PCR
REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA
Del Ingls: Polymerase Chain Reaction
Desarrollada por Kary Mullis en 1985.
Automatizada a partir de 1988
Uso de la Taq DNA Polimerasa PCR
Molcula de ADN
REPLICACIN DEL ADN
La reaccin en cadena de la
polimerasa
La PCR es un mtodo rpido, de bajo costo y sencillo para
copiar fragmentos especficos de ADN a partir de
cantidades mnimas de ADN original.
Comprende la preparacin de la muestra del ADN y de una
mezcla maestra de cebadores, y luego la deteccin de los
productos de reaccin.
La deteccin no requiere necesariamente el uso de
radioistopos o de productos qumicos txicos.
Procedimientos de la PCR:
Etapas
Desnaturalizacin: La reaccin se calienta a altas
temperaturas para reducir la doble hlice del ADN a
cadenas simples. Estas cadenas se tornan accesibles a los
cebadores.
Hibridacin: Se enfra la mezcla de reaccin. Los
cebadores hibridan con las regiones complementarias de
las cadenas del ADN patrn, y se forman nuevamente
cadenas dobles entre los cebadores y las secuencias
complementarias.
Extensin: La Taq polimerasa sintetiza una cadena
complementaria. El enzima lee la secuencia de la cadena
opuesta y extiende los cebadores agregando nucletidos
en el orden en que pueden emparejarse. El proceso
entero se repite una y otra vez.
PCR
Replicacin In vitro de ADN
Permite generar millones de copias de un
segmento de ADN
Componentes: ADN, dNTPs, Mg+2, buffer, Taq
polimerasa, primers o cebadores.
Consta de 3 etapas:
denaturacin
Hibridizacin o alineamiento
Polimerizacin
y de 30-35 ciclos
1 ciclo
AMPLIFICACION
EXPONENCIAL
Esquema de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), mostrando 3 ciclos de amplificacin
Procedimientos de la PCR:
Ciclo 1
Procedimientos de la PCR:
Ciclo 2
Procedimientos de la PCR:
Ciclo 3
Procedimientos de la PCR:
Condiciones de los ciclos
Desnaturalizacin completa del patrn de
ADN
Temperatura ptima para la hibridacin
Temperatura ptima para la extensin
Nmero de ciclos de la PCR
Etapa final de extensin
Procedimientos de la PCR:
Condiciones de la mezcla de reaccin
Hay que evitar la contaminacin del ADN con las
siguientes medidas:
Separando las zonas de extraccin del ADN y de la
PCR.
Empleando equipo de laboratorio dedicado a un solo
uso.
Esterilizando en autoclave y haciendo alcuotas.
Aadiendo una reaccin testigo.
Procedimientos de la PCR:
Componentes
Componentes:
Agua desionizada estril
Solucin tampn de PCR
10X
Mezcla de dNTP
Cebador
Taq polimerasa
MgCl2
ADN patrn
Consideraciones:
ADN patrn
Cebadores
Concentracin de MgCl2
Taq polimerasa
dNTP
Procedimientos de la PCR:
Equipos
Micropipetas
Termociclador
Unidades de electroforesis
Fuente de energa elctrica
Equipo fotogrfico
Lectura de los resultados de la PCR
En la PCR convencional, la visualizacin de los resultados se realiza al final
del proceso. La forma ms habitual conlleva la separacin electrofortica de
los fragmentos amplificados en un gel de agarosa, la posterior tincin con
bromuro de etidio (u otro colorante fluorescente) y la observacin final
transiluminando con luz ultravioleta.
Reaccin en cadena de la ligasa (LCR)
El mtodo e la reaccin en cadena de la ligasa utilizan una ligasa
termoestable. E la figura 17-7 se presenta el proceso
esquemticamente. Se utiliza 4 cebadores que se alinea en regiones
inmediatamente adyacentes al molde. 2 de ellas se alinean con la
cadena superior. El segundo par de cebadores es complementario del
primero y se alinea con la cadena opuesta.
Tecnologa de la PCR en
imgenes
Las siguientes fotografas muestran la forma en
que se lleva a cabo la tecnologa de la PCR
La mezcla para la PCR se prepara sobre hielo
Los tubos de reaccin se colocan en el termociclador.
Se cierra el termociclador, se bloquea y se programa
Hay diferentes tipos de termocicladores: el de color negro es una ttrada, y
en l se pueden procesar simultneamente 4 conjuntos de 96 muestras. Los
cuatro ms pequeos, de color blanco tienen, cada uno, una capacidad de 96
pocillos.
