per
Inhibidores de Tripsina
Giselle Jimnez 173405 Ray Marn 173407
Fecha de realizacin de la prctica: Mayo 22 de 2003
Objetivos
1. Comprobar la presencia de inhibidores de tripsina en frjol, arban!o y soya.
2. "st#diar el efecto del inhibidor del frjol en la cin$tica de la acti%idad de la
tripsina.
3. "%al#ar la estabilidad t$rmica de los inhibidores.
Introduccin
Tripsina
&a tripsina es #na en!ima '#e pertenece a las protenas diesti%as, estas son las
s#stancias presentes en las secreciones astrointestinales '#e catali!an la
deradaci(n de los alimentos para con%ertirlos en s#stancias m)s sencillas. *#
prec#rsor inacti%o o !im(eno es el tripsin(eno, '#e es sinteti!ado oriinalmente
en el p)ncreas y acti%ado en el intestino delado. *i esto no oc#rriera de esta
manera, las c$l#las pancre)ticas se con%ertiran en el objeti%o de la tripsina siendo
a#todestr#idas. +e hecho, la pancreatitis tiene como ca#sa la liberaci(n premat#ra
de la tripsina ca#sando da,os, en ocasiones irre%ersibles, en el p)ncreas.
"l proceso de acti%aci(n se da de la si#iente manera- el tripsin(eno se con%ierte
en tripsina por la eliminaci(n del framento [Link] del / terminal, proceso
'#e es catali!ado por #na en!ima '#e se enc#entra en la m#cosa intestinal,
llamada enteropeptidasa o enterocinasa. +esp#$s es la tripsina la '#e se encara
de acti%ar el tripsin(eno. &os !im(enos son inacti%os por'#e, a#n'#e contienen
los resid#os de 0jaci(n y cat)lisis, s# eometra no es la adec#ada, de manera '#e
deben ser modi0cados en s# estr#ct#ra primaria para '#e los r#pos 1 p#edan
establecer n#e%as interacciones y as, modi0car tambi$n la estr#ct#ra terciaria.
Inhibidores de tripsina
2l#nas protenas de bajo peso molec#lar p#eden
inhibir la acti%idad de la tripsina, y en eneral, de las
en!imas proteolticas. *on s#stancias '#e se
enc#entran en las plantas como la soya, el frjol, el
arban!o, la papa etc. 3 '#e dismin#yen le %alor
n#tricional de estos alimentos. 2l#nos no son
espec0cos ya '#e p#eden inhibir otras en!imas como
la '#imotripsina y la papana. 4or lo eneral presentan
#n contenido alto de cistina y enlaces dis#lf#ro, lo '#e
hace '#e sean alo resistentes a la desnat#rali!aci(n,
a#n'#e m#chos de s#s efectos p#eden ser controlados por #n adec#ado
calentamiento y por inesti(n de amino)cidos a!#frados.
"l n5mero de #nidades de tripsina inhibidas 67TI8 por cierta cantidad de inhibidor
corresponde a la acti%idad de los inhibidores de tripsina y p#ede ser [Link]
como 9 de inhibici(n. *e ha encontrado '#e este tipo de inhibidores tienen #n
comportamiento no competiti%o sobre la tripsina es decir, '#e se mantiene el %alor
de :m pero dismin#ye la %elocidad m).ima.
Reaccin de la tripsina sobre el BAPNA
1/v
1/S -1/Km
b=-1/Vmax
m=Km/Vmax
&a hidr(lisis del Clorhidrato de /;;ben!oil;+&;arinina paranitroanilida 6<24/28
p#ede ser catali!ada por la tripsina, para prod#cir /;be!oil;+&;arinina y
paranitroanilina, s#stancia '#e absorbe l#! a =10nm y '#e por lo tanto p#ede ser
#tili!ada para c#anti0car la acti%idad de la tripsina. *e ha de0nido, en base a lo
anterior, #na #nidad de tripsina 67T8 como #n incremento de 0.0172 a =10nm por
10m& de me!cla de reacci(n.
ablas de datos ! resultados
Prebas de inhibicin
+ebido a '#e #na #nidad de tripsina 67T8 se de0ne como #n a#mento en 0.01
#nidades de absorbancia a =10nm por 10m& de me!cla de reacci(n, el factor de
con%ersi(n se p#ede [Link] como-
mL
UA
UT
1
001 . 0
1 =
+e esta manera se obtiene-
abla 1" #esultados de las pruebas de inhibicin de la tripsina con los e$tractos de
%r&jol' so!a ! (arbanzo"
Tubo Inhibidor A410nm UT % inhibicin
1
1 0,228 28,5
2 0,235 29,4
3 Frjol 0,149 18,6 35,4
4 Frjol 0,150 18,8
5 o!" 0,102 12,8 56,4
6 o!" 0,100 12,5
# $"rb"n%o 0,189 23,6 19,2
8 $"rb"n%o 0,185 23,1
M#estra de c)lc#los-
7nidades de tripsina 6t#bo 18-
5 . 28
1
8
228 . 0
1
001 . 0
= =
mL
UA
UT
mL
UA
UT
4orcentaje de inhibici(n 6frjol8-
1
Estos son valores promedio calculados a partir del valor promedio de UT para los tubos 1 y 2.
&' &'
2
& '
(
& ' (
&'
2
)
&(
2
)
( '
2
&' &'
2
& '
(
(
*
(
&'
2
)
)
&'
2
&(
2
Tri+,in"
( )
( )
4 . 35
100
100 %
2
94 . 2 85 . 2
2
88 . 1 8 . 1
=
=
+
+
UT UT
UT UT
frjol
inhibicin
!stdio cintico de la tripsina en asencia de inhibidor
*#strato- Clorhidrato de /;;ben!oil;+&;arinina paranitroanilida 6<24/28
Tiempo de reacci(n- 10min
abla )" #esultados del estudio cin*tico de la tripsina en ausencia de inhibidor
e$tra&do del %r&jol"
Tubo A410nm - .UA/min0 .m1/ml0 1/- .min/UA0 1/ .m2/m10
1 0,086 0,0086 0,019 116 53
2 0,135 0,0135 0,038 #3,8 2#
3 0,166 0,0166 0,056 60,2 18
4 0,195 0,0195 0,0#5 51,2 13
5 0,222 0,0222 0,094 45,1 11
6 0,250 0,0250 0,113 40,0 8,9
#
2
0,253 0,0253 0,131 39,5 #,6
8 0,281 0,0281 0,150 35,6 6,#
:m> 0.0?31m&@m A
ma.
> 0.03B172@min
M#estra de c)lc#los-
Concentraci(n del s#strato 6t#bo 18-
mL
mg mL
mg
mL
mL
S 019 . 0
8
5 . 0
! "
150
45
=
=
Aelocidad 6t#bo 18-
min
008 . 0
min 10
08 . 0
UA
UA
V = =
Aelocidad m).ima 6t#bo 18-
min
min
ma#
03$1 . 0
93$ . 2
1
UA
UA
V = =
:m 6t#bo 18-
mg
ml UA
UA mg
ml
m
K 031 . 0 03$1 . 0 991 . 1
min
min
= =
!stdio cintico de la tripsina en presencia de inhibidor e"trado de #r$ol
*#strato- Clorhidrato de /;;ben!oil;+&;arinina paranitroanilida 6<24/28
Tiempo de reacci(n- 10min
2
Este dato %ue eliminado par &acer las 'r(%icas 1 y 2.
abla 3" #esultados del estudio cin*tico de la tripsina en presencia de inhibidor
e$tra&do del %r&jol"
Tubo A410nm - .UA/min0 .m1/ml0 1/- .min/UA0 1/ .m2/m10
1 0,050 0,0050 0,019 200 53
2 0,0#5 0,00#5 0,038 133 2#
3 0,099 0,0099 0,056 101 18
4 0,120 0,0120 0,0#5 83,3 13
5 0,135 0,0135 0,094 #4,1 11
6 0,146 0,0146 0,113 68,5 8,9
# 0,158 0,0158 0,131 63,3 #,6
8
3
0,1#8 0,01#8 0,150 56,2 6,#
3
Este dato %ue eliminado par &acer las 'r(%icas 1 y 2.
Grfica 1. -3locid"d d3 l" r3"ccin c"4"li%"d" +or l" 4ri+,in" 3n 5uncin d3
l" conc3n4r"cin inici"l d3 6A7&A .con ! ,in inhibidor d3l 5rjol08
0
0,0025
0,005
0,00#5
0,01
0,0125
0,015
0,01#5
0,02
0,0225
0,025
0,02#5
0,03
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,0# 0,08 0,09 0,1 0,11 0,12 0,13 0,14 0,15 0,16
C
BAPNA
(mg/mL)
V
(
U
A
/
m
i
n
)
,in inhibidor
con hinibidor
Grfica 2. $r"5ic", d3 lin393":3r corr3,+ondi3n43, " r3"ccin inhibid" !
,in inhibir8
1/- ; 3,00#4.1/<0 ) 43,951
=
2
; 0,9904
1/- ; 1,6991.1/<0 ) 26,93#
=
2
; 0,994
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
*20 *15 *10 *5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
1/C
BAPNA
(mL/mg)
1
/
V
(
m
i
n
/
U
A
)
,in inhibidor
con inhibidor
:m> 0.0?C=m&@m A
ma.
> 0.022C72@min
M#estra de c)lc#los-
Concentraci(n de s#strato 6t#bo 18-
mL
mg mL
mg
mL
mL
S 019 . 0
8
5 . 0
! "
150
45
=
=
%elocidad 6t#bo 18-
min
0050 . 0
min 10
050 . 0
UA
UA
V = =
Aelocidad m).ima 6t#bo 18-
min
min
ma#
0228 . 0
951 . 43
1
UA
UA
V = =
:m 6t#bo 18-
mg
ml UA
UA mg
ml
m
K 084 . 0 03$1 . 0 00$4 . 3
min
min
= =
!#ecto del calentamiento sobre la acti%idad de los inhibidores de tripsina
abla 4" #esultados obtenidos e+pleando el inhibidor e$tra&do del %r&jol"
Tubo Ti3m+o .min0 A410nm UT % inhibicin
1 0 0,586 #3,3 *134
2 10 0,522 65,3 *109
3 20 0,566 #0,8 *126
4 30 0,630 #8,8 *152
5 40 0,644 80,5 *15#
6 50 0,#46 93,3 *198
# 60 0,680 85,0 *1#2
abla 5" #esultados obtenidos e+pleando el inhibidor e$tra&do del (arbanzo"
Tubo Ti3m+o .min0 A410nm UT % inhibicin
1 0 0,#20 90,0 *188
2 10 0,#58 94,8 *203
3 20 0,865 108 *246
4 30 0,835 104 *234
5 40 0,835 104 *234
6 50 0,865 108 *246
# 60 0,855 10# *242
abla ," #esultados obtenidos e+pleando el inhibidor e$tra&do de la so!a"
Tubo Ti3m+o .min0 A410nm UT % inhibicin
1 0 0,484 60,5 *93,4
2 10 0,490 61,3 *95,8
3 20 0,362 45,3 *44,6
4 30 0,492 61,5 *96,6
5 40 0,524 65,5 *109
6 50 0,3#8 4#,3 *51,0
# 60 0,458 5#,3 *83,0
7nidades de tripsina en a#sencia de inhibidor> 3.137T 6t#bo ? de la tabla 38
M#estra de c)lc#los-
7nidades de tripsina 6t#bo 1 tabla ?8-
5 ) 0
1
8
484 . 0
1
001 . 0
= =
mL
UA
UT
mL
UA
UT
4orcentaje de inhibici(n 6t#bo 1 tabla ?8-
4 . 93
3 . 31
100 5 . 0
100 % =
=
UT
UT
inhibicin
frjol
-uestionario
&' !"pli(e (e #actores a#ectan el contenido de inhibidores de tripsina'
"l contenido de inhibidores de tripsina, y en eneral, de protenas '#e act5an como
inhibidores de las en!imas proteolticas, dependen b)sicamente del tipo de %eetal
est#diado y de la manera en '#e este sea c#lti%ado, ya '#e es posible '#e al lle%ar
a cabo c#lti%os Den masaE se haa la adici(n de s#stancias '#e a#menten el %alor
n#tricional de los alimentos sin '#e se afecten, en lo posible, las caractersticas
propias como sabor y aspecto del alimento.
)' *os animales al in+erir le+minosas crdas peden presentar hipertro,a
pancr-tica' .Por ( ocrre y como a#ecta el or+anismo/
Grfica 3. >53c4o d3l c"l3n4"mi3n4o 3n 3l +orc3n4"j3 d3 inhibicin +"r" c"d"
3?4r"c4o8
*300,0
*2#5,0
*250,0
*225,0
*200,0
*1#5,0
*150,0
*125,0
*100,0
*#5,0
*50,0
*25,0
0,0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 #0 #5
tiempo calentamiento (min)
i
n
!
i
"
i
c
i
#
nFrijol
$"rb"n%o
o!"
&o '#e s#cede es '#e los inhibidores de tripsina dismin#yen la disponibilidad de la
metionina la c#al es necesaria para la sntesis de ciertas en!imas pancre)ticas '#e
son ricas en a!#fre. "sto lle%a a #na dismin#ci(n bastante pron#nciada en el
contenido de a!#fre en el c#erpo.
0' !"pli(e si e"iste al+na relacin entre los inhibidores de tripsina y los
componentes responsables de la acti%idad hemoa+ltinante'
&o '#e se ha obser%ado es '#e las s#stancias '#e prod#cen el efecto al#tinante
son las '#e tienen tambi$n #n efecto inhibitorio y '#e a#n'#e estas acti%idades
est)n liadas en #na mol$c#la, esta presenta dos partes separables las c#ales se
encaran cada #na de #n efecto es decir '#e #na parte tiene el efecto al#tinante y
otra el efecto inhibitorio de la tripsina.
1' .!n ( consiste el e#ecto +oitro+nico y ciano+nico de al+nas plantas/
"l efecto oitro$nico consiste en el alaramiento de la l)nd#la tiroides debido a
'#e esta, para s# correcto crecimiento, necesita yod#ro el c#al es atrapado por los
aentes oitro$nicos '#e p#eden ser dip$ptidos, trip$ptidos o licop$tidos, en #n
caso o en otro se ha encontrado '#e es #n licosido fen(lico el c#al s#fre #na
yodaci(n. "l efecto ciano$nico consiste en '#e [Link] al#nas plantas '#e
contienen #na en!ima capa! de hidroli!ar los r#pos nitrilo de ciertas mol$c#las el
c#al %a a formar FC/. *in embaro tambi$n se ha encontrado '#e en el intestino
delado [Link] al5n tipo de bacterias '#e p#ede lle%ar a cabo esta hidr(lisis
prod#ci$ndose tambi$n FC/ '#e ha sido detectado en la orina.
2' .3 es el #a%ismo y por ( se prodce/
"ste consiste en la dismin#ci(n de l#tati(n red#cido y en la acti%idad de la
l#cosa;?;fosfato deshidroenasa. "sto tiene como consec#encia la
desestabili!aci(n de la membrana de la c$l#la y al parecer las ca#santes de este
dese'#ilibrio son al#nas pirimidinas '#e se enc#entran en habich#elas 64icia
#a%a5 en forma de ;lic(sidos.
.iscusin de resultados ! conclusiones
"n c#anto a las pr#ebas de inhibici(n, se obt#%o #n mayor porcentaje de inhibici(n
con el [Link] de soya 6G?,=98, se#ido por el frjol 63G,=98 y el menor
porcentaje para el [Link] de arban!o 61H,298. "sto implica '#e la soya
contiene #n mayor contenido de inhibidores de la tripsina, y por lo tanto,
podra hablarse de #n menor %alor n#tricional para este alimento, con
respecto a los otros dos [Link] anali!ados. 2l est#diar el efecto del
calentamiento sobre la acti%idad de los inhibidores de tripsina, se encontr(
#na dismin#ci(n en el porcentaje de inhibici(n de la en!ima, tanto para el
frjol como para el arban!o. "sto '#iere decir '#e p#ede llear a eliminarse
casi en s# totalidad la acti%idad de estos inhibidores con #n tratamiento
t$rmico adec#ado. "n c#anto a la soya, no se obt#%o #na dismin#ci(n
notable en el porcentaje de inhibici(n, esto p#ede deberse a '#e al tener #n
mayor contenido de inhibidores estos no se afectan tan f)cilmente por #n
incremento en la temperat#ra. "l comportamiento obser%ado para este
[Link] es de tipo oscilante, de manera '#e no podemos concl#ir acerca
del efecto del calentamiento sobre los inhibidores '#e pro%ienen de este
alimento.
+ebe aclararse '#e los porcentajes de inhibici(n neati%os obtenidos en las tablas
=, G, y ? se deben a '#e se tomo como referencia de 1009 el t#bo ? de la tabla 3
en el c#al la reacci(n f#e lle%ada a cabo a 3BIC. "n el [Link] del efecto del
calentamiento el a#a en el termostato termin( con #na temperat#ra de G=IC. "sto
'#iere decir '#e es probable '#e #n mayor %alor en la temperat#ra hay promo%ido
la hidr(lisis del s#strato 6no catali!ada8 dando #nos %alores de absorbancia mayores
de lo esperado y dando #na mayor relaci(n 2@2
refernica
'#e incl#si%e p#ede ser mayor
a 1 y por lo tanto mayor a 1009. *in embaro, se p#ede hacer el an)lisis se5n la
tendencia de la r)0ca.
"n c#anto al est#dio cin$tico de la tripsina en a#sencia de inhibidor, se obt#%o #n
%alor para la constante de Michaelis de 0.0?31m&@m y #na %elocidad m).ima de
0.03B172@min. 2l lle%ar a cabo el est#dio cin$tico en presencia del inhibidor de frjol
se obt#%o #na constante de Michaelis de 0.0?C=m&@m y #na %elocidad m).ima de
0.022C72@min. "l %alor de :m es bastante similar en los dos casos, mientras '#e la
%elocidad m).ima dismin#ye en presencia del inhibidor, esto implica '#e se
presenta #na inhibici(n de tipo no competiti%o para los inhibidores pro%enientes del
[Link] de frjol.
/iblio(ra%&a
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