ESTANCIAS

LICENCIATURA EN
CIENCIA Y
TECNOLOGA DE LOS
ALIMENTOS

UNIVERSIDAD DE CRDOBA | Sandra Pinto Gonzlez

LICENCIATURA EN
CIENCIA Y TECNOLOGA DE LOS ALIMENTOS
ESTANCIAS

ESTANCIAS
Laboratorio Agroalimentario Gmez-Beser

Sandra Pinto Gonzlez

UNIVERSIDAD DE CRDOBA
FACULTAD DE VETERINARIA
Licenciatura en Ciencia y Tecnologa de los Alimentos
2

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CIENCIA Y TECNOLOGA DE LOS ALIMENTOS
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NDICE
1.

Aspectos generales ..................................................................................... 4

1.1.

Laboratorio de Microbiologa ............................................................. 5

1.2.

Laboratorio Fsico qumico .............................................................. 6

1.3.

Laboratorio Enolgico......................................................................... 7

1.4.

Laboratorio Clnico ............................................................................. 8

2.

Actividades profesionales realizadas .......................................................... 9

2.1.

Elaboracin de medios de cultivo ....................................................... 9

2.2.

Anlisis de aguas ............................................................................... 14

2.2.1. Filtracin de aguas por membrana ................................................. 14

2.2.2. Lecturas .......................................................................................... 18
2.2.3. Confirmaciones .............................................................................. 19
2.2.4. Investigacin de Legionella en aguas ............................................ 22
2.3.

Anlisis de alimentos ........................................................................ 26

2.3.1. Microbiologa de alimentos ........................................................... 26

2.3.2. Lecturas .......................................................................................... 32
2.3.3. Confirmaciones .............................................................................. 33
2.3.4. Investigacin de Salmonella en alimentos ..................................... 35
2.3.5. Investigacin de Listeria monocytogenes en alimentos ................. 40
Bibliografa ......................................................................................................... 43

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1. Aspectos generales
Gmez-Beser es un laboratorio agoralimentario y de anlisis clnicos dotados de
la ms avanzada tecnologa para el anlisis de todo tipo de productos alimentarios
(materias primas, productos intermedios y productos terminados) y muestras clnicas.
Actualmente los Laboratorios cuentan con un equipo humano de profesionales
con diferente formacin pero complementaria, consiguiendo formar un equipo
multidisciplinar, capaz de dar respuesta a todas las demandas de todos los clientes.
Entre ellos se encuentran Bilogos, Tecnlogos de Alimentos, Farmacuticos,
Qumicos, Enlogos, tcnicos superiores en Medio Ambiente y Tcnicos superiores en
Anlisis Clnico.
Las muestras que se trabajan en el laboratorio y las tcnicas analticas que
emplean se centran en:
Anlisis microbiolgicos, fsico-qumicos y de aguas (alimentos)
Anlisis enolgicos
Anlisis de aguas y residuos
Anlisis clnicos
Anlisis de piscinas
Anlisis de tierras y residuos
Anlisis Legionella
Adems, consta de un equipo especializado que realizan consultora y asesora
tcnica tanto en productos como en procesos, para as dar una respuesta a los problemas
que la industria alimentaria encuentra en su produccin. Ofrecen:
Control de la Industria (Auditora e inspeccin)
Asesoramiento en Legislacin Tcnica alimentaria
Estudio de etiquetado de productos alimenticios
Diseo de fichas tcnicas de productos
Servicio de tramitacin ante la administracin
Estudios y Proyectos
Mejora de Rendimientos y Procesos
Implantacin de Sistemas de Calidad:
PGH (Planes Generales de Higiene)
APPCC (Anlisis de Peligros y Puntos de Control Crtico)
ISO 9000
ISO 2000
BRC

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Las instalaciones constan de varios laboratorios:

Laboratorio de Microbiologa
Laboratorio Fsico qumico
Laboratorio Enolgico
Laboratorio Clnico

1.1.

Laboratorio de Microbiologa

En esta rea se realizan determinaciones microbiolgicas sobre materias primas,

productos intermedios y productos terminados. Las determinaciones que se realizan
abarcan todo el espectro de determinaciones microbiolgicas que legislativamente se
exige a los distintos sectores.
Este laboratorio realiza determinaciones microbiolgicas basadas en los mtodos
oficiales y/o mtodos recomendados por organismos internacionales.
La organizacin del laboratorio cuenta con una distribucin diferenciada en
zonas de preparacin y zonas limpias, sin cruces de lneas y con departamentos estancos
que aseguran, junto con los sistemas de calidad que se siguen, la calidad de los
resultados.
La profesionalidad y capacidad tcnica de los Laboratorios Gmez-Beser son
ratificadas por la Entidad Espaola Nacional de Acreditacin (ENAC), una prestigiosa
credencial que avala la calidad de los servicios.
Las determinaciones que se realizan son las siguientes:

Aguas

Recuento de aerobios a 37 C
Recuento de aerobios a 22 C
Recuento de Coliformes totales
Recuento de Coliformes fecales
Recuento de Clostridium perfringens
Recuento de Clostridium sulfito reductores
Recuento de E. Coli
Investigacin de E. Coli
Recuento de Estafilococos aureus
Investigacin de Estafilococos aureus
Recuento de Estreptococos fecales
Deteccin y recuento de Legionella pneumophila
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Recuento de Pseudomona aureginosa

Investigacin de Salmonella spp.
Recuento de nematodos/ huevos de nematodos

Alimentos

1.2.

Recuento de Aerobios mesfilos

Recuento de Aerobios psicotrficos
Recuento de Clostridium sulfito reductores
Recuento de Clostridium perfringens
Recuento de Coliformes fecales
Recuento de Coliformes totales
Recuento de Enterobacterias
Recuento de E. Coli
Investigacin de E. Coli
Recuento de Estafilococos aureus
Investigacin de Estafilococos aureus
Recuento de Levaduras
Recuento de Mohos
Recuento de Mohos y Levaduras
Recuento de Listeria monocytogenes
Investigacin de Listeria monocytogenes
Recuento de Pseudomona aureginosa
Investigacin de Salmonella
Investigacin de Shigella

Laboratorio Fsico qumico

Este laboratorio est altamente especializado, y cuenta con un alto nmero de

determinaciones sobre productos alimenticios, entre las que se encuentran:

Composicin nutricional
Estudios de caducidad
Estudios de potabilidad del agua
Caracterizaciones fsicas
Composicin qumica
Estudio de vinos y vinagres
Caracterizacin de sales
Elaboracin fichas tcnicas de producto
Anlisis de aguas residuales
Caracterizaciones fsicas
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Entre los equipos disponibles encontramos:

-

1.3.

Cromatografa Inica
Cromatografa de Gases
Espectrofotometra de Absorcin Atmica
Espectrofotometra molecular: Visible y UV

Laboratorio Enolgico

La empresa cuenta con un equipo de enlogos de reconocida experiencia en las

reas de anlisis enolgicos, seguimiento de vendimias, asesora enolgica, y anlisis
sensorial.
Las determinaciones que se realizan son las siguientes:

Vino y vinagre

Extracto seco
Cenizas
Masa volmica
Nitrgeno
Densidad
pH
Plomo
Protenas

Hierro
Cobre
Acidez total (actica)
Grado alcohlico
Anhdrido sulfuroso
Relacin extracto seco /
acidez total
Metanol

Bebidas alcohlicas

Acidez voltil
Acidez total
cido ascrbico
cido ctrico
Anhdrido sulfuroso
Arsnico
Azcares
Cadmio
Calcio
Cenizas
Cloruros
Densidad

Extracto seco
Grado alcohlico
Hierro
pH
Plomo
Sacarosa
Ferrocianuro
Cobre
Nitrgeno fcilmente
asimilable
cido mlico
IP

1.4.

Abs. 280nm
BE
Tartrico
Lctico

Metanol
Succnico
Actico

Laboratorio Clnico

En los ltimos aos, los laboratorios han ido adaptndose a los avances
cientficos procurando incorporar la tecnologa de vanguardia y someterse a los
controles de calidad nacionales en internacionales, as como las BPL (Buenas Prcticas
de Laboratorio) en las instalaciones.
En esta estancia, se realizan anlisis de sangre y orina gracias al trabajo de ATS,
Tcnicos de Laboratorio y administrativos, que garantizan la calidad de los servicios
analticos.

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2. Actividades profesionales realizadas

2.1.

Elaboracin de medios de cultivo

Un medio de cultivo es un material alimenticio que se usa en el laboratorio para

el desarrollo de los microorganismos. Una vez que ha sido preparado, un medio de
cultivo puede ser inoculado, es decir, se la aaden organismos, y a continuacin,
incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano. El crecimiento de
los microorganismos es el cultivo.
Los medios de cultivo deben contener los nutrientes y factores de crecimiento
necesarios, y deben estar exentos de cualquier microorganismo contaminante.

En la siguiente tabla, podemos observar los diferentes medios que se utilizan en

el laboratorio y sus caractersticas.

Medio de cultivo

g/L

Estado

Utilidad

pH

Rappaport

76 g/L

Lquido

Enriquecimiento
Salmonella/Shigella (S/S)

7.3-7.7

MKTTN

26.8 g/L

Lquido*

Eniquecimiento S/S

7.4-7.8

XLD
(xilosa, lisina y
desoxicolato)

56.68
g/L

Slido

Crecimiento S/S

7.2-7.6

S/S
(Salmonella/Shigella)

63.1 g/L

Slido

Crecimiento S/S

7.2-7.6

Caldo cerebro corazn

37 g/L

Lquido

Baird Parker (BP)

58 g/L

Slido*

Verde Brillante

40 g/L

Lquido

VRB

38 g/L

Slido

TSA
(Trypticase soja agar)

40 g/L

Slido

Caldo Triptfano

16 g/L

Lquido

TTC
(Cloruro trifenil
tetrazolio)

56 g/L

Slido

Confirmacin
Staphylococcus aureus
(S.A.)
Crecimiento S.A.
Confirmacin de Coliformes
totales (CT)
Crecimiento CT
Confirmacin CT y E. Coli
en aguas
Confirmacin CT y E. Coli
en aguas
Crecimiento CT y E. Coli en
aguas
9

7-7.4
7-7.4
7.2-7.6
7.2-7.6
7.1-7.5
7-7.4
7-7.4

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TBX
(Tryptone Bile Agar)
EMB
(Eosina azul metileno)

36.5 g/L

Slido

Crecimiento Escherichia
Coli (E. Coli)

7-7.4

39.5 g/L

Slido

Confirmacin E. Coli

6.7-7.1

VRBG

39.5 g/L

Slido

Agar prpura

41.5 g/L

Slido

Crecimiento de
Enterobacterias (EB)
Confirmacin EB

Agua de peptona

20 g/L

Lquido

Crecimiento de bacterias

7-7.4

Agar nutritivo

28 g/L

Slido

7.2-7.6

YEAST

20g/L

Slido

17.5 g/L

Slido

Relacin
1:1

Slido

Resiembra para aislamiento

Crecimiento de Aerobios
Mesfilos en aguas
Crecimiento de Aerobios
Mesfilos en alimentos
Crecimiento de Aerobios
Mesfilos en lcteos

SB
(Slanetz y Bartley)

43.4 g/L

Slido

Crecimiento Enterococos
intestinales para pozos

6.8-7.2

m-CP
(medio Clostridium
Perfringens)

35.5 g/L

Slido*

Crecimiento Clostridium
perfringens para pozos

7.2-7.8

DG18
(Dichloran Glicerol)

31.7 g/
820mL

Slido*

Crecimiento de Mohos y
Levaduras

5.4-5.8

OGYEA
(Sabouraud
Oxitetraciclina)

37 g/L

Slido

Crecimiento de Mohos y
Levaduras

6.8-7.2

Slido*

Crecimiento Pseudomona
aeruginosa

7-7.4

Slido

Crecimiento Estreptococos
fecales

6.8-7.2

Slido

Crecimiento Clostridium
sulfito reductor

6.8-7.2

Slido

Crecimiento Clostridium
sulfito reductor

6.8-7.2

Slido

Confirmacin Enterococos
intestinales

6.8-7.2

PCA
(Plate count agar)
PCA + LD
(Leche descremada)

CET
45.3 g/L
(Agar Cetrimida)
KAA
(Kanamicina, esculina,
48 g/L
azida)
SPS
(Sulfito Sulfadiazina
41.3 g/L
plimixina)
TSC
(Agar Triptosa-Sulfito45 g/L
Cicloserina)
BE
64.5 g/L
(Bilis Esculina)
(* Medios que tienen suplemento)

10

7.2-7.6
6.8-7.2

6-6.4
6.8-7.2
6.7-7

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El fundamento de la actividad es la preparacin de los medios de cultivo y

reactivos aspticos con las caractersticas fisicoqumicas adecuadas que permiten el
crecimiento de los microorganismos a investigar.
La realizacin de medios es similar para los distintos tipos, exceptuando
aquellos marcados con un asterisco, los cules precisan la adicin del suplemento
correspondiente, indicado por el fabricante, durante o tras su elaboracin.

Material:
-

Probeta de 1 litro
Matraces Erlenmeyer de 1 litro
Bao mara
Balanza analtica
Agitador
Algodn
Imanes
Botes de 200 y 500 mL

- Cinta testigo para autoclave

- Placas Petri estriles
desechables
- Reactivos para el medio de
cultivo
- Mecheros Bunsen
- Tubos estriles
- pHmetro

Equipo:
- Autoclave

Procedimiento:
1. En la probeta, medir 1 litro de agua destilada y aadirla al matraz.
Colocar en el bao mara para aumentar su temperatura. Esto facilitar tanto la
disolucin del medio, como el posterior estado de ebullicin con el que deben
concluir.
2. Pesar los reactivos necesarios para preparar 1 litro de medio (cantidad
indicada por el fabricante). Verter el contenido en el matraz con agua destilada,
colocado sobre un agitador con un imn en su interior con el fin de disolver y
homogeneizar el medio.
3. Tapar el matraz con algodn para evitar la evaporacin del agua. Una vez
homogeneizado, se coloca en un calefactor, donde estar en continua agitacin hasta
alcanzar el estado de ebullicin, que ser el estado donde daremos por acabada la
preparacin del medio.

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Para los medios sealados con un asterisco (*), una vez llegado al estado de
ebullicin, se le aade el suplemento adecuado:
- Para m-CP: suplemento especfico del medio.
- Para DG18: Glicerina.
- Para CET: Glicerina.
- Para BP: Yema de huevo con telurito.
- Para MKTTN: suplemento especfico del medio.
4. Tras retirar el Erlenmeyer del calefactor, se extrae el imn con ayuda de
otro imn y, antes de verter el medio en los botes donde se conservarn, se
introducen dos muestras del medio en dos tubos estriles, donde uno se utilizar para
medir el pH del medio, y el otro para, posteriormente, esterilizar e incubar en la
estufa, con el fin de comprobar que el medio est totalmente estril.
Verter en los botes; para medios slidos se emplearn botes de 200 ml, y para
medios lquidos botes de 500ml. Posteriormente, se pega un trozo de cinta de testigo
para autoclave, y se rotulan con la siguiente informacin:
- Nombre del medio, por ejemplo: BP.
- Lote: n de la semana del ao, y ao de la realizacin del medio. Por
ejemplo: L29/13.
- Fecha de caducidad: Siendo sta para los medios lquidos 3 meses desde
su elaboracin, y para los medios slidos 2 meses tras su preparacin.
Por ejemplo: 20/09/13
5. Preparados los tarros, se colocan en las canastas del autoclave para
esterilizarlos a 121C durante 20 minutos.
6.

Una vez terminado el autoclave, se secan y se espera que se atemperen.

7. Para mantener las condiciones aspticas, se debe trabajar prximo a la

llama de un mechero Bunsen. Se vierte el medio en placas Petri estriles, siguiendo
la tcnica asptica, y se espera a que solidifiquen.
8. Una vez slidas, se etiquetan con el tipo de medio, lote y fecha de
caducidad, que en el caso de las placas, la duracin mxima es de un mes.
9.

Guardar en la cmara frigorfica para su almacenamiento.

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Adems de los medios de cultivo que se realizan en el laboratorio, existen otros

especficos y reactivos que llegan directamente preparados, como son:
-

Caldo One: para enriquecimiento de Listeria.

Placas de Brillance: para el crecimiento de Listeria.
Kit Microbat: para la confirmacin de Listeria.
Placas de GVPC: para el crecimiento de Legionella.
Placas de BCY y BCYE: para el protocolo de confirmacin de
Legionella.
Placas de agar sangre de cordero: para el protocolo de confirmacin de
Legionella.
Kit de confirmacin de Legionella.
Plasma de conejo (Coagulasa test): polvo liofilizado con suero que se
reconstituye y se utiliza para la confirmacin de Staphylococcus aureus.
Reactivo oxidasa.
Enterotube: para la confirmacin de Salmonella.

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2.2.

Anlisis de aguas
2.2.1. Filtracin de aguas por membrana

La tcnica de filtracin por membrana (MF) se basa en hacer pasar la muestra de

agua problema a travs de un filtro de membrana microporosa, en cuya superficie
quedan retenidos los microorganismos.
Para el anlisis de aguas de pozos, de piscinas y potabilidades, se utilizan filtros
que tienen un tamao de poro de 0.45 micras, ya que la mayora de microorganismos
tienen un tamao (dimetro) superior. Para el anlisis de aguas con posible Legionella y
aquellas con posible Clostridium perfringens en aguas de pozo, se usan filtros ms
pequeos, de 0.22 micras.
La normativa para abastecimiento y control de calidad de agua potable de
consumo pblico, establece como anlisis microbiolgicos a realizar, las
determinaciones de: coliformes totales, coliformes fecales, y Estreptococos fecales. El
nmero de determinaciones se establece segn el tipo de anlisis, ya sea mnimo o
completo.
Tambin se determinar Stapyilococcus aureus, Pseudomonas, Clostridium
perfringes y Enterococos intestinales.
Para cada una de estas determinaciones, se filtrarn 100 ml de agua. Para el
anlisis de aguas con posible Legionella, la filtracin ser de 1 litro de agua.

Material:
-

Recipiente estril para toma de muestras con capacidad de 100 ml.

Sistema de filtracin y fuente de vaco.
Membranas de filtracin de 0.45 micras de dimetro de poro.
Pinzas de acero con bordes biselados.
Placas Petri.
Mechero Bunsen.
Placas con medios de cultivo necesario.

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Procedimiento:
Para realizar la filtracin de aguas por membrana utilizaremos un mechero
Bunsen para trabajar en condiciones estriles.
1. Limpiar con alcohol la superficie del portafiltros. Para ello, vertemos alcohol
en el portafiltros y flameamos con el mechero Bunsen.
2. Colocar un filtro de membrana sobre el soporte con la ayuda de unas pinzas
de acero previamente flameadas con alcohol.
3. Situar un recipiente estril sobre el soporte hasta que est fijo.
4. Verter 100 ml del agua problema en el recipiente, y aplicar el vaco hasta
que el lquido se haya filtrado.
5. Romper el vaco y extraer el recipiente. Con las pinzas flameadas el filtro del
soporte.
6. Se coloca el filtro dentro de una plaza Petri sobre el medio de cultivo
adecuado, con la cuadrcula hacia arriba, procurando que no se formen
burbujas entre la membrana y el medio de cultivo.
7. Las placas se incuban en posicin invertida en la estufa con la temperatura
adecuada.

Proceso de filtracin de aguas

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Anlisis completo de agua de piscinas

El anlisis completo de aguas de piscina abarca la determinacin de los
siguientes microorganismos:

Microorganismos a
analizar
Aerobios mesfilos a
37C

Medio de Crecimiento

Temperatura
de incubacin

Tiempo de
incubacin

1 ml de agua en placa Petri

y se emplaca con YEAST

37C

48 horas

Coliformes totales

Filtro en placa de VRB

30C

24 horas

Coliformes fecales

Filtro en placa VRB

44.5C

24 horas

Staphylococcus aureus

Filtro en placa de BP

37C

48 horas

Pseudomonas

Filtro en placa de CET

37C

48 horas

Estreptococos fecales

Filtro en placa de KAA

37C

48 horas

Anlisis mnimo de agua de piscinas

Para el anlisis mnimo de las aguas de piscina, se realizan las mismas
determinaciones exceptuando la de Estreptococo fecal.

Microorganismos a
analizar
Aerobios mesfilos a
37C

Medio de Crecimiento

Temperatura
de incubacin

Tiempo de
incubacin

1 ml de agua en placa Petri

y se emplaca con YEAST

37C

48 horas

Coliformes totales

Filtro en placa de VRB

30C

24 horas

Coliformes fecales

Filtro en placa VRB

44.5C

24 horas

Staphylococcus aureus

Filtro en placa de BP

37C

48 horas

Pseudomonas

Filtro en placa de CET

37C

48 horas

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Anlisis de potabilidad en aguas de consumo humano

Para el anlisis de aguas de consumo humano, slo se estudian dos parmetros:

Microorganismos a
analizar
Coliformes totales y
Escherichia coli

Medio de Crecimiento

Temperatura
de incubacin

Tiempo de
incubacin

Filtro en placa TTC

37C

24 horas

Anlisis de aguas de pozo

Para el anlisis de aguas de pozo se realizan las siguientes determinaciones.

Microorganismos a
analizar
Aerobios mesfilos a
22C

Medio de Crecimiento

Temperatura
de incubacin

Tiempo de
incubacin

1 ml de agua en placa Petri

y se emplaca con YEAST

22C

48 horas

Clostridium
perfringens

Filtro de 0.22 micras en

placa de m-CP

44.5C en
campana de
anaerobiosis

24 horas

Filtro en placa SB

37C

48 horas

Filtro en placa de TTC

37C

24 horas

Enterococos
intestinales
Coliformes totales

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2.2.2. Lecturas
Transcurrido el tiempo de incubacin a la temperatura indicada, se procede a las
lecturas.

Lecturas

Colonias caractersticas

Aerobios mesfilos

Todas aquellas que crezcan, excepto

aquellas que lo hagan en la superficie

Coliformes totales

Colonias rosas, normalmente con forma de

elipse con precipitado alrededor

Coliformes fecales

Colonias rosas/rojas con precipitado

alrededor

Staphylococcus aureus

Colonias negras con halo blanco alrededor

Pseudomonas

Colonias claras con reflejo verdoso,

fluorescentes bajo la aplicacin de luz UV

Estreptococos fecales

Colonias negras y medio cambiado a color

negro

Clostridium sulfito reductor

Colonias negras y produccin de gas

(medio roto y/o elevado)

Coliformes totales y E. coli

Colonias amarillas/naranjas siendo

apreciable su color por debajo de la
membrana

Clostridium perfringens

Colonias normalmente de color amarillo

opaco o prpuras

Enterococos intestinales

Colonias rojas, marrones o rosadas

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2.2.3. Confirmaciones
Si hay presencia de alguna colonia sospechosa en las lecturas realizadas, se
procede a las confirmaciones.

Confirmacin de Coliformes totales

Se siembra una colonia tpica en un tubo de verde brillante con campana de
Durham, y se incuba a 30C durante 24 horas. Si al cabo de ese tiempo aparece gas en la
campana y el lquido tiene un aspecto turbio, se concluye que la muestra es positiva en
Coliformes totales.

Confirmacin de Coliformes fecales

Se siembra una colonia tpica un tubo de verde brillante con campana de
Durham y se incuba a 44.5C durante 24 horas. Tambin se siembra una colonia tpica
en una placa de Agar Nutritivo (AN), y se incuba a 37C durante 24 horas. Al cabo de
ese tiempo si aparece gas y turbidez en el tubo de verde brillante, y negativo en el test
oxidasa de la placa AN, diremos que el resultado es positivo en Coliformes fecales.
Para realizar el test oxidasa, se toman colonias de la placa de agar nutritivo con
un asa de siembra, y se aaden a un papel de filtro. Posteriormente se le echa una gota
de oxidasa, si la colonia se tie de azul, se dice que es positivo en el test oxidasa, y
negativo en Coliformes fecales. En cambio, si no se produce cambio de color, sera
oxidasa negativo y habra que pasar las colonias a un tubo de verde brillante para
confirmar la presencia de Coliformes fecales.

Confirmacin de Staphyloccus aureus

Se siembra una colonia tpica (negra con halo) en un tubo estril con 3 ml de
Caldo Cerebro-Corazn y se incuba a 37C durante 24 horas. Transcurrido ese tiempo,
se echa en un tubo de hemlisis 0.1 ml del tubo anterior y se adicionan 0.3 ml de
Plasma de Conejo (Coagulasa test), y se incuba durante 24 horas a 37C. Se considera
resultado positivo en Staphylococcus aureus cuando se observa coagulacin en el tubo
de hemlisis.

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Confirmacin de Pseudomonas
Si al aplicar la luz UV en la placa se observan colonias claramente fluorescentes,
se dice que el resultado es positivo en Pseudomonas.

Confirmacin de Estreptococos fecales

Se siembra el filtro en una placa de KAA, y se incuba a 37C durante 24 horas.
Si el medio se tie de negro y aparecen colonias negras, el resultado ser positivo para
Estreptococos Fecales.

Confirmacin de Coliformes totales y Escherichia coli

Se siembra una colonia tpica (amarillas/naranjas que clarean tras la membrana)
en placa de TSA incubndola a 37C durante 24 horas.
Transcurrido este tiempo, se realiza el test oxidasa a la masa de crecimiento
presente en la placa TSA. Se cogen algunas colonias de la placa TSA con ayuda de un
asa de siembra estril, y se pasan a un papel de filtro. Se le aade una gota oxidasa y se
observa si se produce un cambio de color instantneo o no.
Si el resultado es oxidasa positivo (las colonias se tien de azul), se concluye
que es negativo para Coliformes totales y y E. coli, acabando aqu la confirmacin. En
cambio, si es negativo en el test oxidasa (no cambian de color) se procede a la siguiente
confirmacin. Para ello, se toman colonias de la placa TSA con el asa de siembra, y se
pasan a un tubo con 3 ml de Caldo triptfano, que se incuba a 44.5C durante 24 horas.
Pasadas las 24 horas de incubacin, se realiza la prueba del indol al tubo de
caldo triptfano aadiendo 0.2-0,3 ml de reactivo de Kovacs (un par de gotas con la
pipeta Pasteur). Si se forma un anillo amarillo, el resultado es negativo en E. coli; pero
si el anillo formado es de color rojo, se concluye que es positivo en E. coli.

Confirmacin de Clostridium Perfringens

Se exponen las colonias presentes a vapores de amonio dentro de la campana de
extraccin de gases. Si se aprecia que el color de las colonias pasa de prpura a azul, o
de amarillo a rojo, estaremos hablando de resultado positivo en Clostridium
Perfringens.

20

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ESTANCIAS

Confirmacin de Enterococos intestinales

Se pasa el filtro de la placa SB a una placa de BE (Bilis Esculina), y se incuba a
37C durante 24 horas. Si aparecen colonias marrones/negras y el medio se tie a esta
tonalidad, se concluye que es positivo en Enterococos intestinales.

Los Aerobios mesfilos no precisan confirmacin.

21

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ESTANCIAS

2.2.4. Investigacin de Legionella en aguas

Las bacterias del gnero Legionella estn muy extendidas en la naturaleza,
especialmente en los ambientes acuticos naturales. El problema radica en su facilidad
para colonizar los sistemas de agua caliente sanitaria, los sistemas de refrigeracin, los
humidificadores y otros sistemas de conduccin de aguas, a partir de los cuales es capaz
de infectar al hombre y ocasionarle trastornos respiratorios, bien por cuadros
neumnicos graves conocidos como la enfermedad del legionario, o bien por procesos
febriles leves denominados fiebre de Pontiac.

Material:
-

Recipiente estril para toma de muestras (250 ml)

Sistemas de filtracin y fuente de vaco
Membranas de filtracin de 0.22 micras de dimetro de poro
Pinzas de acero con bordes biselados
Mechero Bunsen
Tubos estriles
Pipetas automticas de 1 ml
Pipetas manuales de 10 ml
Agua esterilizada
Agitador Vortex
Placas de GVPC
Asas de siembra estriles

Procedimiento:
Para realizar la filtracin de aguas por membrana utilizaremos un mechero
Bunsen para garantizar las condiciones estriles.

1. Limpiar con alcohol la superficie del portafiltros.

2. Colocar un filtro de membrana de 0.22 micras de dimetro de poro sobre el
soporte, con la ayuda de unas pinzas de acero previamente flameadas con
alcohol.
3. Situar un recipiente estril de 250 ml sobre el soporte hasta que est fijo.

22

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ESTANCIAS

4. Verter la muestra de agua problema en el recipiente (250 ml), y aplicar vaco

hasta que el lquido se haya filtrado. Esa operacin se debe repetir 4 veces
hasta filtrar 1 litro del agua problema a travs del mismo filtro.
5. Una vez terminado el proceso de filtracin, se prepara un tubo estril con 10
ml de agua esterilizada usando una pipeta manual de 10 ml.
6. Romper el vaco y extraer el recipiente. Con las pinzas flameadas y con
ayuda de un asa estril, se enrolla el filtro y se introduce en el tubo de ensayo
con el agua estril. La membrana se debe limpiar filtrando leja (sin aadir
ningn filtro), con el fin de destruir el microorganismo sen el caso de que lo
hubiera, y evitar que contamine futuros filtros.
7. Agitar el tubo que contiene el filtro durante 2 minutos en el agitador Vrtex.
8. Sembrar 0.1 ml del tubo en una placa preparada de GVPC con una pipeta
automtica, y realizar una siembra masiva, ya que se trata de una
investigacin para ver presencia o ausencia.
9. La placa se incuba en posicin invertida en la estufa a 37C durante 10 das.

Existen otras tcnicas de investigacin como son las tcnicas de acidificacin y

trmica, pero no se emplean en el laboratorio Gmez-Beser.

Microorganismo a
investigar

Medio de
crecimiento

Temperatura de
incubacin

Tiempo de
incubacin

Legionella

Siembra masiva en
placa de GVPC

37C

10 das

23

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ESTANCIAS

Lectura de Legionella
Las lecturas se realizan desde el tercer o cuarto da hasta el final de la
incubacin. Las colonias tpicas de Legionella son colonias blancas con un halo ms
claro alrededor.
En el caso de que las colonias sean sospechosas, se proceder a su confirmacin.

Confirmacin de Legionella
La placa de GVPC se divide en 3 cuadrantes, nombrndolas como A, B y C.
Se atemperar una placa de BCY (sin cistena) y otra de BCYE (con cistena), y
se dividirn tambin en 3 cuadrantes, nombrndolos de la misma manera.
Posteriormente, con ayuda de un asa estril, se toman varias colonias del
cuadrante A de la placa de GVPC y se siembran en el cuadrante A de la placa BCY. A
continuacin, se realiza lo mismo con la placa BCYE, y as con el resto de cuadrantes.
Una vez sembradas las placas, se introducen en la estufa de 37 C durante 4 das.
Transcurrido ese tiempo, debe observarse que en la placa BCYE ha habido
crecimiento, y en la de BCY hay ausencia de ste. Si es as, es posible que sea
Legionella y se procedera a la siguiente confirmacin.
Si no se ha producido crecimiento en ninguna placa, o lo ha habido en todas, se
descarta la posibilidad.
En el caso de sospecha de Legionella, se efecta la confirmacin con un kit
comercial de confirmacin de Legionella, que se basa en la aglutinacin del ltex.

El Kit de confirmacin est compuesto por:

-

DR801: Reactivo para la prueba de Legionella pneumophila, serogrupo 1.

DR802: Reactivos para la prueba de Legionella pneumophila, serogrupos
2-14.
DR803: Reactivos para la prueba de especies de Legionella.
DR804: Suspensin de control positivo.
DR805: Suspensin de control negativo.
DR806: Suspensin de Ltex, similar al antgeno de Legionella.
Suspensin Tampn (diluyente) y Tarjetas de Reaccin o de
Aglutinacin.

24

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CIENCIA Y TECNOLOGA DE LOS ALIMENTOS
ESTANCIAS

Procedimiento:
1. En una tarjeta de aglutinacin, se vierte una gota de suspensin tampn y
una gota de Legionella ltex en cada uno de los crculos numerados de la
tarjeta.
2. Posteriormente, en el crculo nmero 1 se aadir una gota de control
positivo, y en el crculo 2, una gota de control negativo. Si se observa que en
el crculo nmero 1 se produce un precipitado, ausente en el crculo 2, se
interpreta que es Legionella positivo.
3. A continuacin, se coge una colonia de la placa BCYE con ayuda de un asa
estril, y se mezcla con los reactivos vertidos anteriormente en los crculos 3,
4, 5 y 6.
4. Se tomarn como Legionella positivo aquellos crculos que, tras mezclarlos
con la colonia a investigar, aparece aglutinacin.

25

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CIENCIA Y TECNOLOGA DE LOS ALIMENTOS
ESTANCIAS

2.3.

Anlisis de alimentos
2.3.1. Microbiologa de alimentos

La microbiologa en alimentos es una actividad con la que se pretende averiguar

si el alimento est contaminado.

Material:
-

Mechero Bunsen
Agua de peptona
Probeta de 100 ml
Bolsas estriles Stomacher
Balanza analtica
Hojas de bistur
Depresores estriles

Pipeta automtica de 1 ml
Pipeta manual de 10 ml
Asas estriles
Tubos de ensayo estriles
Placas preparadas de Baird
Parker y DG18

Equipos:
- Campana de flujo laminar
- Homogeneizador Stomacher

Procedimiento:

1. Por legislacin, las muestras se deben preparar con 25 g de muestra y 225 ml

de agua de peptona, de manera que la proporcin sea de 1:10. En el
laboratorio, para mantener la proporcin 1:10, se toman 5 gramos del
alimento a analizar, y se le aaden 45 ml de agua de peptona. Antes de
comenzar la homogeneizacin de alimentos, se debe crear un ambiente
estril encendiendo un mechero Bunsen. Posteriormente, se coloca la bolsa
de Stomacher sobre la balanza, dejando la apertura hacia arriba y se fija
mediante un adhesivo. En ese momento, la balanza debe ser tarada.

26

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ESTANCIAS

2. Con ayuda de un depresor estril y una hoja de bistur si fuera necesario, se

toman 5 g de muestra y se vierten en la bolsa de Stomacher. A continuacin,
se aaden 45 ml de agua de peptona con ayuda de una probeta esterilizada.

3. Seguidamente, se mezcla el agua de peptona con el alimento y se introduce

durante varios segundos en el homogeneizador Stomacher. ste es un
sistema de palas con movimientos peristlticos que homogeniza la muestra.

4. Una vez homogeneizado, se saca la bolsa y se prepara para realizar la

microbiologa.
La microbiologa de alimentos se realiza en la campana extractora, con la
luz y el flujo laminar encendidos, con el fin de crear un ambiente estril para
la siembra.

5. Se llenan tubos estriles con 9 ml de agua de peptona para realizar las

posteriores diluciones. Se precisarn tantos tubos como diluciones haya que
efectuar.

Las determinaciones y diluciones que hay que realizar varan segn el grupo de
alimentos al que pertenece la muestra.

Grupos

Determinaciones

Diluciones

A (alimentos fros)

AM, CT, EC, SA, SAL, LIST

10-3

B (alimentos calientes)

AM, CT, EC, SA, SAL, LIST

10-2

Dulce

EC, SA, S/S, CSR, MyL, LIST

Pan, harina y picos

AM, EC, S/S, MyL

10-4

Pescado crudo

AM, EB, S/S, LIST

10-4

Pescado cocido

AM, EB, SA, S/S, LIST

10-3

Seco-salado

AM, EB, S/S, LIST

Molusco bivalvo

CF, EC, SAL

Conserva

AM, CSR, CP

Fruta / Verdura

EC, SAL, LIST

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ESTANCIAS

Productos aperitivos

EB, SA, EF, SAL

Preparados crnicos

EC, SAL, LIST

10-4

Carne cruda

EC, S/S, LIST

10-4

Huevos

AM, EB, SA, SAL

10-4

Helados

AM, EB, SA, SAL, LIST

Especias

EC, CSR, SAL, LIST

AM = Aerobios mesfilos

S/S = Salmonella/Shigella

CT = Coliformes totales

SAL = Salmonella

EC = Escherichia coli

LIST = Listeria

SA= Staphylococcus aureus

CSR = Clostridium sulfito reductor

CP = Clostridium perfringens

MyL = Mohos y levaduras

El nmero del exponente en las determinaciones indica en nmero de

diluciones que se deben realizar.
Las diluciones necesarias se calculan a partir del nmero de microorganismos
que suele tener cada alimento. Se realizan diluciones para facilitar el recuento
posterior; de esta forma, multiplicando por el nmero de dilucin en el que se
realiza la lectura de microorganismos en placa, se calcula el nmero total de
bacterias que tiene la muestra de alimento.

6. Las disoluciones se realizan de la siguiente forma:

- Para la dilucin de 10-1, se toma 1 ml directamente del contenido de la
bolsa Stomacher (dilucin -1) y se vierte en una placa Petri estril.
-

Para la dilucin de 10-2, se vierte 1 ml del contenido en la bolsa

Stomacher a un tubo con 9 ml de agua de peptona (dilucin -2), se agita
en el agitador Vrtex, y se pipetea 1 ml de este tubo a una placa Petri
estril.

Para la dilucin de 10-3, se coge 1 ml del tubo anterior (disolucin 10-2) y

se aade a otro tubo con 9 ml de agua de peptona (dilucin -3), se agita
en el Vrtex, y se vierte 1 ml de este tubo a una placa Petri estril.

28

LICENCIATURA EN
CIENCIA Y TECNOLOGA DE LOS ALIMENTOS
ESTANCIAS

Para la dilucin de 10-4, se toma 1 ml del tubo anterior (disolucin 10-3) y

se aade a otro tubo con 9 ml de agua de peptona (dilucin -4), se agita
en el agitador Vrtex, y se vierte 1 ml de este tubo a una placa de Petri
estril.

Para la determinacin de Staphylococcus aureus (SA), se toma 0.1 ml de

la dilucin 10-1 (directamente de la bolsa Stomacher), y se aaden a una
placa de Baird Parker ya preparada. Se realiza siembra masiva con ayuda
de un asa estril. Normalmente, la placa de BP se divide en 2 mitades
para sembrar 2 alimentos distintos.

Para la determinacin de Clostridium sulfito reductor, se toma 1 ml de la

dilucin de la bolsa Stomacher y se vierte a un tubo estril.
Posteriormente, se aaden 9 ml de medio de cultivo SPS, y una capa de
parafina para proporcionarle condiciones de semi-anaerobiosis.

Para la determinacin de mohos y levaduras se emplearn diferentes

medios de cultivo, en funcin de la actividad de agua del alimento. Para
aquellos con una aw menor a 0.6, se toma 1 ml de dilucin directamente
de la bolsa Stomacher y se aade a una placa de Petri estril, y
posteriormente se le aadir el medio necesario. Para los alimentos con
una aw entre 0.6 -0.95, se toma 0.1 ml de la dilucin de la bolsa, y se
hace siembra masiva en una placa ya preparada de DG18, con ayuda de
un asa estril.

Para la determinacin de Estreptococos fecales (EF), se siembra 1 ml de

la dilucin de la bolsa Stomacher en placas ya preparadas de KAA. Con
ayuda de un asa estril, se realiza siembra masiva.

La determinacin de Salmonella se realiza tras haber incubado la bolsa

de Stomacher a 37C durante 24 horas. El proceso de investigacin de
Salmonella se explicar detalladamente ms adelante.
29

LICENCIATURA EN
CIENCIA Y TECNOLOGA DE LOS ALIMENTOS
ESTANCIAS

La determinacin de Listeria se realiza tras haber incubado la bolsa

Stomacher a 30C durante 24 horas. Este procedimiento se explicar
posteriormente.

7. Una vez preparadas las placas con las diluciones necesarias, se le

adiciona a las placas los medios de cultivo correspondientes, que deben ser
previamente derretidos. Para el vertido de los medios de cultivo en las
placas, se debe continuar trabajando en condiciones estriles, ya sea en la
campana de extraccin, o prximo a la llama de un mechero Bunsen.
Previamente, los medios de cultivo se introducen en el bao mara para que
se derritan. Es importante esperar a que stos se atemperen antes de verterlos
en las placas. Ya que si estn demasiado calientes, pueden ocasionar la
destruccin de los posibles microorganismos que estamos investigando.
Una vez atemperados los medios, se aaden a las placas correspondientes. Se
vierte el medio de forma que cubra la base de las placas Petri. Se agita de
forma circular, hacia un lado y hacia el otro, para homogeneizar la muestra
con el medio.
Las Enterobacterias y los Coliformes totales necesitan dos capas del medio
correspondiente, la cual se aadir tras haberse secado la primera capa. Esta
segunda capa se vierte para crear un ambiente de anaerobiosis.
8. Una vez que el medio est solidificado en las placas, stas se llevan a
incubar en la estufa adecuada en posicin invertida (con la tapa hacia abajo),
excepto las placas de mohos y levaduras, que se introducen con la tapa hacia
arriba, dentro de una bolsa de plstico.

30

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CIENCIA Y TECNOLOGA DE LOS ALIMENTOS
ESTANCIAS

Microorganismos a
analizar

Medio de Crecimiento

Temperatura
de incubacin

Tiempo de
incubacin

Aerobios mesfilos

PCA

30C

72 horas

Coliformes totales

VRB (doble capa)

30C

24 horas

Coliformes fecales

VRB (doble capa)

44.5C

24 horas

Enterobacterias

VRBG (doble capa)

37C

24 horas

Escherichia coli

TBX

44.5 C

24 horas

Clostridium sulfito
reductor

SPS

37C

24 horas

Staphylococcus aureus

BP

37C

48 horas

Estreptococos fecales

KAA

37C

48 horas

OGYE cuando aw < 0.6

20C

5 das

DG18 cuando aw = 0.6

0.95

20C

10 das

DRBC cuando aw 0.95

20C

5 das

Mohos y levaduras

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ESTANCIAS

2.3.2. Lecturas
Transcurrido el tiempo de incubacin a la temperatura indicada, se procede a las
lecturas de placas.

Lecturas
Aerobios mesfilos
Coliformes totales

Colonias caractersticas
Todas aquellas que crezcan, excepto
aquellas que lo hagan en la superficie
Colonias rosas, normalmente con forma de
elipse con precipitado alrededor

Coliformes fecales

Colonias rosas/rojas con precipitado

alrededor

Enterobacterias

Colonias rosa fucsia/violeta con

precipitado alrededor

Escherichia coli

Colonias verdes

Clostridium sulfito reductor

Staphylococcus aureus

Colonias negras y produccin de gas

(medio roto y/o elevado)
Colonias negras con halo blanco alrededor

Estreptococos fecales

Colonias negras y medio cambiado a color

negro

Mohos y levaduras

Colonias negruzcas, verdosas o blancas

con o sin vellosidades

Salmonella/Shigella

Listeria Monocytogenes

Placa XLD: colonias negras, rosas o

amarillas, con o sin halo
Placa S/S: colonias incoloras,
transparentes o negras, con o sin halo
Colonias verdes con un halo blanco

32

LICENCIATURA EN
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ESTANCIAS

2.3.3. Confirmaciones
Si existe presencia de alguna colonia sospechosa en las lecturas realizadas se
procede a las confirmaciones.

Confirmacin de Coliformes totales

Se siembra una colonia tpica en un tubo de verde brillante con campana de
Durham, y se incuba a 30C durante 24 horas. Si al cabo de ese tiempo aparece gas en la
campana y el lquido tiene un aspecto turbio se dice que es positivo en Coliformes
totales.

Confirmacin de Coliformes fecales

Se siembra una colonia tpica en un tubo de verde brillante con campana de
Durham y se incuba a 44.5C durante 24 horas. Por otra parte, se siembra una colonia
tpica en una placa de Agar Nutritivo (AN), y se incuba a 37C durante 24 horas. Si
transcurrido este tiempo aparece gas y turbidez en el tubo de verde brillante, y es
oxidasa negativo en la placa de AN, se concluye que es positivo en Coliformes fecales.

Confirmacin de Enterobacterias
Se pasa una colonia tpica (rosa fucsia/violeta con precipitado alrededor) a una
placa de Agar Nutritivo (AN) y se realiza siembra masiva. Esta placa se incuba a 37C
durante 24 horas.
Pasado este tiempo, se realiza la prueba de la oxidasa al crecimiento presente en
la placa de AN. Si la prueba oxidasa da negativo (no vira a color azul), se pasa a una
placa de Agar Prpura (AP), realizando siembra masiva con ayuda de un asa de siembra
estril, y se incuba a 37C durante 24 horas.
Se concluye el resultado positivo a la presencia de Enterobacterias en el
alimento si, transcurrido el tiempo de incubacin, el medio de la placa de AP vira a
amarillo.

33

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ESTANCIAS

Confirmacin de Escherichia coli

Se siembra una colonia tpica en una placa de EMB y se incuba a 30C durante
24 horas. Si pasado este tiempo se produce crecimiento de colonias color tornasol,
podemos decir que el resultado es positivo para la presencia de E. coli en el alimento.

Confirmacin de Staphylococcus aureus

Se siembra una colonia tpica en 3 ml de Caldo Cerebro-Corazn, y se incuba a
37C durante 24 horas. Tras la incubacin, se aade en un tubo de hemlisis 0.1 ml del
tubo anterior y 0.3 ml de Plasma de Conejo (Coagulasa test), y se incuba en la estufa de
37C durante 24 horas.
Se considerar resultado positivo en Staphylococcus aureus si se produce
coagulacin en el tubo de hemlisis tras la incubacin.

Confirmacin de Estreptococos fecales

Se siembra una colonia tpica en una placa de KAA, y se incuba a 37C durante
24 horas. Si el medio se tie de negro y aparecen colonias negras, el resultado ser
positivo para Estreptococos fecales.

Los Aerobios mesfilos, Clostridium sulfito reductor, y los mohos y levaduras

no requieren confirmacin.

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ESTANCIAS

2.3.4. Investigacin de Salmonella en alimentos

Para el estudio de Salmonella en alimentos, si incuba la bolsa Stomacher con 5
gramos de alimento y 45 ml de agua de peptona, a 37C durante 24 horas.
Transcurrido este tiempo, se preparan 2 tubos estriles, uno con el medio
MKTTN, y otro con el medio Rappaport. En un tubo, se vierten 5 ml de MKTTN con
ayuda de una pipeta manual estril, y se le aade 1 ml de muestra de la bolsa
Stomacher. En el otro tubo, se agregan 5 ml del medio Rappaport y se le aade 0.1 ml
de muestra con ayuda de una pipeta automtica. Ambos tubos se incubarn a 37C y
41.5C, respectivamente, durante 24 horas.
Transcurrido este tiempo, se realiza la siembra en placas con el medio S/S y
XLD. Dividimos ambas placas en 2 mitades, y sembramos con ayuda de un asa
impregnada del contenido del tubo de MKTTN en una de las mitades de cada placa. Se
debe repetir el mismo procedimiento con el tubo de Rappaport en la otra mitad de cada
placa. Estas placas se incubarn a 37C durante 24 horas.
Para facilitar la posterior lectura de las placas, se deben rotular indicando el tubo
proveniente de la siembra en cada una de las mitades.
Si transcurrido el tiempo de incubacin se observan colonias tpicas, se procede
a su confirmacin.

Confirmacin de Salmonella / Shigella

Si se observa crecimiento de colonias tpicas tanto en la placa de XLD como en
la de S/S, se efectuar su confirmacin.
En primer lugar, se toma una colonia tpica de cada placa con ayuda de un asa de
siembra estril, y se realiza siembra masiva en placas de Agar Nutritivo (AN). Se
utilizar una placa de AN para la siembra de una colonia tpica de la placa S/S, y otra
placa de AN para la siembra de una colonia tpica de la de XLD. Ambas placas se
incuban a 37C durante 24 horas.
Pasadas las 24 horas de incubacin, se realiza la prueba de la oxidasa al
crecimiento presente en ambas placas de AN. Si el resultado es negativo para la oxidasa
(no cambian a color azul), se procede a la siguiente confirmacin, empleando un test
comercial denominado Enterotube para cada placa.

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CIENCIA Y TECNOLOGA DE LOS ALIMENTOS
ESTANCIAS

Enterotube test
El test Enterotube consiste en un tubo de plstico con distintos compartimientos,
formado por 12 medios de cultivo diferentes, que permiten la determinacin de 15
reacciones bioqumicas.
Est concebido para la inoculacin simultnea
de los 12 medios con una sola colonia, utilizando la
aguja de inoculacin dispuesta en el centro.
La combinacin de reacciones resultante,
junto con la gua de interpretacin (libro de cdigos),
permite la identificacin de Enterobacterias con
importancia clnica.
Las reacciones qumicas que tienen lugar en este test son las siguientes:
Prueba

Reaccin

Negativo

Positivo

Glucosa

Fermentacin de glucosa

De rojo a naranja

De amarillo a dorado

Produccin de gas en la
fermentacin de la glucosa
Descarboxilacin de la
lisina
Descarboxilacin de la
ornitina

Sin desprendimiento
de cera

Con desprendimiento
de cera

Amarillo

Morado

Amarillo

Morado

Gas
Lisina
Ornitina
H2S

Produccin de H2S

De beige a mbar
claro

Negro

Indol

Produccin de indol

Incoloro

Rosa o rojo

Adonitol

Fermentacin de adonitol

De rojo a naranja

De amarillo a dorado

Lactosa

Fermentacin de lactosa

De rojo a naranja

De amarillo a dorado

Arabinosa

Fermentacin de arabinosa

De rojo a naranja

De amarillo a dorado

Sorbitol

Fermentacin de sorbitol

De rojo a naranja

De amarillo a dorado

VP (VogesProskauer)

Produccin de acetona

De incoloro a mbar
claro

Rojo

Dulcitol

Fermentacin de dulcitol

Verde

De amarillo a dorado

PA

Desaminacin de
fenilalanina

De negro a gris
oscuro

Urea

Hidrlisis de la urea

Cualquier tono de
verde
De incoloro a mbar
claro

Citrato

Utilizacin del citrato

Verde
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De rosa claro a rosa

Azul

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ESTANCIAS

Procedimiento:

1. En primer lugar, se arrastran colonias de la placa de AN con la punta de la

aguja de inoculacin dispuesta en el centro del Enterotube.
2. Una vez arrastradas las colonias, llevamos la aguja de inoculacin hacia atrs
y hacia adelante para que pase por todos los medios, inoculando as las
colonias en cada uno de los compartimentos.
3. Posteriormente, colocamos la aguja de manera que permanezca en contacto
con todos los medios.
4. En el extremo derecho de la aguja encontraremos una marca por la que
debemos romperla, de manera que no sobresalga por ningn extremo del
Enterotube.
5. A continuacin, nos aseguramos de que la aguja atraviese todos los
compartimentos, y colocamos las capuchas a cada extremo.
6. Colocamos el Enterotube en una gradilla en posicin vertical, de modo que
el compartimento de la glucosa quede hacia arriba, e incubamos a 37C
durante 24 horas.

37

LICENCIATURA EN
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ESTANCIAS

7. Transcurrido el tiempo de incubacin, se procede a la interpretacin y

registro de los resultados con ayuda de la gua comercial, con excepcin de
indol y Voges-Proskauer.
La lectura de las dems pruebas debe efectuarse antes de realizar las pruebas
de indol y Voges-Proskauer, puesto que los reactivos aadidos en estas
pruebas pueden alterar las dems reacciones del Enterotube.

8. Para realizar la prueba de indol, se coloca el Enterotube en posicin

horizontal y se aaden unas gotas de reactivo Kovacs a travs de la pelcula
plstica del compartimiento de H2S/indol con una aguja o jeringa, o
haciendo un orificio mediante calor en la pelcula plstica con ayuda de una
aguja de inoculacin caliente o pipeta desechable y vertiendo el reactivo en
el compartimiento.
Se debe permitir que el reactivo entre en contacto con la superficie del medio
o la superficie interna de la pelcula de plstico para poder observar si se
produce o no la reaccin. Una prueba positiva se indica por la aparicin de
color rojo en el reactivo aadido sobre la superficie del medio o la pelcula
de plstico a los 10 segundos aproximadamente.
Por otra parte, para la prueba de Voges-Proskauer, se inyectan los reactivos
VP al compartimento indicado, y se observa si se produce la reaccin tras 20
minutos de la adicin.

38

LICENCIATURA EN
CIENCIA Y TECNOLOGA DE LOS ALIMENTOS
ESTANCIAS

9. Por ltimo, se interpretan los resultados marcando con un crculo las

puntuaciones de las reacciones que han sido positivas, se suman estas
puntaciones, y se busca el cdigo obtenido en la gua de interpretacin para
verificar de que Enterobacteria se trata.

Por lo general, no suele tratarse de Salmonella, por lo que se concluye la

confirmacin como negativo en la presencia de Salmonella/Shigella.

39

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ESTANCIAS

2.3.5. Investigacin de Listeria monocytogenes en alimentos

La Listeria monocytogenes es un microorganismo telrico, muy extendido en el
medio ambiente.
El procedimiento de investigacin de Listeria se realiza en aquellos alimentos
propensos a su presencia. Estos alimentos pertenecen a los siguientes grupos:
-

A (alimentos en crudo)
B (alimentos tratados
con calor)
Pescados crudos
Pescados cocidos

Pescados seco-salado
Frutas y verduras
Carnes
Helados
Especias

Actualmente, tambin se incluye la investigacin de Listeria en todos los

productos donde se estudie la caducidad. Para estos productos, se debe comprobar
previamente si cumplen las condiciones adecuadas para la proliferacin de Listeria,
como son:
-

Alimentos con un pH menor o igual a 4.4, y actividad de agua menor o

igual a 9.2.
Alimentos con un pH menor o igual a 5.0, y actividad de agua menor o
igual a 9.4.

Por lo general, este microorganismo no suele encontrarse en los alimentos. Por

ello, en el laboratorio Gmez-Beser, slo se investiga en aquellos ms propensos a su
presencia; como son: las carnes y pescados crudos, preparados crnicos, pescados secosalados, pescados marinados, y productos en los que se estudia la caducidad.

Procedimiento:
Para el estudio de Listeria en alimentos se realiza una dilucin 1:10, tomando 5
gramos de alimento y 45 ml de Caldo One.
Al igual que anteriormente, se debe crear un ambiente estril encendiendo un
mechero Bunsen. Se coloca la bolsa de Stomacher sobre la balanza, con la apertura
hacia arriba y fijada mediante un adhesivo. Taramos la balanza, y aadimos 5 gramos
del alimento a investigar con ayuda de un depresor estril y una hoja de bistur, si fuera
necesario.
A continuacin, se aaden 45 ml de Caldo One y se homogeniza introduciendo
la bolsa en el Stomacher durante varios segundos.
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LICENCIATURA EN
CIENCIA Y TECNOLOGA DE LOS ALIMENTOS
ESTANCIAS

Tras la homogeneizacin, cerramos la bolsa con un clip y la introducimos en la

estufa de 30C durante 24 horas.
Transcurrido el tiempo de incubacin, tomamos 0.1 ml de la disolucin de la
bolsa, y sembramos en una placa de medio Brillance. Se realiza la siembra de forma
masiva con ayuda de un asa estril, e introducimos la placa en la estufa de 37C durante
24 horas.
Si pasadas las 24 horas se observa crecimiento de colonias sospechosas (verdes
con un halo blanco), se procede a su confirmacin.

Confirmacin de Listeria
En primer lugar, se realizan 3 pruebas de forma directa: Oxidasa (-), Catalasa
(+), y prueba de ltex aglutinacin (-).
-

Test oxidasa: Sobre un papel de filtro se colocan varias colonias

sospechosas de Listeria monocytogenes, y vertimos unas gotas de
reactivo oxidasa. Tras unos segundos, determinaremos que la prueba es
positiva si las colonias se tien de azul, o negativa si no hay cambio de
color.

Prueba de la catalasa: Sobre una placa vaca se vierten varias gotas de

agua oxigenada con ayuda de una pipeta Pasteur. Se mezclan varias
colonias con el agua oxigenada empleando un asa de siembra, y se
observa si se produce reaccin o no. La prueba ser positiva si, al
mezclar las colonias, se produce la formacin de burbujas.

Prueba de ltex aglutinacin: Se vierten varias gotas de una disolucin

de KOH al 30% sobre una placa vaca, con ayuda de una pipeta Pasteur.
Se toman varias colonias con un asa de siembra estril, y se mezclan con
el KOH. La prueba ser positiva si al mezclarlas se produce aglutinacin,
es decir, presenta un aspecto viscoso.

Si los resultados de las pruebas coinciden con

el protocolo de confirmacin; Oxidasa (-), Catalasa
(+), y test de ltex aglutinacin (-); se procede a la
confirmacin con el kit de Microbact, un
procedimiento de confirmacin de Listeria basado en
la colorimetra.

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LICENCIATURA EN
CIENCIA Y TECNOLOGA DE LOS ALIMENTOS
ESTANCIAS

Kit Microbact
1. Con un asa estril, se toma la mayor cantidad posible de colonias
sospechosas, y se introducen en un bote que contiene una solucin que
provoca la estabilidad y la proliferacin de la bacteria. Se homogeniza
durante unos segundos con el agitador Vrtex.
2. Una vez homogeneizado, con ayuda de una pipeta automtica, se inoculan
0.1 ml en casa pocillo del Microbact. Adems, en el ltimo pocillo se aade
0.1 ml de hemolisina.
3. Incubamos el Microbact a 37C en posicin horizontal. La lectura puede
realizarse transcurridas entre 4-24 horas de incubacin.
4. Terminado el tiempo de incubacin, se observa un cambio de color debido al
contacto de la bacteria con los reactivos de cada pocillo. El kit Microbact
incorpora una plantilla en la que se explican los posibles cambios de color y
su significado (positivo o negativo).

5. Comprobamos los resultados obtenidos con los de la plantilla y anotamos las

reacciones positivas y negativas. Cada prueba tiene un nmero asociado,
dando como resultado final un cdigo que deberemos introducir en el
programa informtico de Microbact. Este cdigo nos muestra el tipo de
Listeria presente en el alimento analizado.
6. La nica especie con importancia en la investigacin de Listeria es la
Listeria monocytogenes.

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CIENCIA Y TECNOLOGA DE LOS ALIMENTOS
ESTANCIAS

Bibliografa
Programas Normalizados de Trabajo de Gmez-Beser
Colaboracin de Elena Berejano Paraj
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