TCNICA HISTOLGICA
HISTOLOGA I - MEDICINA
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1. [Link] presente trabajo de investigacin presenta una introduccin a las tcnicas histolgicas. Es de
esta manera que se refiere a los conceptos ms bsicos, asi como a todo el procedimiento que
implica la preparacin de las muestras para ser observadas a travs del microscopio.
El trabajo se divide en tres grandes partes: objetivos general y especficos, desarrollo, el cual
contiene toda la informacin respecto a las tcnicas histolgicas: definicin general, mtodos de
la tcnica histolgica, material requerido en laboratorio y tcnicas de tincin de tejidos; y las
conclusiones de la investigacin; los mismos que se presenta a continuacin.
2. Objetivos.2.1 Objetivo general. Comprender el proceso de aplicacin de las tcnicas histolgicas, asi como los conceptos
bsicos y trminos propios de Histologa.
2.2 Objetivos especficos. Conocer los materiales que se utilizan en un laboratorio de Histologa.
Conocer las caractersticas de la infraestructura de un laboratorio de Histologa.
Establecer cules son los pasos para la preparacin de una muestra de laboratorio de
Histologa.
Determinar qu tcnicas o mtodos pueden emplearse en la tincin o coloracin de cortes
histolgicos.
3. Desarrollo.3.1 Definicin de tcnica [Link] tcnica histolgica comprende el conjunto de procedimientos a los que se somete una
muestra para su anlisis microscpico.
La elaboracin de preparaciones histolgicas sensibles de ser observadas tanto por microscopa
fotnica como electrnica, obedece a una serie de principios generales que son comunes para
ambas. Para obtener una preparacin histolgica es necesario procesar el material siguiendo una
serie de pasos o etapas, las cuales se detallan a travs de esta investigacin, estas son:
1.
2.
3.
4.
5.
Obtencin de tejido
Fijacin
Lavado
Deshidratacin y aclaramiento
Preinclusin o impregnacin
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6.
7.
8.
9.
Inclusin
Corte o seccin
Tincin o coloracin
Montaje
3.2 Material requerido en [Link] laboratorio de Histologa, al igual que otros, debe cumplir con una serie de condiciones, en lo
que se refiere a infraestructura e instrumentos de trabajo con los cuales se debera contar. A
continuacin, mencionaremos algunas de ellas:
3.2.1
Infraestructura.-
Un laboratorio de Histologa debe contar con:
Sistema de ventilacin, que funcione constantemente durante las horas de trabajo.
Buena iluminacin, este factor puede ayudar a una mejor observacin de las muestras.
Revestimiento de los suelos y paredes con cermica que sea de fcil aseo
Presencia de contenedores de desechos, clasificados por colores en comunes, biolgicos,
infecciosos y corto punzantes, respectivamente.
Una zona de aseo y lavados de manos para la limpieza del estudiante, docente,
investigador, etc.
3.2.2
Instrumentos de trabajo.-
Un laboratorio de Histologa deber contar con: microscopio, micrtomo, estufa de inclusiones,
procesador automtico de tejidos, criostato, bao Mara, balanza analtica, moldes para inclusin
(Leuckart), varillas de vidrio y pipetas, reactivos apropiados, estufas histolgicas, porta objetos y
cubre objetos, entre otros.
3.2.3
Unidades de medida.-
Las unidades de medida ms utilizadas en Histologa son: el micrmetro (um- 0,001mm) y el
nanmetro (nm-0,001 um).
Por otro lado, podemos aadir que, recientemente, a travs de un Congreso Internacional, se ha
desaconsejado el uso del Angstrom (A), adems se sustituy el termino milimicra por
designacin de nanmetro (nm). Otra modificacin importante fue la sustitucin de la micra (u)
por el micrmetro (um), ambos de igual valor.
3.3 Mtodos de la tcnica histolgica.3.3.1 Obtencin de [Link] fragmentos de rganos tejidos a observar, deben ser extrados inmediatamente despus de
la muerte del animal, mediante tcnicas quirrgicas, tales como:
a. Biopsia: consiste en tomar un fragmento de tejido de un organismo vivo, generalmente
con fines diagnsticos y teraputicos. Existe una variedad de mtodos o tipos, entre los
ms empleados estn: la biopsia por incisin o encisin, biopsia por sacabocados, biopsia
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por aspiracin- para retirar liquido de cavidades o espacios celmicos-, puncin, biopsia
por endoscopia, etc.
b. Autopsia o necropsia: es el estudio macroscpico y microscpico de un organismo que
ha fallecido. Generalmente tiene fines de diagnstico y de investigacin. Tanto en la
biopsia como en la autopsia, los fragmentos de tejido que se estudiarn deben tener un
centmetro cbico de volumen, y obtenerse sin alterar el mismo fsicamente.
c. Citologa exfoliativa: es el estudio de clulas epiteliales superficiales que se descaman,
como la mucosa oral, respiratoria, urinaria, digestiva, etc. Tiene fines diagnsticos. Un
ejemplo es la tcnica de Papanicolaou.
d. Frotis e improntas: es el estudio de capas delgadas de lquidos orgnicos como la
sangre, mdula sea o exudados. Tiene fines diagnsticos.
Posteriormente, se inicia un proceso de autlisis que conduce a la prdida de la estructura propia
de la materia viviente, por consiguiente es de fundamental importancia proceder con rapidez,
colocando la pieza lo ms pronto posible en el lquido fijador.
3.3.2
Fijacin.-
Tiene por objetivo preservar la estructura celular y tisular, de modo que sta se mantenga lo ms
similar posible a la observada en el animal vivo.
La efectividad de cada lquido fijador estar dada por su capacidad para lograr esta preservacin.
Fijar significa inmovilizar, y esto puede lograrse empleando medios fsicos,qumicos una
combinacin de ambos.
Como medios fsicos podemos mencionar: Congelacin con CO2 -el material puede estar
previamente fijado o no-, enfriamiento rpido a -20C con Criostato, calor- se hierve la pieza en
un lquido especial durante ms o menos un minuto-, y desecacin.
Como medios qumicos podemos mencionar: cido crmico, cido smico, bicloruro de
mercurio, bicromato de potasio, cido actico, cido tricloractico, cido pcrico, formol,
acetona, alcohol etlico, alcohol metlico.
[Link] Formas de fijacin.a. Inmersin: se sumerge la pieza en un determinado volumen de lquido fijador. En este
caso existen una serie de reglas prcticas que son importantes:
- El volumen del lquido fijador debe ser de 20 a 40 veces mayor que el del fragmento a fijar.
- El tiempo de fijacin debe regularse empricamente ya que depende de factores diversos,
como por ej. el tamao de la pieza, la constitucin del tejido, el poder de penetracin del
lquido fijador, el objetivo final de la tcnica a emplear, la temperatura de fijacin, etc.
- El fijador debe estar en contacto con todas las superficies disponibles de la pieza. En el caso
de rganos huecos, la cavidad tambin debe rellenarse con fijador.
b. Inyeccin: se realiza utilizando el sistema vascular del rgano por otras vas.
c. Perfusin: el fijador se gotea a travs de una cnula insertada en el sistema vascular del
animal anestesiado, a temperatura corporal, de manera que la propulsin del lquido
fijador se lleve a cabo con el propio flujo sanguneo del organismo viviente.
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3.3.3
Lavado.-
Al concluir la fijacin, el fijador debe ser eliminado de las muestras. Para tal fin se procede al
lavado de los tejidos mediante agua o alcohol. Se evita, as, que los tejidos se endurezcan
demasiado o que ciertos componentes del fijador introduzcan modificaciones en los tejidos e
impidan una adecuada obtencin de secciones delgadas o la coloracin correcta de sus
componentes celulares.
3.3.4
Deshidratacin y aclaramiento.-
En este paso se sustituye el alcohol por un disolvente de parafina; y se efecta mediante tres
cambios sucesivos de una hora y media cada uno; de algn disolvente como: el xilol, el
cloroformo, el toluol benzol, etc.
El ms usado es el xilol (xileno) ya que como la muestra est deshidratada, este disolvente
entrar hasta lo ms profundo del tejido.
De esta manara el proceso de aclaracin tiene por objeto, volver el tejido, soluble a la parafina y
hacerlo translucido. Para que finalmente el preparado se encuentre; listo para su impregnacin
con la parafina.
3.3.5
Preinclusin o impregnacin.-
Consiste en colocar el tejido aclarado en un recipiente con parafina liquida, con un punto de
fusin de 56 a 58C, dentro de la estufa histolgica con temperatura fija.
Para que el tejido quede bien impregnado se requieren cuatro cambios de una hora en esta
sustancia.
La parafina penetra en los vasos, en los espacios intercelulares y tambin en el interior de las
clulas embebiendo el tejido y haciendo ms fcil la obtencin de cortes en el micrtomo.
3.3.6
Inclusin.-
La finalidad de este paso es confeccionar un bloque con el tejido incluido, utilizando moldes de
diferentes tamaos de metal (Leuckart) y papel de plstico.
Al enfriarse, la parafina se solidifica, y forma, junto con el trozo de tejido bien orientado un
bloque slido denominado taco que queda listo para ser cortado en el micrtomo.
3.3.7
Corte.-
Los tejidos incluidos en bloques de parafina deben ser cortados en lminas lo suficientemente
delgadas- usualmente entre 5 a 10 micrmetros- para permitir el paso de la luz, de manera que
puedan observarse con el microscopio. Este proceso es denominado tambin Microtoma. Los
instrumentos utilizados para esta tarea son los micrtomos.
El micrtomo es un aparato mecnico que permite la obtencin de secciones de tejido de espesor
micromtrico que pueden ser empleadas posteriormente para su estudio al microscopio. Los
micrtomos poseen cuchillas de metal y mecanismos para regular el grosor de los cortes y el
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avance de la muestra que se coloca en l. Se utilizan para estudiar secciones de tejidos
potencialmente patolgicos de los que se pretende obtener un diagnstico. Sus partes ms
importantes son:
Portabloques: dispositivo donde colocamos el material tisular sumergido en algn medio
de inclusin, generalmente parafina. Avanza de forma discontinua sobre una cuchilla
gracias a un mecanismo regulable de cremallera.
Portacuchillas: pinza que sujeta y orienta adecuadamente la cuchilla.
Mecanismo de avance del portabloques sobre la cuchilla: sistema mecnico o electrnico
que proporciona cortes sucesivos de tejido a partir del bloque. Actualmente se consiguen
cortes de hasta 1m.
Caja: tambin llamada carcasa, aloja el mecanismo de engranajes de precisin y el
mecanismo para seleccionar el espesor de la seccin.
Manivela: est situada a la derecha del aparato; consiste en un volante con una manilla y
un freno.
Freno: es un tornillo que, accionndolo hacia afuera y/o girndolo sobre s mismo un
cuarto de vuelta, libera la manivela.
Manivela de recuperacin: est situada a la izquierda del micrtomo. Una vez utilizado el
micrtomo es conveniente hacerle volver a la posicin de inicio.
Los cortes as obtenidos presentan pequeos pliegues y arrugas que pueden eliminarse si se los
flota en agua tibia, debido a la elevada tensin superficial del agua. Este proceso se denomina
Bao Mara, preparado con agua y a una temperatura que flucta entre los 45- 55 C, evitando
los pliegues y las burbujas ocasionadas por una temperatura demasiado baja del agua, o los
desgarros por una temperatura my alta.
Luego de ello se recogen sobre delgadas lminas de vidrio llamada portaobjetos, a las cuales se
adhieren generalmente a travs de adhesivos como el silane o la poli-L-lisina, se deja escurrir el
agua, o bien, se coloca en la estufa histolgica a 57 C durante 30 minutos. Los cortes se secan y
luego se los pasa por solventes intermediarios como el xileno, el benceno o el tolueno y se los
hidratada en alcoholes de concentracin decreciente hasta llevarlos al agua destilada para su
posterior coloracin.
Tambin es posible efectuar los cortes en especmenes congelados, sea en nitrgeno lquido o en
un portamuestras para congelacin rpida en un criostato. Estos cortes se montan con un medio
para montaje de congelacin rpida y se seccionan a temperaturas inferiores a cero mediante una
hoja de acero enfriada con anterioridad. Los cortes se colocan en portaobjetos de vidrio
previamente enfriados, se permite que alcancen la temperatura ambiente y se tien despus con
colorantes especficos, o bien, se tratan para estudios histoqumicos o inmunocitoqumicos.
Se utilizan tambin para obtener rpidamente cortes histolgicos durante una ciruga para
realizar un diagnstico intraoperatorio, por medio de micrtomos de congelacin refrigerados
por la expansin de dixido de carbono lquido, o bien para conseguir cortes de tejido con su
estructura qumica prcticamente inalterada, para los cuales se emplea generalmente el
denominado criostato.
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3.3.8
Tincin.-
Dado que la mayora de los tejidos son incoloros, lo que hace difcil su observacin al
microscopio ptico, es necesario dar caractersticas cromticas a los componentes tisulares, que
permitan distinguir sus elementos. A este paso se le denomina tincin, y se basa en la afinidad
qumica que tienen determinados elementos celulares por los colorantes. Debido a esto, se
introdujeron diversos mtodos para la coloracin de los tejidos a fin de hacer a sus componentes
estructurales visibles y diferenciables unos de otros.
Para realizar la tincin respectiva de la muestras, se necesita eliminar la parafina previamente
mediante un tratamiento con xilol y luego rehidratarse mediante pasajes por concentraciones
decrecientes de alcohol etlico.
La mayor parte de colorantes utilizados son sales solubles que se ionizan en el agua. Aunque
son sales, se dice que son colorantes cidos o colorantes bsicos. La mayor parte de los cortes
usuales se emplean para la observacin directa con el microscopio, estn teidos con un
colorante bsico y con un colorante cido, uno despus de otro. Actualmente, estos colorantes se
conocen como cidos y bsicos o de acidofilia y basofilia.
Los colorantes asimismo pueden clasificarse en:
Colorantes naturales: que a su vez se clasifican en animales- ejemplo: carmn-, y
vegetales- hematoxilina, orcena, azfrn, etc.-.
Colorantes artificiales o sintticos Colores de Anilina: cidos, Bsicos, Neutros e
indiferentes.
[Link] Colorantes bsicos.-
Sales cuya base es coloreada y el cido es incoloro, tales como: azul de metileno o clorhidrato de
azul de metileno, verde de metileno, Pironina G, azul de toluidina y la hematoxilina.
Los tejidos que reaccionen con un colorante bsico (o con Hematoxilina) se dice que es Basfilo
y que presenta Basofilia. Son basofilos la heterocromatina y los nuclelos del ncleo por los
grupos fosfato ionizados, ergatoplama- parte del citoplasma-, matriz del cartlago por grupos
sulfato ionizados.
[Link] Colorantes [Link] cuya base es incolora y su cido es coloreado, tales como: eosina o eosinato de sodio,
orange G, fucsina cida.
Los componentes texturales que se tien de colorantes cidos se dice que son Acidfilos y que
presentan Acidofilia. Son acidofilos la mayor parte del citoplasma no especializado, filamentos
Citoplasmticos, y fibras extracelulares.
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3.3.9
Montaje.-
Despus de que se ha teido el corte convenientemente hay que tratarlo de manera que se pueda
convertir en una preparacin definitiva, para lo cual se necesita protegerlo con una delgada
laminilla de vidrio llamada cubreobjetos; mediante el siguiente procedimiento, los cortes se
someten a un proceso de deshidratacin en alcoholes de concentracin creciente pasndolos
despus por solventes intermediarios como el xileno, el benceno o el tolueno.
El medio de montaje clsico es el Blsamo del Canad, se pone una gota de blsamo de Canad
o una resina sinttica en un extremo del corte y cuidadosamente se deja caer el cubreobjetos
sobre el blsamo o resina para que este se extienda por capilaridad, evitando que queden
burbujas, de manera que el medio para montaje cubra la seccin de tejido. Se deja secar y al
solidificarse el medio de montaje traba fuertemente el cubreobjetos con el portaobjetos,
constituyendo de esta forma su adhesin.
3.4 Tcnicas de tincin.3.4.1 Mtodos [Link] histoqumica es el conjunto de tcnicas de coloracin destinadas a visualizar sustancias
especficas en los tejidos. Este propsito es tanto cualitativo como cuantitativo. Puede realizarse
con fines diagnsticos y/o pronsticos de enfermedades. En sentido estricto es microscpico
debiendo cumplirse varias condiciones:
a) la sustancia original debe ser inmovilizada y visualizada por el microscopio en su
localizacin celular original.
b) la sustancia debe ser identificada por un procedimiento que sea especfico para ella o para
el grupo qumico al que pertenece.
3.4.2
Mtodo de la hematoxilina-eosina.-
Es uno de los mtodos ms empleados en tcnica histolgica. El tipo de tincin es bicrmica y de
esta manera se colorea el ncleo, sus componentes y el retculo endoplasmtico rugoso en azul o
morado por la accin de la hematoxilina; y los citoplasmas y la mayora de los elementos
fibrilares del espacio intercelular toman un color rosado por la accin de la eosina.
La hematoxilina se extrae de la pulpa del Palo Campeche- rbol centroamericano-, se presenta en
polvo en forma de cristales de color amarillo pardo, solubles en agua y alcohol. No colorea por
s sola, necesitando entonces de un oxidante, tales como: iodato de sodio, iodato de potasio,
permanganato de potasio o agua oxigenada; y de un mordiente, como por ejemplo: alumbre de
potasio. Una vez sumada al oxidante se denomina Hematena, que al mismo tiempo forma un
complejo laca-hematoxilina-colorante, que s es capaz de colorear distintos tejidos. Las eosinas
son xantenos cidos o colorantes de ftalena. Las ms comunes son: eosina amarilla- la ms
utilizada-, eosina B- azul-, floxina, eritrocina, safranina, y Rosa de Bengala. Su punto de
solubilidad es del 44 % en agua y del 7 % en alcohol. Proporciona una buena coloracin
citoplasmtica de fondo. Se usa disuelta en agua destilada o alcohol al 1:100 o 1:200.
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3.4.3
Tricrmico de Masson.-
Esta tcnica se llama de tejido conectivo. Se utiliza para demostrar elementos del tejido
de soporte, principalmente colgeno. Como su nombre implica, la tcnica de tincin produce
tres colores: ncleos y otras estructuras basfilas se tien de azul, el colgeno se tie de
verde o azul, dependiendo de qu variante de la tcnica se utiliza, y el citoplasma, el msculo,
los eritrocitos y la queratina se tien de rojo brillante.
3.4.4
Mtodo de Van Giesson.-
Tipo de tincin tricrmica, ste es otro mtodo de tejido conectivo, en el cual el colgeno se tie
de rojo, los ncleos se tien de azul y los eritrocitos y citoplasmas de un tono amarillento.
Cuando se una en combinacin con una tincin elstica, la elastina se tie de negro o azul,
adems de los datos descritos anteriormente. Esta tcnica de tincin es particularmente til para
el estudio de vasos sanguneos y piel.
3.4.5
Mtodo de Mallory.-
Este es un mtodo de tincin tricrmica. Permite distinguir fibras colgenas, reticulares, elsticas
as como fibrillas neurogliales. Se usan tres colorantes cidos: azul de anilina, para la tincin
selectiva hacia el colgeno; fucsina cida, para la tincin del citoplasma en general y tambin de
ncleos; y naranja G, para la tincin de eritrocitos.
3.4.6
Mtodo de impregnacin argntica.-
Es un mtodo que se emplea para teir las fibras reticulares y las membranas basales. Es una
tcnica especial de tincin de tejidos del sistema nervioso. Dentro de esta encontramos otras
tcnicas, entre las que se puede mencionar:
[Link] Tcnica de [Link] tcnica fue la precursora de todas las tcnicas de impregnacin argntica. La impregnacin
se realiza sobre el tejido fijado en bloque, es decir, sin cortarlo previamente, en dicromato de
potasio y posterior impregnacin con nitrato de plata. Luego se lo incluye en celoidina y se lo
corta.
Como resultado, se observan neuronas, gla y vasos de color negro sobre un fondo amarillo de
aspecto semejante al acrlico. La coloracin es selectiva, impregnndose entre el 5 y el 20 % de
las neuronas y clulas gliales; pero las que lo hacen, se impregnan completamente, con todas sus
prolongaciones. Se utiliza para el estudio de campos dendrticos y colaterales axonales. No se
observan detalles citolgicos.
[Link] Tcnica de [Link] de impregnacin argntica, la impregnacin se hace con nitrato de plata y la reduccin
con solucin reductora de Cajal- hidroquinona, formol y acetona-. El ncleo se tie de un color
amarillo plido y las prolongaciones neuronales y gliales y algunos vasos aparecen impregnados
de color marrn.
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Permite el estudio de prolongaciones neuronales, dando una imagen ms completa del tejido
nervioso. No es posible observar detalles citolgicos ni el ncleo celular.
3.4.7
Mtodos inmunohistoqumicos.-
Se fundamenta en la capacidad de las clulas de responder ante sustancias extraas o antgenos,
produciendo compuestos llamados anticuerpos. De esta manera se utiliza un anticuerpo
especfico, que se marca mediante un enlace qumico con una sustancia que se puede ver sin que
se afecte la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antgeno. Estos mtodos
son muy tiles para clasificar tumores malignos indiferenciados, clasificar leucemias y linfomas,
determinar el origen de tumores metastticos y deteccin de molculas con significado
pronstico o teraputico como por ejemplo receptores hormonales.
4. Conclusiones.
La tcnica histolgica comprende un proceso detallado de pasos para la preparacin de
muestras, los cuales deben ser seguidos fielmente y sin omitir ninguno de ellos, para as
obtener buenos resultados una vez que las muestras sean estudiadas a travs del
microscopio.
Debe tomarse en cuenta las recomendaciones en cuanto a la obtencin de tejidos, esto
para no alterar las muestras antes de que estas puedan ser sometidas al proceso de
preparacin para su posterior estudio.
Deben de tomarse en cuenta los puntos sealados en lo que son la etapa de seccin y de
coloracin o tincin de tejidos. En el primer caso, debe seguirse el margen de grosor
impuesto para las lminas cortadas por el micrtomo, ya que esto determinar que la
muestra pueda ser vista posteriormente por medio del microscopio. En el segundo caso,
se conocen diversos colorantes para los tejidos de acuerdo a una clasificacin en cidos y
bsicos, se debe tomar en cuenta para su uso, el tipo de tejido que va a someterse a
coloracin, de modo que la sustancia pueda adherirse al tejido correctamente y la tincin
o coloracin sea efectiva.
Respecto a la investigacin en s, concluimos que esta fue positiva en general, con un
trabajo equitativo por parte de la mayora de los integrantes del grupo, los cuales se
desenvolvieron en todas las fases de desarrollo de la investigacin: recoleccin de datos,
asignacin de partes para la exposicin, elaboracin de diapositivas, etc.
Finalmente, consideramos que esta investigacin tiene mucho valor e importancia, puesto
que, nos introduce no solo a la aplicacin de las tcnicas histolgicas, sino a la asignatura
en s, la cual estamos actualmente abordando.
5. Bibliografa.-
GARTNER P. Leslie; HIATT L. James; Texto Atlas de Histologa; Segunda edicin; Edit.
Mc Graw Hill Interamericana; Distrito Federal; Mxico; 2002; Pg. 1-11.
PADILLA V. Alfonso; La tcnica de histologa y citologa; La Paz; Bolivia, 2012; Pgs.
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MONTALVO A. Csar E.; Tcnica histolgica; Agosto 2010; doc. Formato PDF.
MORA V. Gustavo; Tnicas histolgicas y coloraciones; disponible en:
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ROMERO P. Jos A.; Introduccin al estudio de la histologa y morfologa celular;
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Seccin Biologa Celular- Biologa del desarrollo; Tcnica histolgica de rutina; 2008;
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