modificado con 500 mg de 2,4-D g21 y / o 60 mg de g21 cadmio. La Pseudomonas
sp. aislado de la cepa H1 y el 2,4-D eutropha degradador R. JMP134 eran inoculado en 104 CFU g (peso seco)
de soil21. Inoculantes y enmiendas del suelo se mezclaron a fondo en el suelo utilizando una mezclador de
cemento (se aclar con etanol al 70% entre tratamientos) antes del inicio de el experimento mientras que
proporciona un perodo de incubacin de 48 h entre la inoculacin con Pseudomonas H1 tensin y la adicin de
R. eutropha JMP134. Tratos se crearon con el fin de reducir al mnimo la contaminacin cruzada entre las
enmiendas, por ejemplo, 2,4-D-nicos tratamientos seguidos por tratamientos de 2,4-D-plus-cadmio seguidos por
2,4-D-ms-R. eutropha seguido de Pseudomonas H1 cepa y as sucesivamente. Hubo 7 tratamientos (ver Tabla
4), cada uno con dos repeticiones, para un total de 14 biorreactores. La humedad del suelo se mantuvo a 14%
(peso / peso) en todo el experimento. Temperatura ambiente vari de 16,7 C (62 F) a 48,9 C (120 F).
muestras de suelo (45 por 2,5 cm) se recogieron semanalmente y analizaron las concentraciones de 2,4-D.
absorbancia de fondo a 230 nm se control en los reactores sin enmienda 2,4-D y se rest de cada muestra de
lectura de 2,4-D. A eliminar la contaminacin cruzada, el extractor suelo fue desinfectada con leja al 10%
Despus de cada toma de muestra. Cultivables microorganismos 2,4-D-degradantes se enumeraron en una eosina
azul de metileno (EMB) desarrollado por medio DiGiovanni et al. (5). La acidez producida durante la

degradacin de 2,4-D caus la eosina azul para teir la colonia morado oscuro. Estudios previos en nuestro
laboratorio han confirmado que el color prpura aparicin de colonias es indicativo de la degradacin de 2,4-D
(5). Algunos de los aislados a partir del medio EMB se rastrearon adems para identificar posibles
transconjugantes. El proceso de seleccin incluy la realizacin de intragenic enterobacterias
consenso PCR para huellas genmicas (29) y PCR para amplificar el gen tfdB encontrado en PJP4 (5), un perfil
de plsmido para detectar la 80-kb PJP4 (12), y el anlisis de la degradacin de 2,4-D usando cromatografa de
lquidos de alta presin o espectroscopia a 230 nm. Comparacin de los resultados del proceso de seleccin de
los con R. eutropha JMP134 permitido enumeracin transconjugante.
RESULTADOS
La resistencia al cadmio. Como se resume en la Tabla 1, los cuatro los aislados eran resistentes a una amplia
gama de concentraciones de cadmio, de 20 a 275 mg ML21. Slo H1 cepa de Pseudomonas y la cepa de Bacillus
H9 tena plsmidos, de 18,5 y 10,4 kb, respectivamente. Al plsmido curado, ni H1 ni H9 se mantuvo cadmio
resistentes, y eran incapaces de crecer en el presencia de 125 mg de ML21 cadmio (niveles de aproximadamente
la mitad de los LMR), respectivamente. El opern Cad no era identificado en cualquiera de los aislados.
mecanismos observados de resistencia cadmio incluyen extracelular y el secuestro intracelular. extracelular de
unin de cadmio fue observado con la cepa Arthrobacter D9 y cepa de Pseudomonas I1a (datos mostrados para
I1a; Fig. 1a yb). Despus de la produccin de EPS en la cepa de Pseudomonas aislado era I1a confirmado con la
tincin, la respuesta del aislado de 20 mg de ML21 cadmio se observ bajo el TEM. el secuestro de cadmio por
la capa de EPS fue evidente como un precipitado oscuro
que rodea las clulas (Fig. 1b).
Por el contrario, la acumulacin intracelular de cadmio en Pseudomonas H1 cepa y cepa de Bacillus culturas H9
fue observados (datos de H1 se muestra; Fig. 1C y D). Para Pseudomonas cepa H1, bajo TEM y en presencia de
125 mg de cadmio ML21, grandes acumulaciones intracelulares de cadmio fueron confirmados con EDS (Fig.
1d). Tambin hubo un aumento en la densidad celular indicativa de la unin a cadmio no especfica las celdas.
Los controles negativos incluyeron clulas cultivadas en ausencia de cadmio. El efecto del crecimiento
bacteriano y la resistencia del metal sobre el cadmio Tambin se examin la solubilidad en un experimento de
destino cadmio (Tabla 2). La cantidad de cadmio presente en la solucin disminuido con aislamientos I1a, D9,
H1, H9 y con el crecimiento de 104 a 108 CFU ML21. Las disminuciones ms dramticas en los niveles de
cadmio solubles fueron vistos con Pseudomonas H1 tensin y Cepa de Bacillus H9, tal que un promedio de 36%
se perdi con crecimiento. El crecimiento de la cepa Arthrobacter D9 y Pseudomonas I1a cepa result en el 22 y
el 11% disminuye en cadmio solubles.
Sobre la base de los controles con metal y sin inculos, 0,99% de el total de cadmio permaneci soluble. Los
estudios de degradacin. Se realizaron varios experimentos para determinar el mtodo de coinoculacin. Se
encontr que si una poblacin de cadmio resistente y R. eutropha JMP134 eran coinoculado al mismo tiempo, no
se produjo degradacin y R. eutropha JMP134 no era recuperable. El mismo resultado se si se encuentra R.
eutropha JMP134 se inocul 24 h despus de la poblacin cadmio resistente se aadi a la cadmio medio de
cultivo de 2,4-D. Sin embargo, despus de 48 h despus de la inoculacin
con una poblacin de cadmio-resistentes, los frascos de cultivo inoculado con 104 UFC de R. eutropha JMP134
ML21 lo demostr degradacin. A la biomasa de inoculacin pequeo se utiliz tanto en el cultivo puro y los
experimentos de suelo para evaluar las capacidades de las poblaciones inoculadas crezcan y se realizan bajo
contaminada y, en el suelo, las condiciones no estriles. Aumento con una biomasa ms pequeo en escenarios de
campo puede ser deseable. Tambin se encontr que las clulas .105 ML21 "artificialmente" disminuy niveles
de de metal soluble debido a una mayor unin celular. Para que la degradacin de 2,4-D-cadmio sensible a
ocurrir en la presencia de cadmio, las concentraciones de cadmio biodisponibles tuvo que ser desintoxicado. Las
habilidades de los cuatro cadmio suelos resistentes aislados, D9 cepa de Arthrobacter, Pseudomonas la cepa H1,
Bacillus H9 cepa y cepa Pseudomonas I1a (Tabla 1), para desintoxicar cadmio tal que JMP134 R. eutropha
podra degradar ML21 500 mg de 2,4-D se determin por primera vez en el caldo (Figura 2). Los experimentos
demostraron que 104 CFU de R. eutropha JMP134 ML21 solo en la presencia de .3 mg de cadmio ML21 no
degradar 2,4-D, presumiblemente a causa de la toxicidad del cadmio. Adems, ninguno de los aislados de cadmio
resistente podra degrada 2,4-D (datos no mostrados). En consecuencia, la doble-bio- enfoque de aumento se
examin inicialmente con caldo de MSM modificado con 500 mg de ML21 2,4-D y cadmio, en el que el caldo
contaminado se inocul con 104 CFU de un cadmio resistente ML21 aislar, se incubaron durante 48 horas a 28

C, y luego reinoculado con 104 UFC de R. eutropha JMP134 ml 21. completa degradacin 2,4-D por R. eutropha
JMP134 se produjo en presencia de 12 mg de cadmio ML21 con el cadmio resistente aislar Pseudomonas cepa
I1a y 24 mg de cadmio con ML21 el cadmio-aislados resistentes Arthrobacter cepa D9, Bacillus H9 cepa, y
Pseudomonas H1 cepa. Curiosamente, cuando los niveles de cadmio soluble tras el crecimiento de cada uno de
los aislados resistentes a cadmio analizada en la Tabla 2 fueron examinados, pareca que los niveles de
solubilidad cadmio segua siendo demasiado alto como para soportar la degradacin de 2,4-D por R. eutropha
JMP134. Puede que haya habido adicional mecanismos de desintoxicacin no identificados que el cadmio
no redujo las concentraciones de cadmio solubles pero que rinden el cadmio no txico, como se ve con
quelacin. El suelo no contaminado utilizado en el microcosmos del suelo laboratorio era un suelo franco
arenoso con arcilla Brazito 12%, 0,21% orgnico materia, pH 8,2, y no se conoce ningn exposicin a metales
anterior. Indgena el nmero de microbios en el suelo fueron de 3,2 3 107 6 9,1 3 106 cultivables g21 UFC de
peso seco en medio R2A (Difco, Baltimore, Md.) Y 7,2 3 107 6 3,2 3 106 clulas totales de g21 peso seco,
determinado por microscpico directo de naranja de acridina nmero de reproducciones. En el microcosmos del
suelo de laboratorio, las cepas resistentes a cadmio Pseudomonas cepa H1, la cepa de Bacillus H9, Arthrobacter
cepa D9, y Pseudomonas cepa I1a aparecieron para desintoxicar cadmio, protegiendo de esta manera R. eutropha
JMP134 de cadmio toxicidad como la degradacin del 2,4-D se produjo en presencia de 60 mg de cadmio G21.
cadmio Soluble no era detectable en los suelos enmendados; Sin embargo, los efectos de toxicidad de cadmio
eran observado en los suelos contaminados como R. eutropha JMP134
se inhibi la degradacin de 2,4-D. Tabla 3 resume la especfica las tasas de degradacin para cada aislamiento.
Dentro de 50 das, el cadmio resistentes a Pseudomonas cepas H1 y I1a permitido la degradacin completa de
500 mg de 2,4-D ML21. Tras la adicin H9 de la cepa de Bacillus cadmio resistente y Arthrobacter cepa D9, la
degradacin se produjo dentro de los 35 das. Curiosamente, ni la flora microbiana indgena ni el cadmio
resistente aislados podran degradar 2,4-D en el cadmio contaminado sistema del suelo dentro del plazo de 50
das. Bajo la condiciones de este experimento, R. eutropha JMP134 tampoco lo hizo degradar el 2,4-D cuando
estaba presente el cadmio. En el suelo Brazito modificada solamente con 2,4-D, completa degradacin 2,4-D por
R. eutropha JMP134 se produjo dentro de los 5 das. Se debera notar que el suelo Brazito utilizada en este
estudio no era estril y en consecuencia, presenta retos competitivos para el introducida organismos, y sin
embargo la degradacin todava se produjeron en el suelos cocontaminated sobre la inoculacin con el cadmio
resistente aislamientos.
Tambin probamos la estrategia de doble bioaumentacin en un intermedio experimento a escala de campo. En el
campo intermedio escala, ms variabilidad era evidente que en la escala de banco estudios (Fig. 3). Sin embargo,
varias conclusiones pueden seguir siendo
dibujado. Cuando se aadi 2,4-D para el suelo sin Brazito cadmio, bajas tasas de degradacin en ltima
instancia, se produjeron sin bioaumentacin con R. eutropha JMP134 (Fig. 3a), como

HIGO. 1. micrografas TEM de la cepa Pseudomonas I1a en ausencia de cadmio (a) y cuando se exponen a 20
mg de ML21 cadmio (b). Nota el precipitado oscuro (ep) asociado con la capa de EPS de los alrededores (b),
confirmado como el cadmio por anlisis de rayos X elemental. Las micrografas TEM de Pseudomonas H1 cepa
en ausencia de cadmio (c) y cuando se exponen a 125 mg de ML21 cadmio (d) se muestran. Tenga en cuenta las
acumulaciones densas (GR), confirmados para ser cadmio con el anlisis elemental. Tanto en los paneles B y D,
la densidad celular total aument debido a la unin no especfica de metal. Bares iguales a 0,5 mm. En el
espectro proporcionado, el cobre (Cu) picos eran de la rejilla de cobre, el silicio (Si) pico fue de la incrustacin
Spurs medianas, y el pico de osmio (Os) era de tincin con OsO4. Los cadmio (Cd) picos confirmaron la
presencia de cadmio

HIGO. 2. En el caldo, cadmio desintoxicacin por cepas Arthrobacter cepa D9, la cepa de Bacillus H9,
Pseudomonas cepa H1, y la cepa de Pseudomonas I1a permite la degradacin de 2,4-D por el cadmio sensible R.
eutropha JMP134 en presencia de 12 mg de ML21 cadmio para el aislado I1a y 24 mg de ML21 de cadmio para
aislamientos D9, H1, y H9. Dentro de los 120 h, todos los aislados permiten la degradacin de 500-mg ML21
2,4-D a niveles indetectables. Los tiempos que se indican fueron de 48 h despus de la inoculacin con la cepa
resistente a cadmio.

HIGO. 3. La degradacin de 500 mg-g21 2,4-D y la aparicin de poblaciones microbianas 2,4-D-degradantes con
el tiempo en semanas, como se detecta en biorreactores a escala piloto de campo que contenan tierra Brazito
modificarse slo con el 2,4-D (Tratamiento 1) (a); 2,4-D y 60 mg de g21 cadmio (Tratamiento 2) (segundo); 2,4D y 104 UFC de R. eutropha JMP134 g21 (Tratamiento 3) (c); 2,4-D, 60 mg de g21 cadmio, y 104 UFC de R.
eutropha JMP134 g21 (Tratamiento 4) (d); 2,4-D, 60 mg de g21 cadmio, 104 UFC de R. eutropha JMP134 g21, y
104 CFU de la cepa de Pseudomonas resistentes a cadmio g21 H1 (tratamiento 7) (e). El nmero original de
microorganismos degradadores de 2,4-D fue menos de 102 UFC g21 del suelo antes de la bioaumentacin.
Tratamiento 5 (2,4-D y Pseudomonas cepa H1) y Tratamiento 6 (2,4-D, 60 mg de cadmio G21, y Pseudomonas
H1 cepa) no se muestran poblaciones microbianas indgenas aclimataron a la 2,4-D. Sin embargo, incluso
despus de 10 semanas, la degradacin fue incompleta, y los niveles de 2,4-D no disminuyeron entre las semanas
5 y 10. El degradacin aparente observada en ausencia de la inoculacin enel campo indica la presencia de una
poblacin nativa de 2,4- microorganismos D-degradante que no fueron detectados en el suelo experimentos de
microcosmos. En presencia de 60 mg de cadmio g21, la degradacin indgena pareca ser inhibida en el ausencia
de bioaumentacin (Fig. 3b) a pesar de que degradadores de 2,4-D eran cultivables en el suelo despus de 8
semanas. En virtud de todo las condiciones de tratamiento, en ausencia de R. eutropha JMP134 inoculacin, 2,4D que degradan los organismos no aparecieron hastasemana 8. La ocurrencia de estos microorganismos
degradadores puede haber sido debidoal microsite variacin en las concentraciones de cadmio en el suelo o el el
uso de fuentes de carbono alternativas disponibles en el suelo. En el laboratorio, hemos observado que las
poblaciones bacterianas eran resistente cadmio y podra degradar 2,4-D que no pudieronpara resistir cadmio y
degradar 2,4-D simultneamente, posiblemente debido a la demanda de energa se coloca sobre el organismo. Por
consiguiente, los microorganismos degradadores indgenas 2,4-D pueden no haber sido capaces de degradar 2,4D en presencia de cadmio, ya el medio EMB utiliza para seleccionar los organismos 2,4-D-degradar
no contena cadmio. En los reactores inoculados con R. eutropha JMP134, el nmero de 2,4-D-degradar
organismos cay desde el inoculado 104 UFC de R. eutropha JMP134 g21 a, 102 CFU de 2,4-D-degradar
organismos g21 durante semana 1 a 3. Por semana 4 o 5, sin embargo, el nmero de degradadores de 2,4-D
aumentaron de manera espectacular, a 107 UFC G21 (fig. 3c de correo).
En Tratamiento 3 (Fig. 3c), con 2,4-D y R. eutropha JMP134, como se observa en todos los reactores inoculado
con R. eutropha JMP134, una poblacin de 2,4-D-degradantes era evidente por semana 5 (105 UFC G21). La

concentracin de 2,4-D en Tratamiento 3 se redujo a 300 mg kg21 en las primeras 4 semanas y luego se mantuvo
estable, indicador de una degradacin incompleta o bajas tasas de degradacin. Curiosamente, la degradacin
ocurrido antes de la aparicin de microorganismos degradadores de 2,4-D, probablemente debido en parte a
algunos microorganismos degradadores no cultivables en el OE medio. El tratamiento en 4 reactores (cadmio y
R. eutropha JMP134; Higo. 3d), la degradacin fue menos aparente, e incluso aunque por semana 6, 107 2,4-D
degradadores g21 podran ser recuperados, cadmio pareca tener un efecto sobre la degradacin de 2,4-D.

Sin embargo, cadmio afect a la degradacin por el aumento de la la variabilidad de las lecturas, y en el
tratamiento 7 (Fig. 3d), el Adems de Pseudomonas H1 cepa aument significativamente la velocidad de
degradacin de 2,4-D (P 5 0,015). degradacin significativa se observ en los tratamientos tanto con la cepa
Pseudomonas H1 y R. eutropha JMP134 (Tratamiento 4 frente al Tratamiento 7 Tratamiento y 6 frente
Tratamiento 7). No era la degradacin observado en los tratamientos con Pseudomonas cepa H1 sola
(Tratamiento 1 Tratamiento contra 5 y 2 frente al Tratamiento Tratamiento 6).
DISCUSIN
Este estudio ha demostrado el uso de un doble bioaumentacin estrategia en la rehabilitacin de los sistemas
contaminados. Esta estrategia involucr la coinoculacin de un metal resistente poblacin microbiana con una
poblacin orgnica-degradantes, el principal modo de accin de desintoxicacin de ser de metal, tales que la
degradacin orgnica ya no se inhibi. Residencia en resultados prometedores en experimentos de laboratorio
con tanto pura cultivo y del suelo microcosmos, que examinaron esta estrategia en una prueba de campo. Las
tasas de degradacin de 2,4-D de R. eutropha JMP134 en presencia de Pseudomonas H1 cepa eran
sorprendentemente similar en ambos el microcosmos del suelo laboratorio y en el estudio de campo
(aproximadamente 50 das), aunque la degradacin del 2,4-D no fue completa en el estudio de campo. Tambin
fue interesante la observacin de que muchas de las 2,4-D-degradantes aislamientos preliminarmente examinaron
para el plsmido PJP4 recuperado en el campo experimento no eran R. eutropha JMP134. Esto y la observacin
que la degradacin indgena 2,4-D no fue significativa con cadmio sugerido que la transferencia del plsmido
PJP4 a poblaciones indgenas se produjeron. El estudio de campo demostr que bioaumentacin usando
coinoculants es una opcin viable para la remediacin de metal- y orgnicamente contaminada suelos.
Mientras que el opern Cad no se encontr en ningna de las cepas aisladas, esto no excluye la presencia de un
sistema de flujo de salida de cadmio; Sin embargo, los aislados examinados reducen las concentraciones de
cadmio solubles, indica el uso de un mecanismo alternativo de resistencia. Como el metal soluble se piensa que
es ms txico que el consolidado o el metal precipitado, cada uno de los cuatro aislamientos efectivamente
reduccin de la toxicidad del cadmio. De los cuatro aislamientos, Pseudomonas H1 cepa y cepa de Bacillus H9
parecan utilizar una mecanismo intracelular de secuestro de cadmio. mientras intracelular acumulacin de
cadmio microbiana no ha sido as documentado, el aumento observado en la densidad de la membrana externa

tras la exposicin a cadmio indicado unin de metal para lipopolisacridos, tal como se encuentra por Landley y
Beveridge (15). Metalotionena produccin y precipitacin polifosfato representan dos posibles explicaciones en
el que el cadmio es secuestrado intracelularmente. Sin embargo, el mecanismo exacto
de la acumulacin intracelular de cadmio mritos investigacin ms a fondo. Las otras dos cepas resistentes a
cadmio, Pseudomonas I1a cepa y cepa Arthrobacter D9, mostraron evidencia de EPS la produccin de la tincin
y bajo el TEM mostr cadmio acumulacin externo a las clulas. Del mismo modo, un estudio de Roane (21)
encontraron que la produccin de EPS result en extracelular el secuestro de plomo. la unin a exopolmeros
metal se conoce para reducir la toxicidad de metales. Aunque, en general asociada con adherencia y proteccin
contra la desecacin, actan como exopolmeros fuertes atrayentes inicos y, por lo tanto, se unen fcilmente los
metales. Fue interesante que los dos mayora de los aislados resistentes a cadmio fueron H1 cepa de
Pseudomonas (resistente hasta 225 mg Captulos 21) y H9 cepa de Bacillus (resistente hasta 275 mg Captulos
21), que ambos mostraron una acumulacin de cadmio intracelular. Los mecanismos de resistencia de estos dos
organismos tambin se plasmdico codificado. Por ltimo, los descensos ms dramticos en solubles cadmio en
el crecimiento fueron vistos con Pseudomonas H1 cepa y la cepa de Bacillus H9, en que haba una prdida de
36% en soluble cadmio con el crecimiento. Arthrobacter cepa D9 y Pseudomonas I1a cepa mostr menos
desintoxicacin, con una disminucin resultante de 22 y 11% en cadmio soluble con el crecimiento. Este estudio
encontr que mientras que la doble bioaumentacin con metal- desintoxicante y orgnica de degradacin de las
poblaciones microbianas se efectivo en la remediacin cocontaminant, debe darse tiempo para la desintoxicacin
de metal que se produzca antes de la degradacin orgnica es observado. No se observ evidencia de esto en las
48 h se necesitan entre la inoculacin con la poblacin en la desintoxicacin de metales y la inoculacin con la
poblacin orgnico degradantes. Encontramos que la viabilidad de la poblacin orgnico degradantes disminuy
cuando se aade al sistema antes de la desintoxicacin de metales.
Slo con este enfoque gradual con el fin BIOAUMENTO fue la recuperacin de un suelo cocontaminated xito.