UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA
Escuela de Ciencias Bsicas Tecnologas e Ingeniera
Biotecnologia Alimentaria
INFORME DE LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA ALIMENTARIA
INTEGRANTES:
DIANA LORENA FLOREZ GOMEZ - COD: 29683329 GRUPO: 211619_3
RONI MARIE CORTES NOGUERA- COD: 1.113.628.912 GRUPO: 211619_12
JUAN CARLOS MAZO - CODIGO: 16.886.390 GRUPO: 211619_ 2
MIGUEL ANGEL MARIN CODIGO: GRUPO:
TUTOR PRESENCIAL:
MARIA DEL CARMEN GONGORA
TUTOR VIRTUAL:
GLAEHTER YHON FLOREZ
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD
ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS TECNOLOGIA E INGENIERIAS
INGENIERA DE ALIMENTOS
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Biotecnologia Alimentaria
MAYO DE 2014
INTRODUCCION
La biotecnologa se puede definir como un conjunto de tcnicas en que se utilizan
organismos vivos, partes de ellos o molculas derivadas de organismos vivos para
fabricar o modificar productos. Adems, comprende aquellas tcnicas de
modificacin gentica de variedades de plantas, animales o microorganismos para
su utilizacin con un propsito especfico.
La ingeniera gentica es un conjunto de tcnicas que permite manipular los
genes. El descubrimiento de las enzimas de restriccin fue clave para poder
desarrollar estos procedimientos.
En el siguiente informe que es el resultado de las practicas de la Cinetica de
crecimiento microbiano donde observamos diversas fases de crecimiento del
microorganismo E coli y cinetica enzimatica analizamos la metodologia establecida
para la determinacion de la actividad enzimatica de la glucosa oxidasa.
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PRACTICA 1: CINETICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
MARCO TEORICO
Actividad enzimtica:
Se define la unidad de actividad enzimtica (U) como la cantidad de enzima que
cataliza la conversin de 1 mol de sustrato en un minuto. La actividad especfica
es el nmero de unidades de enzima por miligramo de protena (U/mg prot) o por
mililitro de disolucin (U/ml).
Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de
actividad enzimtica como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato
por segundo. Esta unidad se llama katal (kat). Como 1 mol son 106 moles y 1
minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal equivale a 60 x 106 U. Esta unidad es
muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los submltiplos como el
microkatal (kat, 10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-9 kat).
Cuando se conoce el peso molecular del enzima puro y el nmero de centros
activos por molcula de enzima, las medidas de actividad enzimtica permiten
calcular el nmero de recambio del enzima, o sea, el nmero de reacciones
elementales que realiza el enzima por cada centro activo y por unidad de tiempo.
La constante de Michaelis-Menten (KM) es un parmetro cintico importante pr
mltiples razones:
KM es la concentracin de sustrato para la cual la velocidad de reaccin es
la mitad de la velocidad mxima. En efecto, si KM = [S], la ecuacin de
Michaelis-Menten se reduce a: v = Vmax/2.
El valor de KM da idea de la afinidad del enzima por el sustrato: A menor
KM, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor KM, menor
afinidad. Este hecho tiene fcil explicacin si tenemos en cuenta que KM se
define como (k2+k3/k1), donde las reacciones 2 y 3 destruyen el complejo
ES, mientras que la reaccin 1 lo forma. As, si KM es grande, el complejo
ES es inestable pues predomina la tendencia a destruirlo (poca afinidad
hacia el sustrato), y si KM es pequea, el complejo ES es estable, ya que
predomina la tendencia a formarlo (gran afinidad hacia el sustrato).
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La KM del sustrato natural es menor que la de los sustratos anlogos. Si
dos sustratos del mismo enzima tienen distinta KM, el que presente mayor
KM tiene menor afinidad por el enzima, y la reaccin transcurre siempre a
menor velocidad que con el sustrato de menor KM, salvo a concentraciones
saturantes de sustrato, donde la v = Vmax.
Los valores de KM de muchos enzimas son prximos a los de la
concentracin fisiolgica de sus sustratos, de forma que pequeas
variaciones en la [S] pueden suponer grandes cambios en la velocidad de
toda una ruta metablica.
CINTICA ENZIMTICA
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La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por
enzimas. Estos estudios proporcionan informacin directa acerca del mecanismo
de la reaccin cataltica y de la especifidad del enzima. La velocidad de una
reaccin catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en
muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza
siempre en las condiciones ptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores,
etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la
velocidad de reaccin observada es la velocidad mxima (Vmax). La velocidad
puede determinarse bien midiendo la aparicin de los productos o la desaparicin
de los reactivos.
Al seguir la velocidad de aparicin de producto (o de desaparicin del sustrato) en
funcin del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reaccin, o
simplemente, la cintica de la reaccin. A medida que la reaccin transcurre, la
velocidad de acumulacin del producto va disminuyendo porque se va
consumiendo el sustrato de la reaccin (Figura de la derecha). Para evitar esta
complicacin se procede a medir la velocidad inicial de la reaccin (v0). La
velocidad inicial de la reaccin es igual a la pendiente de la curva de avance a
tiempo cero (Figura de la derecha). De esta forma, la medida de v0 se realiza
antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda
considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento.
Adems, en estas condiciones no es necesario considerar la reaccin inversa, ya
que la cantidad de producto formada es tan pequea que la reaccin inversa
apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de
velocidad
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Para estudiar la cintica enzimtica se mide el efecto de la concentracin inicial
de sustrato sobre la velocidad inicial de la reaccin, manteniendo la cantidad de
enzima constante. Si representamos v0 frente a [S]0 obtenemos una grfica como
la de la Figura de la derecha. Cuando [S]0 es pequea, la velocidad inicial es
directamente proporcional a la concentracin de sustrato, y por tanto, la reaccin
es de primer orden. A altas [S]0, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y
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la velocidad ya no depende de [S]0. En este punto, la reaccin e 1s de orden cero y
la velocidad es mxima (Vmax).1
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MATERIALES Y EQUIPOS
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METODOLOGIA
Inoculacin y cintica enzimtica
1. Agitar y tomar en un tubo de ensayo, una alcuota de 2 ml en
condiciones aspticas (utilizando un mechero) de cada medio de cultivo,
el cual se utilizar
Como blanco, marcar como B.
2. Inocular en condiciones aspticas 5 ml del inculo a cada medio de cultivo
(medios del 1, 2, 3, 8, 9,10), agitar y tomar 2 ml de muestra en un tubo de ensayo
marcado como tiempo cero 0. Agitar el medio e incubar a 37 C; tanto los tubos
marcados como blanco (B), cero (0) y las dems muestras posteriores, deben ser
almacenarlos rpidamente a 4 C para evitar el crecimiento del microorganismo en
los mismos.
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3. Repetir la toma de muestra en tubos de ensayo (tem 2) en los tiempos: 30, 60,
90, 120, 150, 180, 210, 240, 270 y 300 min, cada tubo debidamente marcado
con su respectivo tiempo, almacenarlos en la gradilla a 4 C hasta el final del
crecimiento (minuto 300).
4. Luego de la ltima toma (al minuto 300), agitar y leer cada muestra en un
espectrofotmetro a una longitud de onda de: 600 nm, utilizando como blanco el
tubo marcado como B, para cada medio. Luego de su medicin, las muestras
deben ser desechadas en una solucin de hipoclorito de sodio.
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TABLAS Y GRAFICAS DE RESULTADOS
Medido a 600mm
GRUPO
t=0
37C 4C
SACAROSA 0.227 0,014
GLUCOSA
0,100 0,015
FRUCTOSA 0,041
SACAROSA -0,40
60%
0,018
t=30
37C 4C
0,052 0,051
0,235 0,038
0,045 0,131
t=60
37C 4C
0,115 0,078
0,119
0,061
0,033
0,024
SACAROSA 40%
0,002
0,026
0,038
0,016
0,004
0,043
0,051
0,013
0,014
0,214
t=90
37C 4C
0,770 0,020
0,064
0,083
0,173
0,044
0,022 0,018
t=120
37C 4C
0,092 0,093
0,039
0,014
0,021
0,114
0,100
0,004
0,198
0,025
0,025
0,029
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TIEMPO CERO
0
-0.05
-0.1
-0.15
ACTIVIDAD MICROBIANA
-0.2
-0.25
-0.3
-0.35
-0.4
-0.45
TIEMPO 30 MINUTOS
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
ACTIVIDAD MICROBIANA
0.05
0
-0.05
-0.1
-0.15
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TIEMPO 60 MINUTOS
0.25
0.2
0.15
0.1
ACTIBIDAD MICROBIANA
0.05
0
TIMPO 90 MINUTOS
1
0.8
0.6
0.4
ACTIVIDAD MICROBIANA
0.2
0
-0.2
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TIEMPO 120 MINUTOS
0.25
0.2
0.15
0.1
ACTIVIDAD MICROBIANA
0.05
0
-0.05
-0.1
-0.15
ANALISIS DE RESULTADOS
En la prctica se observa el crecimiento de los microorganismos, todo
se resume en varias fases:
Fase de latencia o retardo: dura pocas horas, ya que la clula se adapta
al medio en el que se encuentra. Puede haber muerte de algunos
microorganismos.
En la fase de latencia existe un aparente reposo en el que las clulas
sintetizan lasenzimas necesarias para la actividad metablica que deben
llevar adelante.
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Cuando se hacen mediciones del nmero de clulas en distintos tiempos
dentro de estafase, el valor no cambia sustancialmente. En cambio,
interiormente
las
clulas
trabajanactivamente
adaptando
el
equipo
enzimtico al medio de cultivo. La bacteria se preparapara hacer uso de los
nutrientes que este medio le aporta, por lo tanto es la fase deadaptacin al
medio, con aumento de la masa celular pero no del nmero de clulas.
Fase logartmica: se lleva a cabo una multiplicacin exponencial de los
microorganismos.La velocidad de crecimiento que alcanza un cultivo,
depende del tipo de microorganismoque se trate y diversos factores
ambientales como son la temperatura, el pH, oxigenacin,etc.
Fase de aceleracin negativa: dada por la competencia del alimento.
Fase estacionaria: consiste en el equilibrio entre la multiplicacin y muerte
de los microorganismos.
Esta fase se presenta por agotamiento del suministro de algn nutriente
esencial o poracumulacin de productos metablicos que sean txicos.
Tambin puede ser por ladisminucin de la oxigenacin o cambios en las
condiciones de pH del medio de cultivo(acidificacin o alcalinizacin).
Fase de Destruccin acelerada: debido a la muerte exponencial de los
microorganismos, por falta de nutrientes y el aumento de sustancias de
desecho.
Fase de declive: causada por la muerte total de los microorganismos por la
acumulacin de sustancias de desecho.
El tiempo de la fase de latencia puede variar debido a las condiciones del
cultivo as como tambin por la edad del inculo, el tamao del inculo y los
nutrientes contenidos en el medio de cultivo. 'La edad del inculo vara
debido a la cantidad de materiales txicos en l y la falta de nutrientes que
posea la clula durante su desarrollo, los inculos viejos prolongan ms la
fase de latencia.
La fase de crecimiento microbiano dura 120 minutos y sta es logartmica.
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CONCLUSIONES
El crecimiento bacteriano puede considerarse como el crecimiento de poblaciones
de muchos millones de clulas cuyas caractersticas son esencialmente
estadsticas, y el comportamiento de la clula individual es tomado como una
frecuencia.
El crecimiento de las bacterias en cultivo puede determinarse midiendo
experimentalmente el incremento de la materia celular (protoplasma) o del
incremento del nmero de clulas.
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Las posibilidades fisiolgicas de los microorganismos se relacionan inversamente
con sus necesidades nutricionales, ya que, la sntesis de componentes celulares a
partir de materia inorgnica o compuesto inorgnicos simples es obviamente un
proceso ms complejo de lo que sera si los productos de partida fueran
sustancias orgnicas complejas qumicamente ms parecidas a los constituyentes
finales de la clula.
Los microorganismos probiticos juegan un papel importante en el desarrollo de
nueva flora intestinal y de sustancias capaces de disminuir los patgenos como
bacterias, virus y parsitos.
Desde el punto de vista microbiolgico, un microorganismo muere cuando pierde
de forma irreversible la capacidad de dividirse. El fundamento de esta definicin es
que si un microorganismo ha perdido la capacidad de dividirse no podr formar
una colonia sobre un medio de cultivo y no ser posible detectar su presencia por
los mtodos microbiolgicos tradicionales.
Es decir, cuando no se produce aumento en el nmero de microorganismos no
hay crecimiento. Sin embargo, un microorganismo puede estar muerto desde el
punto de vista microbiolgico y continuar desarrollando una actividad metablica
que se traduzca, por ejemplo, en liberacin de toxinas.
Por otra parte, hay que considerar que la capacidad de multiplicacin
(crecimiento) de un microorganismo puede verse transitoriamente afectada por
lesiones o por las condiciones fsicas o qumicas del entorno. En estos casos,
podramos considerar como muertos microorganismos que pueden reanudar su
crecimiento si las condiciones son de nuevo favorables.
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BIBLIOGRAFIA
http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz3.htm
Universidad del Pas Basco.Cinetica enzimtica.
http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz3.htm
Recuperado
de:
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PRACTICA 4: CINETICA ENZIMATICA
INTRODUCCIN
Las clulas poseen compuestos qumicos que controlan las reacciones que
ocurren en su interior. La sustancia que controla la velocidad a la que ocurre una
reaccin qumica sin que la clula sufra dao alguno ni se destruya se conoce
como catalizador. Las enzimas son sustancias (protenas) que actan como
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catalizadores en las clulas y hacen posibles las, reacciones que ocurren en las
clulas disminuyendo la cantidad de energa de activacin que se necesita. Las
enzimas tambin controlan la velocidad a la que ocurre la reaccin para que la
energa se libere a una temperatura que no haga dao al organismo. Las miles de
reacciones que constituyen el metabolismo de los seres vivos estn bajo control
de miles de enzimas.
Diferentes enzimas controlan diferentes reacciones. La sustancia sobre la cual
acta una enzima se llama Sustrato: Al ocurrir una reaccin el sustrato se
convierte en uno o ms productos nuevos.
Las enzimas no se consumen en las reacciones y se pueden volver a utilizar. Sin
embargo una enzima particular acta solo sobre un sustrato especfico, as que
una enzima solo puede controlar un tipo de reaccin especfica.
Una enzima recibe el nombre del sustrato sobre el cual acta; Ej. Anhidrasa
carbnica, la cual acta en la conversin del CO2 en HCO3. Como nota, a una
parte del nombre del sustrato sobre el cual acta la enzima se le aade el sufijo
asa.
Corno las enzimas son protenas; los factores que afectan la estructura de la
protena, tambin afectan la funcin o actividad de las enzimas. La temperatura, el
pH y la concentracin son algunos de los factores que influyen en la actividad de
las enzimas.
JUSTIFICACIN
Las enzimas son molculas proteicas que catalizan reacciones qumicas, una
enzima hace que una reaccin qumica que transcurre a una velocidad muy baja,
transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima.
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En estas reacciones, las enzimas actan sobre unas molculas denominadas
sustratos, las cuales se convierten en molculas diferentes denominadas
productos. Casi todos los procesos en las clulas necesitan enzimas para que
ocurran a unas tasas significativas.
A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimticas.
Las ENZIMAS son catalizadores biolgicos. Un catalizador es una sustancia que
acelera las reacciones qumicas sin modificarse; esto significa que puede ser
utilizado una y otra vez. Una Coenzima es la parte no proteica de una enzima. Las
enzimas (E) son protenas que tienen uno o ms lugares llamados SITIOS
ACTIVOS (Entidad tridimensional de una enzima donde ocurren los procesos de
lisis, catlisis, hidratacin, des hidrogenacin) a los cuales se une al SUSTRATO
(S), es decir la sustancia sobre la que acta la enzima. El sustrato es modificado y
convertido en 1 o ms PRODUCTOS (P).
Dando la siguiente ecuacin:
E + S <-----> (ES) <-----> E + P
Donde (ES) es un complejo ENZIMA - SUSTRATO intermedio. Las enzimas
aceleran la reaccin hasta que alcanzan un equilibrio. Una caracterstica muy
importante de la actividad enzimtica es su ESPECIFICIDAD de SUSTRATO, de
manera que una enzima particular solo actuar sobre cierto sustrato y no aceptan
molculas relacionadas o que tengan una forma ligeramente distinta. Se asemejan
al modelo de la Llave con la Cerradura. La enzima tiene un sitio activo
complementario para el sustrato. Presentan un Sitio ALOSTRICO. Algunas
enzimas requieren cofactores para su actividad, por ejemplo los Citocromos
contienen un grupo prosttico formado por un complejo metaloporfirnico. Otras
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enzimas emplean pequeas molculas no proteicas llamadas Coenzimas que se
unen durante la reaccin para activar a la enzima. El NAD y el NADP son
importantes coenzimas.
O sea una enzima tiene un Sitio Activo, Sitio alostrico, cofactores enzimticos.
Entre las Coenzimas se encuentra el NAD, FAD, FADP, FADPH, FADH, Co A, Etc.
Toda Enzima se une al Sitio Activo y se ejemplifica mediante el modelo de la
LLAVE con la CERRADURA, que consiste en la especificidad del SITIO ACTIVO,
que depende no solo de la estructura primaria de la protena, sino tambin de sus
estructuras
secundarias
terciarias.
La
enzima
tiene
un
sitio
activo
complementario para el sustrato y no aceptan molculas relacionadas o que
tengan una forma ligeramente distinta y es por eso que la ENZIMA y el
SUSTRATO tienen una interaccin semejante a la LLAVE con la CERRADURA.
Otro modelo es del ENCAJE INDUCIDO, la interaccin entre la enzima y el
sustrato produce cambios de conformacin en la Protena. El sustrato de une al
SITIO ACTIVO mediante fuerzas no covalentes. Despus de la formacin del
COMPLEJO ES, se produce el paso cataltico, en el que el Sustrato sufre
Hidratacin, Deshidratacin, Oxidacin, Reduccin, Transferencia de grupos
qumicos, etc. El SITIO ACTIVO es complementario del SUSTRATO solo despus
que ste se une a la ENZIMA.
En la prctica se realiz el estudio de la catlisis enzimtica para la enzima
Glucosa Oxidasa.
La glucosa oxidasa es ampliamente utilizada, acoplado a peroxidasa de reaccin
que visualices colorimtricamente la formada H2O2, para la determinacin de
glucosa libre en el suero o plasma de la sangre para el diagnstico, utilizando
ensayos de espectrometra de forma manual o con procedimientos automatizados,
y hasta el punto de utilizar ensayos rpidos. Ensayos similares permite para
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controlar los niveles de glucosa en la fermentacin, birreactores, y para controlar
la glucosa en la materia prima vegetal y los productos alimenticios.
Biosensores electrodo enzimtico detectar los niveles de glucosa mediante el
seguimiento del nmero de los electrones pasan a travs de la enzima mediante la
conexin a un electrodo y la medicin de la carga resultante. Esto tiene una
posible aplicacin en el mundo de la nanotecnologa cuando se utiliza junto con
pequeos electrodos como sensores de glucosa para los diabticos.
En la fabricacin, GOx se utiliza como un aditivo gracias a sus efectos oxidantes:
se solicita para la masa ms fuerte en panadera, en sustitucin de oxidantes tales
como bromato. Tambin ayuda a eliminar el oxgeno de envases de alimentos, o
D-glucosa a partir de clara de huevo para prevenir el pardeamiento.
La glucosa oxidasa se encuentra en la miel y acta como un conservante natural.
GOx en la superficie de la miel reduce O2 atmosfrico al perxido de hidrgeno,
que acta como una barrera antimicrobiana. GOx acta de manera similar como
un bactericida en muchas clulas.
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REVISIN BIBLIOGRFICA
Marco Conceptual y Modelos Matemticos
El crecimiento microbiano es el aumento del nmero de microorganismos a lo
largo del tiempo. Por tanto, no se refiere al crecimiento de un nico
microorganismo (ciclo celular) sino al demogrfico de una poblacin.
Denominamos ciclo celular al proceso de desarrollo de una bacteria considerada
de forma aislada. A lo largo del ciclo celular, tiene lugar la replicacin del material
de la bacteria, la sntesis de sus componentes celulares, el crecimiento para
alcanzar un tamao doble del inicial y su divisin por biparticin de la bacteria para
dar lugar a dos clulas hijas. La duracin del ciclo celular coincide con el tiempo
de generacin y depende, en general, de los mismos factores de los que depende
este.
El crecimiento de una poblacin resulta de la suma de los ciclos celulares de
todos sus individuos. Este crecimiento suele ser asincrnico puesto que cada
microorganismo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular. Por
consiguiente, en un momento determinado en una poblacin se encuentran
clulas que acaban de dividirse, otras que estn replicando su ADN y
elongndose, otras que estn iniciando la divisin celular, etc.
En un crecimiento sincrnico todas las clulas se encuentran simultneamente en
la misma fase del crecimiento celular. Los cultivos sincrnicos son muy difciles de
mantener por lo que su importancia est principalmente ligada a los estudios
bsicos de biologa microbiana. Sin embargo, en la naturaleza, las bacterias del
suelo se encuentran en condiciones de crecimiento prximas a la fase estacionaria
(en la que se produce una cierta sincronizacin del cultivo) y, por consiguiente,
durante cierto tiempo las poblaciones naturales probablemente se comporten
como relativamente sincrnicas.
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Las poblaciones de bacterias pueden crecer de una forma explosiva acumulando
grandes nmeros en un periodo de tiempo muy reducido. Puesto que el efecto
nocivo (infecciones o intoxicaciones) de los microorganismos depende de su
nmero en la mayora de los casos, entender cmo se produce el crecimiento
microbiano es importante para poder evitar o reducir dichos efectos nocivos.
Se denomina crecimiento equilibrado a aqul en el que toda la biomasa, nmero
de clulas, cantidad de protenas, de ADN, etc., evolucionan en paralelo. El
crecimiento equilibrado probablemente ocurra en muy contadas ocasiones en
condiciones naturales.
Las bacterias crecen siguiendo una progresin geomtrica en la que el nmero de
individuos se duplica al cabo de un tiempo determinado denominado tiempo de
generacin (). De esta forma, podemos calcular el nmero de bacterias (N) al
cabo de un nmero de generaciones (n) usando la ecuacin siguiente:
N = No 2n
Siendo No el nmero de clulas en el momento actual. El nmero de
generaciones se puede calcular de la siguiente forma:
n=t/
Donde t es el tiempo transcurrido.
Los tiempos de generacin de bacterias creciendo en ambientes favorables
pueden ser muy cortos (valores de de 20 min). Esto lleva a que una nica clula
(N0 = 1) creciendo con un = 20 min, llegue a poder producir 4.7 x 1021 clulas
en 24 horas.
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Si la bacteria crece en un medio lquido, las clulas que se producen en cada
divisin continan su vida independientemente en la mayora de los casos
formando una suspensin de clulas libres.
Cuando una clula aislada comienza a crecer sobre un substrato slido, el
resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Se denomina unidad
formadora de colonia (UFC) a una clula viva y aislada que se encuentra en un
substrato y en condiciones ambientales adecuadas y produce una colonia en un
breve lapso de tiempo.
Una UFC tambin puede corresponder a ms de una clula cuando stas forman
parte de grupos unidos fuertemente (estreptococos o diplococos, por ejemplo) ya
que cada grupo formar una sola colonia.
Cuando algunos tipos de bacterias o de levaduras patgenas crecen sobre
superficies forman biopelcuas (biofilms) en los que las clulas se asocian entre s
mediante capas de polisacridos que forman una pelcula que recubre la superficie
sobre la que se encuentran las clulas.
Los biofilms son muy importantes porque los microorganismos que los forman
resultan ms resistentes a antibiticos y al ataque de clulas del sistema inmune y,
por consiguiente, las infecciones que producen son ms difciles de tratar. La
presencia de biopelculas es un problema serio en los implantes ortopdicos,
catteres, etc. El sarro de los dientes es un ejemplo de biofilm.
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METODOLOGA
Para la realizacin de esta prctica se requieren los equipos materiales y
reactivos:
Con la ayuda de un baln aforado, preparar 10 ml de una solucin de
glucosa a una concentracin de: 8.8 mg/ml. Pasar a un tubo de ensayo y
marcar como: Tubo 1.
En una gradilla ubicar seis (6) tubos de ensayo con cinco (5) ml de agua
destilada cada uno; marcarlos como: tubo 2, tubo 3, tubo 4, tubo 5, tubo 6 y
tubo 7.
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Realizar diluciones sucesivas as: tomar 5 ml de la solucin de glucosa del
tubo 1 y adicionarlo al tubo 2; agitar y mezclar con la ayuda de un vortex.
De los diez mililitros del tubo 2, tomar cinco (5) ml y adicionarlo al tubo tres
(3), agitar y mezclar con ayuda de un vortex; esta accin se repite hasta el
tubo 7.
Las concentraciones esperadas se muestran en la tabla adjunta.
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En la celda de espectrofotmetro adicionar 1 ml de solucin del reactivo de
GOD POD; Introducir la celda en el equipo, y programar este a una longitud
de onda de 510 nm.
En la celda de espectrofotmetro con el reactivo adicionar 0.1 ml del
sustrato correspondiente al tubo uno (1), agitar rpidamente con ayuda de
la micropipeta e inmediatamente llevar a cero la absorbancia (digitar
blanco); e igualmente iniciar conteo del tiempo con ayuda de un
cronmetro. Ir tomando datos de la variacin de la absorbancia en el
tiempo.
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Repetir los numerales 2.9.5 y 2.9.6 con cada uno de los sustratos (Tubos de
ensayo del 2 al 7).
Los resultados anotarlos en la tabla adjunta.
Graficar concentracin de glucosa transformada a cido glucnico con
respecto al tiempo. La concentracin de glucosa transformada a cido
glucnico se puede determinar mediante la siguiente relacin: 0,320
Absorbancia equivale a 0,1 mg/ml de glucosa.
Con lo anterior determinar la actividad enzimtica de cada concentracin
(en total son siete 7 actividades)
Una unidad de actividad enzimtica (U) se puede establecer como: cantidad
de enzima necesaria para transformar un (1) mg de glucosa a cido
glucnico por minuto.
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Realizar una grfica de actividad enzimtica con concentracin de sustrato
y determinar
la Vmax y Km de la enzima Glucosa oxidasa.
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TABLAS DE RESULTADOS
Tabla de mediciones de cada una de las diferentes concentraciones de glucosa y la absorbancia obtenida en el
espectrofotmetro
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Calculo de concentracin de la Glucosa transformada en cido Gluconico
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TUBO No. 2
0.20000
0.15000
calculo de
concentracion
0.10000
0.05000
0.00000
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23
TUBO No. 1
0.10000
0.08000
calculo de
concentracion
0.06000
0.04000
0.02000
0.00000
1
9 11 13 15 17 19
Grficas de CONCENTRACION DE GLUCOSA
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TRANSFORMADA A CIDO GLUCNICO CON RESPECTO AL TIEMPO
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TUBO No. 4
0.35000
0.30000
0.25000
0.20000
0.15000
0.10000
0.05000
0.00000
calculo de
concentracion
10 30 50 70 80 100 120
TUBO No. 3
0.20000
0.15000
0.10000
0.05000
0.00000
calculo de
concentracion
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TUBO No. 6
TUBO No. 5
0.25000
0.25000
0.20000
0.15000
0.20000
calculo de
concentracion
0.15000
0.10000
0.10000
0.05000
0.05000
0.00000
0.00000
calculo de
concentracion
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TUBO No. 7
0.16000
0.14000
0.12000
0.10000
0.08000
0.06000
0.04000
0.02000
0.00000
calculo de
concentracion
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RESULTADOS Y ANLISIS DE LOS RESULTADOS
Con lo anterior determinar la actividad enzimtica de cada concentracin (en
total son siete 7 actividades) Una unidad de actividad enzimtica (U) se
puede establecer como: cantidad de enzima necesaria para transformar un
(1) mg de glucosa a cido glucnico por minuto.
Para ello Se determina la pendiente de cada grfica (Abs vs t). Nos dar cambio
en absorbancia por segundo. sta pendiente Absorbancia/ tiempo se usa para
calcular lacantidad de producto que se genera por segundo. La pendiente se
calcula de la parte donde se ve la parte de ascendencia rpida, a partir del tiempo
0.
No se toma en consideracin la parte donde las lecturas comienzan a
estabilizarse.
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Hallar U:
U= 0,0134 para 8,8 mg/ml de
glucosa
Tubo 2
0.20000
f(x) = 0.01x + 0.05
0.15000
calculo de
concentracion
Linear (calculo de
concentracion)
0.10000
0.05000
0.00000
0
10 15 20 25
Tubo 3
0.20000
0.15000
f(x) = 0x + 0.06
calculo de
concentracion
Linear (calculo de
concentracion)
0.10000
0.05000
0.00000
0 5 1015202530354045
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Tubo 4
0.40000
calculo de
concentracion
f(x) = 0x + 0.11
0.30000
Linear (calculo de
concentracion)
0.20000
0.10000
0.00000
0
50
100
150
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Tubo 5
0.25000
f(x) = 0x + 0.06
0.20000
0.15000
calculo de
concentracion
Linear (calculo de
concentracion)
0.10000
0.05000
0.00000
0
50 100 150 200 250
Tubo 6
0.25000
f(x) = 0x + 0.04
0.20000
0.15000
calculo de
concentracion
Linear (calculo de
concentracion)
0.10000
0.05000
0.00000
0
50 100 150 200 250
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Tubo 7
0.15000
f(x) = 0.01x + 0.02
0.10000
calculo de
concentracion
Linear (calculo de
concentracion)
0.05000
0.00000
0
10 12 14
Realizar una grfica de actividad enzimtica con concentracin de sustrato y
determinar la Vmax y Km de la enzima Glucosa oxidasa.
CURVA DE MICHAELIS-MENTEN
Sustrato (mg/mL)
0,2750
Velocidad
(mg/seg/ml)
0,001
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0,5500
1,1000
2,2000
4,4000
8,8000
0,0009
0,022
0,0041
0,0058
0,0134
16.0000
14.0000
12.0000
10.0000
8.0000
CURVA DE MICHAELIS-MENTEN Velocidad (mg/seg/ml)
6.0000
4.0000
CURVA DE MICHAELIS-MENTEN Sustrato (mg/mL)
2.0000
0.0000
1
Sustrato (mg/mL)
Velocidad
(mg/seg/ml)
9,4922E+17
1,89845E+18
3,79689E+18
7,59378E+18
1,51876E+19
3,03751E+19
1,66667E-05
0,000015
0,000366667
6,83333E-05
9,66667E-05
0,000223333
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Curva Michaelis-Menten
3.5000E+19
3.0000E+19
2.5000E+19
2.0000E+19
1.5000E+19
1.0000E+19
5.0000E+18
0.0000E+00
Sustrato (mg/mL)
CONCLUSIONES
Aprendimos a calcular el efecto de la concentracin inicial de sustrato sobre
la velocidad inicial de la reaccin
Conocimos cual es el comportamiento de la enzima en el proceso al
momento de su saturacion.
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BIBLIOGRAFA
Pea A. (2004). Bioqumica (2004), Editorial LIMUSA S.A de CV. Grupo Editores.
Mxico.
Benintende, S. & Sanchez, C. Crecimiento Bacteriano. UNER. Recopilado de:
http://www.fca.uner.edu.ar/academicas/deptos/catedras/microbiologia/unidad_3_cr
ecimiento_bacteriano.pdf
Sosa Romero M, Galviz Franco P. caracterizacin de la enzima glucosa oxidasa
(gox) (ec 1.1.3.4.) Libre e inmovilizada en dos soportes (alginato de Sodio y
agarosa) para la produccin de cido glucnico UNAD. Bogot. 2010.
http://www.slideshare.net/yordi189/cintica-enzimatica
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