CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE
ALTA RESOLUCION
Componentes de un Cromatgrafo
Suministro de
Solvente
Ubicacin
GASES
I.C.-H.P.L.C.
L.C.-G.P.C.
50
500
10.000
2 MILLONES
RANGO
RANGO UTIL
UTIL EN
EN PESO
PESO MOLECULAR
MOLECULAR
Complementariedad
Diferentes alternativas
qumicas
No destructiva
Mltiples alternativas de
deteccin
Identificacin de
compuestos (estndar de
referencia)
Procesador
de Muestras
Columna
Detector
Procesador
de Datos
Mecanismo de funcionamiento
QUE ES UN CROMATOGRAMA
Isocratic and Gradient Operation
IDENTIFICANDO Y CUANTIFICANDO COMPUESTOS
HPLC Scale (Analytical, Preparative, and Process)
Resolucin
Terminologa
l Retencin
o factor de
capacidad (K)
l Selectividad o factor de
separacin ( )
l Nmero de platos
tericos (N)
l La combinacin de las
anteriores = Resolucin
V0
V1
V2
Se debe modificar cuando se
presenta el fenmeno de cola,
variando:
Tiempo de retencin
Eficiencia
Selectividad
Retencin o factor de capacidad (K)
Selectividad o factor de separacin ( )
Nmero de platos tericos (N)
TIPOS DE SEPARACION
CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA
Afectan la Resolucin
BAJA POLARIDAD
l Tecnologa de
DIAMETROS
EN
mm. 4.0
2.0
0.1
0.8
0.5
4.0
1.0
7.5
FLUJOS
0.6
0.15
3.0
0.75
CAMBIOS EN VELOCIDAD
LINEAL AL INCREMENTAR
EL FLUJO EN COLUMNAS DE
DIAMETRO DIFERENTE
5.8
1.5
empaque
Slice
usada
l La carcaza:
Dimetro interno
POLARIDAD DE
SUSTANCIAS
l La viscosidad del
solvente
l Temperatura
Fase Normal
F. Estacionaria Polar
F. Mvil No Polar
ALTA A
MEDIA
Fase Reversa
F. Estacionaria No Polar
F. Mvil Polar
F. MVIL
4.6
l Calidad de la
F. ESTACIONARIA
VELOCIDAD
LINEAL
CM/SEG
pH
Fuerza Inica
l
l
l
BAJA A
MEDIA
BAJA POLARIDAD
Intercambio Inico
Permeacin por Gel (polmeros)
Filtracin en gel
Par Inico Cromatogrfico P.I.C.
Recordar generalidades
MECANISMO DE
PURIFICACION DE AGUA
FASE MOVIL
MEZCLA DE DOS O MAS SOLVENTES QUE
INTERACTUA CON LA MUESTRA Y CON LA COLUMNA
l Agua
l DESTILACION
obtenida por Osmosis inversa
l DESMINERALIZACION
l Solventes Orgnicos
Polares y Apolares grado HPLC
(No deben poseer particulas mayores a 0.45 micras)
l Control de pH
l OSMOSIS
INVERSA
Buffers
Aminas
Acidos
l Modificadores Orgnicos
Recomendaciones con la Fase
Mvil en HPLC
Variables determinantes
l
l
l
l
Filtrar a travs de una membrana
(0.22-0.5) micras
Desgasificar (para eliminar los gases
disueltos)
Vaco
Calentamiento
Ultrasonido
Combinaciones
Evitar Incompatibilidad Qumica
l
l
l
l
l
l
l
l
l
Partculas slidas
Gases disueltos
Buffers
Impurezas que absorben al U.V.
Estabilizantes / antioxidantes
Costo y disponibilidad
Toxicidad
Viscosidad
Volatilidad
Inflamabilidad
Compatibilidad Qumica
Indice de polaridad
Fuerzas de dispersin
Momento dipolar: Atraccin de
Grupos Funcionales
Puentes de Hidrgeno:
Donante o receptor de protones
Grupo de Solvente: Lo que
resulta determinante en la
Selectividad.
TABLA DE ESCALA CROMATOGRAFICA
Scale
Analytical
Semi-prep
COMO SELECCIONAR LA
MEJOR COLUMNA PARA
OBTENER LOS
RESULTADOS
DESEADOS
Prep
Process (Industrial)
Chromatographic
Objectives
Just Data (compound ID and
concentration)
Data and a small amount of
purified compound (< 0.5
gram)
Larger amounts of purified
compound (> 0.5 gram)
Manufacturing quantities
(gram to kilograms)
http://www.varianinc.com/image/vimage/docs/cor
p/press/imglibrary/shared/high-res/pursuit.jpg
Diseos de Columnas para HPLC
SEPARACION CROMATOGRAFICA
El poder de separacin en HPLC se debe a 2 factores:
Separacin mecnica y separacin qumica
PARAMETROS SELECCIN DE COLUMNA S
CONTINUACION..
Uso de Precolumnas
CARCAZA
l
l
l
l
DIAMETRO INTERNO
LONGITUD
MATERIAL DE LA PARED
TIPO DE DISEO
FASE ESTACIONARIA
BASE DE SILICE (pH 2.0-7.5)
MATERIAL POLIMERICO (pH 0 14)
FORMA DE LA PARTICULA
IRREGULAR (baja eficiencia y aplicaciones en separaciones
preparativas)
ESFERICA (1-20 micras, separacin eficiente, poca
capacidad de carga, til para separaciones reproducibles)
PRECOLUMNAS
l
l Evitan la
retencin irreversible de contaminantes
en la columna
l Pueden aumentar la vida.
l Algunas logran mejorar la resolucin de la
separacin
l Pueden usarse como estrategia de limpieza de
muestra.
Preparacin de Muestras
l Filtracin Fsica (0,45
PARA AUMENTAR LA VIDA DE LAS COLUMNAS SE DEBEN
UTILIZAR PRECOLUMNAS LAS CUALES SON DEL MISMO
MATERIAL DE LAS COLUMNAS Y RETENDRAN LOS
CONTAMINATES QUE SE RETENGAN EN LAS COLUMNAS
EL SITIO MAS FRECUENTE EN EL QUE SE COLOCAN SON
ENTRE EL INYECTOR Y LA COLUMNA
EN ALGUNAS OCACIONES SE COLOCA ENTRE LA BOMBA Y
EL INYECTOR
micras)
l Filtracin Qumica
Extraccin con Solventes
Cartuchos Sep Pak
-OH
l Control de
pH
l Control de Temperatura
Degradacin
Evaporacin
Variables determinantes
l Que compuesto
nos interesa cuantificar
Estabilidad
Peso molecular
l En que matriz
lA
PREPARACION DE MUESTRAS
l DISOLVER
l SOMETER
A ULTRASONIDO
l FILTRAR EN 0.45 MICRAS (DURAPORE)
l INYECTAR
que nivel de concentracin
Es determinante no solo para la preparacin, sino
para la deteccin.
Ejemplos
Detectors for HPLC
l UV/Vis
absorbance (UV/Vis)
Rapid scanning photodiode array
l Fluorescence (FL)
l Refractive
index (RI)
l Electrochemical (ECD)
l Conductivity
l Mass
spectrometry (MS)
FT-IR, Light Scattering, etc.
l Others:
Post-column or precolumn derivatizations are useful to enhance detection
l Anlisis
de cremas y productos semislidos
l Determinacin de principios activos formulados
en aceite
l Investigacin en extractos vegetales
l Cuantificacin de Sustancias en material
biolgico
l Cuantificacin de aditivos en polmeros
Ejemplos
l Concentracin
de trazas
CUANTIFICACION
l ESTANDARD
Comn en determinaciones de contaminantes
ambientales
EXTERNO
l ESTANDARD INTERNO ADICION DE
ESTANDARES
l Cuantificacin
de vitaminas en bases de
premezclas
l Determinacin de Azcares en muestras de
caa de azcar o caf
HPLC APLICACIONES
ANTIBIOTICOS
ANALGESICOS
VITAMINAS
ANTIHISTAMINICOS
HORMONAS
ANTIBACTERIANOS
CATIONES
ANIONES
AZUCARES
METALES
PROTEINAS
AMINOACIDOS
TOXINAS
ESTEROIDES
TINTAS
POLIMEROS
ANALISIS BIOQUIMICOS
ESPECTRO U.V. PIRIDOXAL Y SU
PRODUCTO DE INTERACCION
CROMATOGRAMA DE PIRIDOXAL Y SU
PRODUCTO DE INTERACCION
Huang, T., et al. (2001). J. Agric. Food Chem. 49: 1559-1563
