QUIMIOLUMINISCENCIA
Introduccin:
El uso analtico de la quimioluminiscencia (QL) est experimentando un creciente inters, ya que
representa una alternativa simple, barata y sensible para cuantificar una gran variedad de
compuestos.
Desde hace unos treinta aos, el fenmeno de la luminiscencia -originalmente una curiosidad del
laboratorio fsico-, se ha convertido en una rama de la espectrometra aplicada, dentro de la qumica
analtica.
Debido a la nueva instrumentacin y, especialmente a la incorporacin de tcnicas modernas,
algunas nuevas y otras tomadas de otras disciplinas, la QL y la bioluminiscencia (BL) se aplican de
forma rutinaria en el anlisis tanto cuali- como cuantitativo.
Aunque el fenmeno de la QL se conoce desde 300 aos a.C., el desarrollo de aplicaciones
analticas es relativamente reciente. Debido a su alta sensibilidad y selectividad, los mtodos
basados en detecciones QL suponen una herramienta analtica de gran utilidad. La primera
aplicacin de la QL como tcnica analtica la llev a cabo Erdey en 1957, que estudi el uso de
varias sustancias, como luminol, lofina y lucigenina, como indicadores volumtricos. Las
investigaciones sobre el potencial analtico de la QL para anlisis de rutina datan de los aos 70, en
el caso de reacciones en fase gaseosa, y de la dcada de los 80 para reacciones en fase lquida.
Desde entonces, los mtodos quimioluminiscentes han sido ms ampliamente utilizados,
fundamentalmente en anlisis bioqumico y ambiental, y el nmero de publicaciones y
comunicaciones sobre el tema ha ido incrementando de forma exponencial desde la celebracin del
primer Simposium Internacional sobre Bioluminiscencia y Quimioluminiscencia, celebrado en
Bruselas en 1978. De hecho, en el desarrollo de mtodos QL pueden diferenciarse dos periodos: una
primera etapa (1928-1940) caracterizada por la bsqueda de nuevos compuestos o sistemas
quimioluminiscentes, por medio de modificaciones qumicas de estructuras bien conocidas, y, desde
la 2 Guerra Mundial hasta el presente, un avance en la instrumentacin, junto con el desarrollo de
conceptos tericos de los, a veces, complejos principios de la QL.
Definicin:
La QL se define como la emisin de radiacin electromagntica (normalmente en la regin del
visible o del infrarrojo cercano) producida por una reaccin qumica. Cuando esta emisin proviene
de organismos vivos o sistemas derivados de ellos, se denomina bioluminiscencia. Ambos
fenmenos son procesos luminiscentes que se han identificado tradicionalmente mediante un prefijo
que identifica la fuente de energa responsable del inicio de la emisin de radiacin
electromagntica.
Como la intensidad de emisin es funcin de la concentracin de las especies qumicas implicadas
en la reaccin QL, las medidas de la intensidad de emisin pueden emplearse con fines analticos.
Una ventaja de las tcnicas QL es que permiten emplear una instrumentacin bsica bastante
sencilla, ya que el sistema ptico no requiere fuente externa de excitacin. La QL se describe a
menudo como una tcnica de campo oscuro: la ausencia de niveles altos de luz de fondo, que s
ocurren en espectrofotometra y fluorimetra, reduce el ruido y permite mejorar los lmites de
deteccin. La instrumentacin para medidas de QL vara desde sistemas muy simples hasta
instrumentacin ms compleja, pudindose usar un fluormetro simplemente con la fuente de
excitacin apagada.
No obstante deben considerarse algunas limitaciones en el anlisis por QL, como la dependencia de
la emisin quimioluminiscente de varios factores ambientales que deben ser controlados, la falta de
selectividad, ya que un reactivo quimioluminiscente no se limita a un nico analito, y finalmente,
como ocurre en otros sistemas de deteccin en flujo, la emisin quimioluminiscente no es constante
sino que vara con el tiempo (el flash de luz est compuesto de una seal que se produce tras la
mezcla de los reactivos, alcanza un mximo y despus cae hasta la lnea de base), y este perfil de
emisin frente al tiempo puede variar ampliamente en diferentes sistemas quimioluminiscentes, por
lo que hay que extremar el cuidado para detectar la seal en sistemas en flujo, midiendo en periodos
de tiempo bien definidos.
Fenomenos luminiscientes:
Luminiscencia: Todo fenmeno de emisin de radiacin electromagntica desde un estado excitado
PROCESOS LUMINISCENTES: Conjunto de tcnicas caracterizadas por la produccin de especies
en estado excitado cuyo espectro de emisin, al regresar al estado fundamental, suministra
informacin para el anlisis cualitativo y cuantitativo
Fluorescencia, Fosforescencia y quimioluminiscencia, en todos ellos las molculas del analito se
exitan para generar una especie cuyo espectro de emisin suministra informacin para el anlisis
cualitativo y cuantitativo.
La Fluorescencia y la fosforescencia se parecen en que se consiguen mediante la absorcin de
fotones, como consecuencia se le alude a menudo a los dos fenmenos con el termino de
fotoluminiscencia.
La fluorescencia los tiempos de vida de los estados exitados son cortos y en la fosforescencia los
tiempos de vida de los estados exitados son largos
Fotoluminiscencia la excitacin tiene lugar por absorcin de fotones.
Quimioluminiscencia la energa de excitacin proviene de una reaccin qumica.
Mecanismos de las reacciones quimioluminiscentes:
En general, una reaccin quimioluminiscente puede ser desarrollada mediante dos mecanismos
bsicos (Garca-Campaa y Baeyens, 2001), los cuales estn representados en la figura 1.
En general, una reaccin QL puede generarse mediante dos mecanismos bsicos (Figura 1).
En una reaccin directa, dos reactivos, normalmente un substrato y un oxidante en presencia de
algunos cofactores, reaccionan para formar un producto o intermedio de la reaccin, algunas veces
en presencia de un catalizador. Despus, parte del producto o intermedio pasa a un estado
electrnicamente excitado, que puede a continuacin relajarse hasta el estado fundamental con
emisin de un fotn. El substrato es el precursor QL, que se convierte en la molcula excitada
electrnicamente, responsable de la emisin de luz, o bien acta para transferir la energa en la QL
indirecta. El catalizador, enzima o ion metlico, reduce la energa de activacin y proporciona el
ambiente adecuado para la produccin de una alta eficiencia QL durante el proceso. Los cofactores
son necesarios en ocasiones para convertir uno o ms de los substratos en una forma capaz de
reaccionar e interaccionar con el catalizador, o para proporcionar un grupo saliente eficaz cuando
se requiere un marcado para producir el emisor excitado.
Por el contrario, la QL indirecta o sensibilizada se basa en un proceso de transferencia de energa de
la especie excitada a un fluorforo. En el caso de molculas que no pueden emitir directamente QL,
este proceso permite transferir su exceso de energa a un fluorforo que a su vez es excitado,
volviendo a su estado fundamental con la emisin de un fotn. Todas estas etapas dan lugar a una
gran variedad de aplicaciones prcticas de la QL en la fase slida, lquida y gaseosa.
En ambos casos, el papel del catalizador es rebajar la energa de activacin, producindose una
quimioluminiscencia de alta eficacia, y los cofactores son necesarios para favorecer la excitacin
efectiva del emisor
Caractersticas de la QL como tcnica analtica:
Como la velocidad de la reaccin es funcin de las concentraciones de reactivos, la QL es una
tcnica adecuada para el anlisis cuantitativo. La utilidad de los sistemas quimioluminiscentes en
qumica analtica se basa en algunas caractersticas especiales, que se comentan a continuacin.
a) La tcnica comprende simultneamente caractersticas cinticas y luminiscentes, por lo que
proporciona una alta sensibilidad y un amplio rango dinmico. Si QL es lo suficientemente
alta, se pueden alcanzar lmites de deteccin excelentes, en el rango de los femtomoles. Como
ejemplo, en la fase gaseosa, los lmites de deteccin habituales son de 10 pmol de NO empleando
ozono, y 0.1 pmol para compuestos sulfurados empleando una llama de hidrgeno seguida de
ozono; en la fase lquida, puede detectarse hasta 1 fmol de fluorforo empleando el sistema
quimioluminiscente con peroxioxalato, y 0.1 fmol de peroxidasa usando luminol. En comparacin
con otras tcnicas espectromtricas, la QL es aproximadamente 105 veces ms sensible que la
espectrometra de absorcin y al menos 103 veces ms sensible que la fluorimetra.
b) Comparada con los procesos de fotoluminiscencia, no se requiere fuente de excitacin externa, lo
que ofrece algunas ventajas, como la ausencia de dispersin y seales fotoluminiscentes de fondo,
la desaparicin de problemas relacionados con la inestabilidad de la fuente externa, reduccin de
interferencias debidas a procesos de excitacin no selectivos, y una instrumentacin ms simple.
c) La selectividad y la linealidad son ms dependientes de la reaccin y de las condiciones de
reaccin escogidas. Como ocurre con los procesos fotoluminiscentes, la absorcin o emisin de
radiacin por el analito, producto o cofactores, pueden causar prdida de linealidad o interferencias
espectrales.
d) La tcnica es verstil para la determinacin de una amplia variedad de especies que pueden
participar en el proceso quimioluminiscente, como: substratos o precursores quimioluminiscentes
responsables del estado excitado; el reactivo necesario para la reaccin (normalmente un oxidante);
algunas especies que afectan la velocidad o la eficacia de la reaccin: activadores, como
catalizadores (enzimas o iones metlicos), o inhibidores, como reductores que disminuyen la
emisin quimioluminiscente; fluorforos en el caso de QL sensibilizada; algunas especies que no
estn directamente implicadas en la reaccin QL pero que pueden reaccionar con otros reactivos en
reacciones acopladas para generar un producto que es un reactivo en la reaccin QL; especies que
pueden formar derivados con algn precursor quimioluminiscente o fluorforo, determinndose
mediante QL directa o sensibilizada.
e) Dependiendo de la naturaleza del analito y de la reaccin QL, el incremento o disminucin de la
intensidad de QL estar directamente relacionada con la concentracin de analito.
f) Las reacciones quimioluminiscentes pueden acoplarse fcilmente como mtodo de deteccin en
cromatografa, EC o inmunoensayo, proporcionando informacin cualitativa o cuantitativa sobre
una gran variedad de especies en las fases gaseosa y lquida. Como regla emprica, es probable que
un compuesto exhiba QL cuando l o su producto derivado muestren propiedades fluorescentes. Es
posible que la oxidacin de tal especie produzca QL, aunque hay muchas excepciones a esta regla
general.
Aplicaciones:
Las grandes aplicaciones analticas de la QL como mtodo de deteccin en inyeccin en flujo,
cromatografa lquida (CL) y electroforesis capilar (EC), junto con el gran potencial del
inmunoensayo, hacen de esta tcnica un campo de investigacin muy interesante en una amplia
variedad de disciplinas, que incluyen tcnicas de separacin en anlisis qumico, biolgico,
farmacutico, biomdico y alimentario, control de calidad, etc.
Las tendencias ms actuales en qumica analtica implican la aplicacin de la QL como sistema de
deteccin, combinada con EC como mtodo previo de separacin, proporcionando una selectividad
y sensibilidad analtica excelentes y permitiendo la resolucin y cuantificacin de varios analitos en
mezclas relativamente complejas.
Hasta la dcada de los noventa, la deteccin por QL no haba sido acoplada a la EC, pero en estos
ltimos aos, se han publicado importantes desarrollos por parte de algunas compaas y grupos de
investigacin, por lo que se esperan futuras contribuciones sobre el tema.
El nmero de reacciones quimioluminiscentes citadas en bibliografa, con aplicaciones en qumica,
biomedicina, alimentacin, medioambiente y toxicologa, se ve incrementado anualmente.
Combinado con separaciones por cromatografa lquida de alta resolucin (CLAR) , se han
empleado varias reacciones quimioluminiscentes, entre otras con peroxioxalato, luciferasa,
lucigenina y luminol, siendo la ms comn la reaccin con peroxioxalato en deteccin post-
columna acoplada a cromatografa lquida, tanto convencional como empleando microcolumnas.
Asimismo, se han empleado sistemas de flujo continuo con deteccin basada en QL, para la
determinacin de varios frmacos y analitos de inters biolgico.
Hoy en da, el inters analtico de la QL est aumentando considerablemente debido a las ventajas
ya comentadas, como bajos lmites de deteccin, rangos dinmicos amplios, alta sensibilidad y la
gran versatilidad de los mtodos QL. Recientemente, las investigaciones se estn centrando
especialmente en el desarrollo de productos quimioluminiscentes para aplicaciones de diagnstico
clnico; as, la QL es hoy en da un posible sustituto del marcado isotpico, remplazando as el uso
de radioistopos. La QL se aplica tambin en el control de calidad de productos crnicos y residuos,
existiendo igualmente aplicaciones en la medida del ozono ambiental. Considerablemente ventajosa
resulta la sensibilidad que ofrecen las reacciones basadas en QL en diversos mbitos del anlisis
aplicado, por ejemplo en la determinacin de compuestos prohibidos en diversas matrices. As, el
inters de la QL en qumica analtica en la ltima dcada queda demostrado por el nmero de
artculos publicados en revistas de gran prestigio (Analytical Chemistry, The Analyst, Analytica
Chimica Acta, Fresenius Zeitschrift fr Analytische Chemie, Journal of Microcolumn Separations,
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, entre otras) y por la aparicin de una revista
especfica: Journal of Biological and Chemical Luminescence.
Siguiendo la tendencia general en qumica analtica, la mejora en los mtodos de deteccin est
dirigida actualmente a la miniaturizacin y, por lo tanto, a reducir el gasto de disolventes orgnicos
en mtodos de separacin, empleando ms sistemas acuosos y volmenes de muestra menores con
concentraciones inferiores. Como las tcnicas quimioluminiscentes pueden proporcionar mejoras en
estas situaciones, la instrumentacin para medidas quimioluminiscentes y el desarrollo de
acoplamientos con interfaces selectivas fsicas o qumicas que permitan medidas selectivas estn
tambin dirigidos a conseguir este fin, de modo que puedan eliminarse las desventajas de las
tcnicas basadas en medidas directas de QL (como falta de selectividad o dependencia de factores
fsico-qumicos). As, se estn publicando progresivamente avances especficos en cromatografa,
EC, inmunoensayo y en el uso de reactores enzimticos. Desde este punto de vista, los sistemas
miniaturizados (microchip) son muy atractivos, ya que puede resolver el problema de los lmites
de deteccin poco satisfactorios caractersticos de estos sistemas.
Asimismo, el problema del gasto de disolvente est potenciando gradualmente el uso de sistemas
analticos de separacin miniaturizados, tales como la cromatografa lquida capilar y de columnas
de pequeo dimetro (narrow-bore) frente a la CLAR, cromatografa en capa fina de alta
resolucin miniaturizada, y recientemente EC. Debido a que la QL puede resolver las limitaciones
en la deteccin en estos casos, resulta previsible el desarrollo de este acoplamiento en la prxima
dcada. Como ejemplo, puede mencionarse un sistema descrito recientemente, basado en deteccin
quimioluminiscente de enzimas y que emplea la tcnica denominada microensayo a travs de
electroforesis (EMMA, electrophoretically mediated microassay), que permite la deteccin de
enzimas a niveles de zeptomoles, tanto en capilares abiertos como en canales realizados en
microchips, detectndose la oxidasa y catalasa a niveles de 9000 molculas y empleando una
instrumentacin relativamente econmica.
Sin ninguna duda, cuando se compara con otros mtodos de deteccin convencionales y potentes
(fluorescentes o electroqumicos), la deteccin QL es una tcnica en pleno desarrollo y sus avances
se dirigen hacia el desarrollo de nuevos detectores ms simples que los ya existentes y que ofrezcan
la posibilidad de determinar varias clases de analitos a niveles traza.
Quimioluminiscencia del luminol:
Todos los test usados en la deteccin de sangre se basan principalmente en la actividad de las
enzimas peroxidasas presentes en la sangre, las cuales reaccionan con los agentes qumicos
causando un cambio de color. Algunas de las pruebas usadas son: el test de benzidina, de
leucomalaquita verde, fenolftaleina o tetrametil benzidina. Pero uno de los ms famosos es el
uso del Luminol, que se utiliza en qumica forense para detectar trazas de sangre. ste
compuesto es un derivado del cido ftlico que cataliza la oxidacin con perxido de hidrgeno
bajo emisin de luz, es decir su mayor importancia reside en la reaccin de
qumioluminiscencia que da con perxidos en presencia de complejos de hierro como
catalizador.
En investigaciones sobre crmenes sangrientos, el luminol se utiliza para identificar restos de
sangre porque emite luz en su presencia, aunque haya sido lavada o hayan pasado aos de su
remocin Esto ocurre porque el luminol produce quimiluminiscencia al oxidarse. Para que esto
ocurra, debe haber un agente oxidante, un catalizador y un medio alcalino. Esta reaccin se
ejecuta usando el Fe (III) presente en la sangre como catalizador, perborato de sodio (NaBO4)
como agente oxidante, y bicarbonato de sodio (NaHCO3) como medio alcalino.
El Fe(III) de la sangre no es el nico catalizador que puede inducir la quimioluminiscencia. Los
metales de transicin, la peroxidasa, los hipocloritos y algunos barnices pueden servir como
catalizadores, pero producen diferente intensidad de luz y color, as como la duracin de la
luminiscencia.
Este tipo de luminiscencia es producida durante una reaccin qumica, sin aumento notable en
la temperatura, por lo que tambin es llamada luz fra. Es producida por el cambio de orbital
que hace un electrn que se encuentra en un orbital elctrico de alta energa hasta un orbital de
menor energa, liberando un fotn. Ejemplos de quimiluminiscencia son la oxidacin del
fsforo, la luz producida por organismos como lucirnagas o peces abisales y las pulseras
luminosas.
La sangre puede acelerar la reaccin a 1 ppm. Debido a esto se puede apreciar la
quimioluminiscencia de un color azul intenso, aunque el lugar haya sido lavado, o se haya
tratado de remover la sangre de alguna manera, incluso muestra manchas que tienen varios aos
de antigedad. Se puede aplicar en diferentes superficies como tela, madera, vidrio, cemento o
cartn. Es ms difcil obtener resultados positivos en superficies impermeables como el vidrio o
plsticos que en superficies absorbentes como telas o madera, ya que estas ltimas permiten
que los restos de sangre se conserven en condiciones apropiadas para la prueba. Es aplicado en
completa oscuridad para apreciar la luminiscencia producida, y no interfiere en anlisis de
DNA posteriores. Deben tomarse precauciones al manipularlo, usar bata y lentes de seguridad,
careta y guantes. El rea donde se realiz la prueba debe airearse despus de haber concluido
los experimentos.
Para llevar a cabo esta reaccin es necesario un agente oxidante que es una sustancia capaz de
aceptar electrones en una reaccin qumica, Un catalizador, una sustancia que sin formar parte
de los productos finales, facilita o impide la reaccin. Se puede recuperar al final de la reaccin
sin alterarse, no modifica la constante de equilibrio de la reaccin y ayuda a vencer la energa
de activacin. Y por ltimo un medio bsico con un pH mayor a 10.
En la reaccin a evaluar, el luminol se oxida con el perborato de sodio en un medio alcalino
inducido por el bicarbonato de sodio y en presencia de un catalizador, en este caso el Fe de la
sangre. Se oxida con el perborato de sodio, que reemplaza y libera dos nitrgenos, lo que causa
que el luminol llegue al estado de excitacin. Esto provoca la emisin de un fotn, que se
aprecia como un brillo azulado.
Instrumentacin bsica:
La medida de la luz emitida por una reaccin qumica o bioqumica est relacionada con la
concentracin de las especies participantes: la produccin total de luz est directamente relacionada
con la cantidad de luz emitida y, consecuentemente, es proporcional a la concentracin de la especie
concreta. Por esta razn, la medida de luz emitida es un indicador de la cantidad de analito presente
y al instrumento bsico que es capaz de realizar estas medidas se le llama luminmetro.
Una de las ventajas ms importantes de la QL como tcnica analtica es la simplicidad de la
instrumentacin, que incluye como componentes principales: una clula de reaccin, un
compartimento cerrado a la luz, un dispositivo de inyeccin y mezcla de reactivos y/o de muestra,
un detector de luz y un sistema de adquisicin y procesador de seal (Figura 7). En el
compartimento cerrado se coloca la clula de reaccin (un tubo de ensayo, un microplato, una
clula de flujo, etc.) con objeto de que toda la luminiscencia sea captada por el detector. Este
compartimento debe estar sellado a luz ambiental para evitar posibles interferencias y se debe
colocar tan cerca como sea posible del detector para conseguir una mxima eficiencia ptica.
Espejos, lentes y otros dispositivos adicionales se pueden utilizar para aumentar el ngulo de
deteccin y conseguir una alta eficiencia ptica, al objeto de obtener una relacin seal-ruido
ptima; as, se obtiene un instrumento rpido y preciso. La funcin del compartimento es mantener
la mezcla de reactivo y muestra, a una temperatura adecuada y en completa oscuridad a fin de aislar
el detector de la luz externa. Normalmente no es necesario el uso de monocromadores porque la
intensidad de QL que surge de una de las especies no se ve apenas afectada en su distribucin
espectral, por la presencia de otras especies.
En las tcnicas de QL, una vez mezclados los reactivos y la muestra comienza la reaccin
quimioluminiscente y la intensidad de la emisin que se est produciendo, disminuye una vez que
los reactantes se han agotado. Esto supone que el carcter de la emisin quimioluminiscente es
transitorio, y que la escala de tiempo depende de la reaccin en cuestin, que va de un corto flash a
una emisin continua. Este hecho es crucial para la seleccin del sistema ms conveniente para la
incorporacin de los reactivos.
Sistema utilizado en el acoplamiento de la cromatografa inica a la deteccin
quimioluminiscente (CI-QL):
Para el acoplamiento de la cromatografa inica a la deteccin por quimioluminiscencia se utiliz el
sistema representado en la figura 2.3. Este sistema estuvo constituido por tres componentes
principales:
Transporte de los reactivos postcolumna
Para el transporte de los reactivos se emplearon dos canales: El primero fue utilizado para la
disolucin del agente oxidante (perborato o percarbonato sdicos), mientras que en el segundo se
impulsaba la disolucin que contena al luminol disuelto en el amortiguador borato a pH alcalino.
Esta segunda disolucin se mezclaba en una unin tipo T con el eluyente que emerga de la cabeza
de la columna y que poda contener a los iones Cu(II) y Co(II). Finalmente todas las disoluciones se
mezclaban en el interior de la celda del detector, donde se produca la emisin quimioluminiscente.
Figura 2.3 Esquema del acoplamiento CI-QL.
Al principio y en ausencia de los iones la emisin es constante y de baja intensidad por lo que
constitua la lnea base, tan pronto comenzaba a emerger de la columna alguno de los iones, se
observaba un incremento sostenido de la emisin hasta alcanzar un valor mximo para luego decaer
formando un registro en forma de pico.
Separacin cromatogrfica
Se emple un sistema cromatogrfico simplificado, en el cual slo se utilizaron algunos de los
componentes del cromatgrafo. El sistema neumtico (figura 2.5) consisti en una botella de
polipropileno de 3 litros de capacidad que contena al eluyente bajo una presin de N2 de 0,6 bar.
La bomba de pistones del cromatgrafo fue utilizada para el transporte del eluyente hacia la vlvula
de inyeccin de ocho entradas. Un volumen determinado de las disoluciones de las muestras o de
los patrones eran introducidas por medio de una jeringa al puerto de inyeccin, para luego entrar al
torrente de eluyente por accin de la presin neumtica que accionaba la vlvula de inyeccin tan
pronto se presionaba el botn del interruptor, inicindose simultneamente el registro de las seales
quimioluminiscentes.
Deteccin
Se emple el detector quimioluminiscente descrito anteriormente. En este acoplamiento, la primera
entrada a la celda corresponda a la solucin de los analitos que emergan de la columna, mientras
que la mezcla luminol-perborato era introducida por la segunda entrada. La reaccin
quimioluminiscente catalizada por los iones metlicos se produca en el interior de la celda.
En un registro tpico de la separacin cromatogrfica inicialmente se produce una seal constante o
lnea base, debido a que la mezcla luminol-oxidante en ausencia de los cationes tambin emite
radiacin electromagntica. Tan pronto como el ion catalizador (Cu(II) o Co(II)) se incorporaba a la
mezcla, se produca el aumento en la intensidad hasta alcanzar un valor mximo. Luego, la seal
disminua hasta alcanzar nuevamente la emisin de la lnea base; lo que indicaba que todo el catin
haba salido del sistema. Parmetros como tiempo de retencin (tr), volumen de retencn (Vr), rea
(A), altura (a) y ancho del pico (w), se obtuvieron de la integracin de las seales cromatografas,
utilizando para ello el software Clarity mencionado anteriormente.
Figura 2.8 Representacin de un registro tpico del sistema de acoplamiento CI-QL
