Finalidad .

Principio .
Caractersticas del sistema .
Metodologia .
Reactivo
1. -
Sistema para determinacin de la -Amilasa en muestras
de sangre, orina y otros lquidos biolgicos.
La -Amilasa hidroliza el sustrato -(2-cloro-4-nitrofenil)-
-1,4-galactopiranosilmaltosida (Gal-G2- -CNP), liberando 2-cloro-4-
nitrofenol (CNP) y 1,4-galactopiranosilmaltosida (Gal-G2). La velocidad
de formacin de 2-cloro-4-nitrofenol puede ser medida fotomtricamente
y proporciona una medida directa de la actividad de la -Amilasa en la
muestra.
-Amilasa
Gal-G2- -CNP + H O Gal-G2 + CNP
Los mtodos ms recientes para
la determinacin de la -Amilasa se basan en la produccin de
p-nitrofenol a partir de la hidrlisis de sustratos de oligosacridos bien
definidos, con grupos bloqueadores ligados en el glcido terminal. La
accin hidroltica de la -Amilasa en estos oligosacridos produce
varias cadenas de diferentes tamaos, siendo necesario acoplar
reacciones enzimticas auxiliares para liberar el p-nitrofenol. En muchos
casos la presencia de trazas de amilasa, como contaminante de las
enzimas auxiliares, disminuye considerablemente la estabilidad de estos
sustratos.
El ensayo propuesto utiliza un sustrato cromognico, 2-cloro-4-
nitrofenol, unido a 1,4-galactopiranosilmaltosida (Gal-G2). La -Amilasa
acta directamente sobre este sustrato, liberando una cantidad mayor al
90 %del cromgeno CNP, cuya velocidad de formacin puede ser medida
cinticamente. Se utiliza un sustrato en medio lquido, que no requiere el
empleo de enzimas auxiliares para la formacin del producto coloreado,
obtenindose entonces una prolongada estabilidad del sustrato.
El sistema Labtest se correlaciona muy bien con los mtodos que utilizan
sustratos bloqueados con benzilidina o etilidina y demuestra poseer una
mejor sensibilidad con una linealidad hasta de 20 veces el valor de
referencia superior.
El mtodo es fcilmente aplicable en analizadores automticos capaces
de medir una reaccin cintica a 405nm.
Sustrato Gal-G2- -CNP.
Contiene tampn 50 mmol/L, -(2-cloro-4-nitrofenil)- -1,4-
galactopiranosilmaltosida 3,0 mmol/L, cloruro de sodio 300 mmol/L,
cloruro de calcio 5 mmol/L, tiocianato de potasio 900 mmol/L, azida
sdica 14,6mmol/L, estabilizadores y surfactantes.

[Solamente para uso diagnstico in vitro.]
Sustrato - Almacenar entre 2- 8C.
2
Los reactivos no abiertos, cuando almacenados en las condiciones
indicadas, son estables hasta la fecha de expiracin impresa en el rtulo.
Durante su manipuleo estn sujetos a contaminaciones de naturaleza
qumica y bacteriana que pueden provocar reduccin de la estabilidad.
Pipetear el sustrato con la boca, soplar sobre el sustrato, usar material
contaminado con sudor o saliva y conversar junto al frasco destapado,
son acciones que pueden contaminar el reactivo con cantidades
mi croscpi cas de sudor o sal i va capaces de deteri orar
irremediablemente el sustrato.
Como ocurre en todas las reacciones enzimticas, la rigurosa
observacin del tiempo y de la temperatura de incubacin es de enorme
importancia para la calidad de los resultados obtenidos.
Estudios de estabilidad mostraron que la absorbancia del sustrato,
medida contra agua, presenta un incremento de 0,006 por mes.
Elevaciones repentinas de la absorbancia del sustrato indican una
contaminacin con saliva o sudor.
No utilizar el reactivo cuando su absorbancia medida contra agua a
405 nm sea igual o mayor que 0,300 o cuando el sustrato se muestre
turbio o con seales de contaminacin.
Se deben aplicar los cuidados habituales de bioseguridad en la
manipulacin de los reactivos.
El sustrato contiene azida sdica que es txica. Hay que tomar cuidado
para evitar la ingestin y en caso de contacto con ojos y piel se deben
lavar inmediatamente con gran cantidad de agua y buscar auxilio mdico.
La azida puede formar compuestos altamente explosivos con las tuberas
de plomo y cobre. Por ello, utilizar abundante cantidad de agua para
descartar el reactivo.
El reactivo contiene tambin tiocianato de potasio que es venenoso. No
ingerir.
Fotmetro con cubeta termostatizada, capaz de medir con exactitud la
absorbancia en 405nm;
Pipetas para dispensar muestras y reactivo;
Cronmetro.
Se debe crear un Procedimiento Operacional Estndar (POE) que
establezca procedimientos adecuados para recoger, preparar y
almacenar la muestra. Destacamos que los errores debidos a la muestra
pueden ser mayores que los errores ocurridos durante el procedimiento
analtico.
Materiales necesarios y no suministrados
1.
2.
3.
AMILASA CNPG Liquiform
Instrucciones de Uso
Ref.: 25
01 Espanhol - Ref.: 25
Precauciones y cuidados especiales
1
Muestra
Usar suero o plasma (heparina) y lquidos (asctico, duodenal o pleural).
Las muestras con Citrato, EDTA u Oxalato no deben ser usadas porque
producen resultados falsamente disminuidos.
La actividad enzimtica es estable 7 das entre 15 - 25 C y varios meses
entre 2 - 8 C. No usar muestras con seales de contaminacin
bacteriana.
Las muestras de orina deben ser recogidas en el intervalo de 2a 24horas.
Cuando se determina la amilasa en una muestra de una miccin, se debe
determinar tambin la creatinina en la misma muestra. El resultado se
deber reportar como Relacin Amilasa/Creatinina (U/g), con el objetivo
de compensar las variaciones de la actividad de la amilasa en las
muestras obtenidas en cada miccin. Las muestras de orina deben
almacenarse entre 2- 8C. No adicionar conservador alguno.
Para descartar los reactivos y el material biolgico, debern aplicarse las
normativas locales, regionales o federales de proteccin ambiental.
Valores de bilirrubina hasta 20 mg/dL y hemoglobina hasta 180 mg/dL
no interfieren en la reaccin. Valores de triglicridos hasta 1800 mg/dL no
producen interferencias. Valores de triglicridos entre 1800 y
3500 mg/dL producen una interferencia negativa de aproximadamente el
10%.
Medicamentos colinrgicos, narcticos (morfina) y alcohol producen
resultados falsamente elevados de la amilasa srica.
La presencia de macroamilasa en la muestra de suero, que resulta del
complejamiento de la amilasa con protenas de elevado peso molecular,
puede producir resultados falsamente elevados de la amilasa srica en
ausencia de pancreatitis.
En un tubo 12x75pipetear 1,0mL de Sustrato.
Aadir 0,02 mL de muestra, homogeneizar y transferir
inmediatamente a la cubeta termostatizada a 370,2 C. Esperar 1
minuto.
Hacer la lectura de la absorbancia inicial (A ), disparando
simultneamente el cronmetro. Repetir la lectura despus
de 2 minutos
(A ).
Para veificar la linealidad de la reaccin, hacer tambin una lectura con
intervalo de 1 minuto y verificar si la diferencia de absorbancia en cada
minuto es constante.
1.
2.
3.
1
2
Como ningn test conocido puede asegurar que las muestras de material
biologico no transmiten infecciones, todas ellas deben ser consideradas
como potencialmente infecciosas. Por lo tanto, al manipularlas se deben
seguir las normas establecidas para bioseguridad.
Calculos .
1.
2.
3.
4.
Ejemplo
Vase linealidad.
Es prctica habitual calcular los resultados de la actividad enzimtica
utilizando un factor obtenido en condiciones ptimas de reaccin las que
incluyen:
Longitud de onda: 405nm0,2nm.
Cubeta termostatizada a 37 0,2 C con 1,0 cm de espesor de
solucin.
Ancho medio de banda 8nm.
Luz espuria 0,1%.
Como en la mayora de las veces no es posible trabajar bajo estas
condiciones, las buenas prcticas de laboratorio recomiendan realizar la
calibracin del ensayo utilizando un calibrador de enzimas indicado por el
fabricante del reactivo. Labtest recomienda la lnea Calibra para
calibracin del sistema Amilase CNPGLiquiform.
(A - A )
A=
2
Actividad de la Amilasa (U/L) = Ade la Prueba x 3953
El factor fue calculado segn las condiciones de reaccin propuestas.
Hay que calcular un nuevo factor cuando cualquier modificacin sea
efectuada. Ver mtodo para el clculo del factor.
A de la Prueba =0,197
A de la Prueba =0,266
(0,266- 0,197)
Ade la Prueba = =0,034
2
Actividad de la Amilasa (U/L) =0,034x 3953=134
Amilasa(U/L) x Volumen de orina (mL)
Amilasa Urinaria (U/h) =
1000x tiempo de recoleccin (h)
Amilasa (U/L) x 100
Relacin Amilasa / Creatinina (U/g) =
Creatinina (mg/dL)
VT x 1000
Factor de calibracin =
x VMx d
VT =Volumen total del ensayo (1,02mL)
VM=Volumen de la muestra (0,02mL)
1000=Factor de conversin de U/mL a U/L
d =Camino ptico de la cubeta (1cm)
= absortividad milimolar del 2-cloro-4-nitrofenol a 405 nm, pH 6,0 a
37C(12,9)

2 1
1
2
Amilasa Orina / Hora
Relacin Amilasa / Creatinina
Mtodo para el clculo del factor
Interferencias
02 Espanhol - Ref.: 25
Procedimiento
Amilasa en orina (U/L) x Creatinina en suero (mg/dL)
Relacin (%) = x 100
Amilasa en suero (U/L) x Creatinina en orina (mg/dL)
Estos valores se deben usar nicamente
como orientacin. Se recomienda que cada laboratorio establezca en la
poblacin atendida su propio rango de valores de referencia.
25a 125U/L
Hasta 30U/h
Hasta 400U/g
1,0a 4,0%
Conversin de U/L para Unidades SI: kat =U/L x 0,0167
En dos muestras con concentraciones de amilasa iguales a
95, 148 y 482 U/L, se aadieron cantidades diferentes de analitos,
obtenindose recuperaciones de entre el 93,5 y el 95,9 %. El error
sistemtico proporcional medio obtenido fue igual a 5,3%.
El mtodo propuesto fue comparado con un mtodo
que usa un sustrato CNPG3 utilizando 40 muestras con valores situados
entre 7,9 y 988U/L. La comparacin result en la ecuacin de regresin
y = 1,003x - 1,646 con un coeficiente de correlacin (r) igual a 0,998.
En los niveles de decisin iguales a 75, 125 y 400U/L la diferencia
sistemtica fue igual a 1,8; 1,0y 0,3%respectivamente.
Utilizndose la absorbancia mnima
detectable como parmetro, se verific que el lmite de sensibilidad
fotomtrica es 3,9U/L, correspondiendo a una absorbancia igual a 0,001.
Valores de referencia .
Caractersticas del desempeo
Exactitud .
Especificidad .
Sensibilidad metodolgica .
Suero / Plasma
Orina
Relacin Amilasa urinaria / Creatinina urinaria
Depuracin de la Amilasa / Depuracin de la Creatinina

8
Ejemplo
Calibraciones manuales
Sistemas automticos
Intervalo de las calibraciones
1,02x 1000
Factor = =3953
12,9x 0,02x 1
La absortividad molar del 2 cloro-4-nitrofenol, producto
de la reaccin, es utilizada como sistema de referencia para la calibracin
del ensayo.
Obtener el factor de calibracin al hacer la manutencin del instrumento o
cuando cambiar las aplicaciones.
Blanco de reactivos: agua o solucin del NaCl 150mmol/L (0,85%);
Usar calibradores de la lnea Calibra - Labtest. Las concentraciones de la
Amilasa en los calibradores de la lnea Calibra son trazables al
absortividad molar del 2cloro-4-nitrofenol.
Calibracin del blanco al usar nuevo frasco de reactivo;
Calibracin de 2o 3puntos al cambiar el lote;
Calibracin de 2o 3puntos cuando el control interno de la calidad indicar
El resultado de la medicin es lineal hasta 2000 U/L. Para valores ms
altos, diluir la muestra con solucin NaCl 150 mmol/L (0,85%), realizar
una nueva medicin y multiplicar el resultado obtenido por el factor de
dilucin. Diluir la muestra de modo tal que el valor encontrado se site
entre 100 y 1500 U/L. Se sugiere la verificacin de la linealidad
metodolgica y fotomtrica como mnimo semestralmente, utilizando
muestras con valores de hasta 2000U/L.
Se sugiere utilizar las prepaciones estabilizadas de la lnea Qualitrol -
Labtest para el control interno de la calidad en ensayos del laboratorio
clnico.
En la mayora de los casos de pancreatitis aguda ocurren
elevaciones concomitantes de la amilasa srica y de la urinaria, pero en
ciertos casos, la elevacin de la amilasa urinaria no es acompaada por
una elevacin paralela de la amilasa srica. Por lo tanto, la validez de la
relacin depuracin de la amilasa/depuracin de la creatinina, expresada
en porcentaje, proporciona un mayor valor diagnstico en los casos de
pancreatitis aguda y pancreatitis recurrente.
Para ello, se debe determinar la actividad de la amilasa y la concentracin
de la creatinina, ambas en suero y en orina, y aplicar los resultados en la
siguiente frmula :
Calibracin .
Control interno de la calidad .
Relacin depuracin de la amilasa / depuracin de la
creatinina .
El laboratorio debe mantener un
programa de control interno de calidad que defina con claridad los
reglamentos aplicables, objetivos, procedimientos, criterios para
especificaciones de la calidad y lmites de tolerancia, acciones
correctivas y registro de las actividades. Controles deben ser utilizados
para evaluar la imprecisin e desviaciones de calibracin. Se sugiere que
las especificaciones para el coeficiente de variacin mximo y el error
total sean basados en los componentes de la variacin biolgica (VB) .
5,6,7
03 Espanhol - Ref.: 25
Linealidad
Media
85
131
397
DE
1,32
1,25
2,10
CV (%)
1,55
0,95
0,53
N
9
20
20
2 Muestra
3 Muestra
Muestra 1
Repetitividad - imprecisin intra-ensayo
Media
85
131
397
DE
2,28
2,19
2,74
CV (%)
2,69
1,67
0,69
N
9
20
20
2 Muestra
3 Muestra
Muestra 1
Reproducibilidad - imprecisin total
Efectos de la dilucin de la matriz .
Observaciones
1.
2.
3.
Referencias
Dos muestras con valores
iguales a 2146 y 2281 U/L fueron utilizadas para evaluar la respuesta del
sistema en las diluciones de la matriz con NaCl 150 mmol/L (0,85%).
Usando factores de dilucin que variaron de 2 a 4, la media encontrada
fue 103,8%.
La limpieza y secado del material utilizado son factores fundamentales
para la estabilidad de los reactivos y obtencin de resultados correctos.
El laboratorio clnico tiene como objetivo fornecer resultados exactos
y precisos. La utilizacin de agua de calidad inadecuada es una causa
potencial de errores analticos. El agua deionizada o destilada utilizada en
el laboratorio debe tener la calidad adecuada para cada aplicacin. As,
para preparar reactivos y usar en las mediciones y para su uso en
enjuague final de la vidrera, debe tener resistividad 1 [Link] o
conductividad 1 microsiemens/cm y concentracin de silicatos
<0,1 mg/L. Cuando la columna desionizadora est con su capacidad
saturada, se produce agua alcalina con liberacin de varios iones,
silicatos y sustancias con gran poder de oxidacin o reduccin que
deterioran los reactivos en pocos das o incluso horas, alterando los
resultados de modo imprevisible. Por lo cual es fundamental establecer
un programa de control de la calidad del agua.
Para una revisin de las fuentes fisiopatolgicas y medicamentosas
de interferencia en los resultados y en la metodologa, se sugiere
consultar: Young DS. Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests,
3 edio, Washington: AACCPress, 1990.
1. Toyobo Bioche. Study on determination of Amylase activity using 2-
chloro-4-nitrophenyl- -galactosylmaltoside (Gal-G2- -CNP), 1999.
2. Kaufman RA, Tietz NW: Clin. Chem. 1980; 26:846-53.
3. Pesce AJ, Kaplan LA: Methods in Clinical Chemistry, St. Louis: The C.V.
Mosby Co., 1987:817-830.
4. RosemblumJL: Clin. Chem. 1992; 38:920.
8. Labtest: Datos de Archivo

5. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem 1981;27:493-
501.
6. Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa Molecular,
Base de Dat os de Var i aci n Bi ol gi ca. Di spon vel
em: <ht t p: //www. seqc. es/ar t i cl e/ar t i cl evi ew/330/1/170>
(acesso em04/2006).
7. Basques JC. Especificaes da Qualidade Analtica. Labtest
Diagnstica 2005.
Estn disponibles aplicaciones
garantiza el desempeo de este producto dentro de
las especificaciones hasta la fecha de expiracin indicada en los rtulos,
siempre que los cuidados de utilizacin y almacenamiento indicados en
los rtulos y en estas instrucciones sean seguidos correctamente.
para sistemas automticos y semi-
automticos.
[Trminos y Condiciones de Garanta]
Labtest Diagnstica
Informaciones al consumidor
04 Espanhol - Ref.: 25
CNPJ: 16.516.296 / 0001 - 38
Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - Vista Alegre - CEP 33400-000
Lagoa Santa . Minas Gerais Brasil - [Link]
Labtest Diagnstica S.A.
Servicio de Apoyo al Consumidor e-mail: sac@[Link]
Revisin: Junio, 2006
Ref.: 170309
Copyright by Labtest Diagnstica S.A.
Reproduccin bajo previa autorizacin
Presentacin
Producto Referencia Contenido
25-2/30
Amilasa CNPG
Liquiform
2 x 30 mL
1
05 Espanhol - Ref.: 25
06 Espanhol - Ref.: 25
Smbolos utilizados com produtos diagnsticos in vitro
Smbolos usados con productos diagnsticos in vitro
Symbols used with ivd devices
Representante Autorizado na Comunidade Europeia
Representante autorizado en la Comunidad Europea
Authorized Representative in the European Community
Contedo suficiente para < n > testes
C
C
ontenido suficiente para < n > tests
ontains sufficient for < n > tests
Data limite de utilizao (aaaa-mm-dd ou mm/aaaa)
Estable hasta
Use by
(aaaa-mm-dd o mm/aaaa)
(yyyy-mm-dd or mm/yyyy)
Limite de temperatura (conservar a)
Temperatura limite
Temperature limitation
(conservar a)
(store at)
Material Calibrador
Material Calibrador
Calibrator Material
Material Calibrador
Material Calibrador
Calibrator Material
Consultar instrues de uso
Consultar instrucciones de uso
Consult instructions for use
Adies ou alteraes significativas
Cambios o suplementos significativos
Significant additions or changes
Liofilizado
Liofilizado
Lyophilized
Produto diagnstico in vitro
Dispositivo de diagnstico in vitro
In vitro diagnostic device
Nmero do catlogo
Nmero de catlogo
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Corrosivo
Corrosivo
Corrosive
Controle negativo
Control negativo
Negative control
Controle positivo
Control positivo
Positive control
Controle
Control
Control
Controle
Control
Control
Marca CE
Marcado CE
CE Mark
Txico
Txico
Poison
Reagente
Reactivo
Reagent
Nmero do lote
Denominacin de lote
Batch code
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Riesgo biolgico
Biological risk
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