UNIVERSIDAD AUTNOMA BENITO JUREZ DE
OAXACA
Facultad de Ciencias Qumicas
Laboratorio de Inmunologa
Titular: QB. Antonio Girn
REPORTE DE PRCTICA N. 1
Pruebas Cruzadas
MESA # 4
Alumnos:
Cruz Hernndez Diego Sait
Patricio Jimnez Vctor Eduardo
Ros Ros William de Jess
Ruiz RosBrbara
Zrate Ramos Rosa Andrea
6
to
Semestre Grupo: A
Ciclo Escolar: 2014 2014
Marzo de 2014, Oaxaca; Oaxaca
INTRODUCCIN .
Las pruebas cruzadas son procedimientos relativamente sencillos pero de
gran cuidado, que tienen como propsito garantizar la compatibilidad serolgica (in
vitro) entre la muestra de sangre del receptor y la unidad de sangre que se le
pretende transfundir.
La validez de las pruebas cruzadas radica en la correlacin que existe entre
las pruebas de compatibilidad realizadas in-vitro y la sobrevida de los hemates en
la circulacin del paciente.
Como mencionamos, el objetivo de las pruebas de compatibilidad es prevenir
la transfusin de sangre incompatible (definimos como compatibilidad de
transfusin como la falta de reaccin inmune entre antgenos (Ag) y anticuerpos
(Ac) de donante y receptor, donde la compatibilidad no garantiza identidad entre
ambos, solamente indica que, en ese momento, no habr disminucin de
rendimiento transfusiones por causa inmune)
Desde este punto de vista las pruebas cruzadas deben garantizar:
La compatibilidad de ABO y Rh entre el receptor y la unidad que se
pretende transfundir.
Que el suero del receptor no existan anticuerpos de importancia clnica
contra los antgenos eritrocitarios del donante.
Que en el plasma de la unidad de sangre no existan anticuerpos de
importancia clnica contra los antgenos eritrocitarios del receptor.
Entre las medidas de seguridad transfusional estn aquellas encaminadas a
evitar la reaccin hemoltica aguda, es decir, las que aseguran la compatibilidad
entre donante-receptor.
OBJETIVOS .
Realizar pruebas cruzadas de compatibilidad sangunea para:
Garantizar que los eritrocitos a transfundir son ABO compatibles con el
receptor.
Detectar anticuerpos en el suero del receptor que estn dirigidos contra
antgenos presentes en los eritrocitos del donante.
FUNDAMENTO .
Las pruebas de compatibilidad sangunea se efectan rutinariamente en
solucin salina al 0.85 %, en este medio los anticuerpos que aglutinan son
principalmente de la clase IgM.
Las pruebas cruzadas son dos y reciben este nombre porque se hace
reaccionar en tubo:
El plasma o suero del receptor con los glbulos rojos del donador (prueba
mayor).
El suero o plasma del donador con los glbulos rojos del receptor (prueba
menor)
Estas pruebas sirven para asegurar que todos los glbulos rojos transfundidos
son compatibles con los anticuerpos que contiene el plasma del paciente. As
como tambin, para evitar estimular la produccin de nuevos anticuerpos contra
los glbulos rojos en el receptor especialmente anti -Rh D.
Las pruebas cruzadas se dividen en:
a) PRUEBA MAYOR:
Consiste en poner a reaccionar el suero del receptor con los eritrocitos
del donador. En la prueba mayor se verifica los anticuerpos del paciente
(plasma o suero) que se encuentran en gran volumen, contra los glbulos
rojos del receptor.
b) PRUEBA MENOR:
Consiste en poner a reaccionar el suero del donador con los eritrocitos
del receptor. Esta prueba se realiza cuando se va a transfundir plasma.
El empleo de albmina bovina facilita la deteccin de anticuerpos de la clase
IgG. Ya que stos muy frecuentemente se ven impedidos en su efecto aglutinante
por el potencial Z.
Estas pruebas son requerimiento fundamental, porque es la mejor manera de
detectar anticuerpos que puedan daar las clulas rojas transfundidas y causar
una reaccin hemoltica transfusional.
PROCEDIMIENTO .
A. Equipo, Material y Reactivos Necesarios
Reactivos
Los reactivos debern de ser de grado analtico
Solucin salina isotnica 0.9%
Solucin de albumina bovina al 22%
Materiales
4 tubos de ensaye de 13x100
Pipetas Pasteur desechables
Parafilm
Tubos Vacutainer con y sin EDTA
Ajugas para venopuncion
Torundas de alcohol
Torniquete
Material Biolgico
Suero de donador y receptor.
Suspensin de eritrocitos al 5% de donador y receptor
Aparatos e instrumentos
Centrfuga.
Bao mara a 37 C
B. Desarrollo de la Practica
Preparacin de las Muestras Biolgicas
1. Extraccin de una muestra de sangre venosa.
a) Realizar la extraccin de una muestra de sangre
total por puncin venosa en un tubo con EDTA y
uno sin anticoagulante. Ambas muestras debern
obtenerse tanto para el donador como para el
receptor.
b) Esperar 15 minutos para que la muestra sin aditivo coagule
completamente.
c) Centrifugar la muestra sin
anticoagulante para obtener el suero
durante 5 minutos a 2500 r.p.m.
d) Concluido el proceso de centrifugacin verificar que el
gel separador se encuentre entre las dos fases de la sangre
total y que el suero sea transparente y no presente hemlisis.
2. Preparacin de la suspensin de eritrocitos.
a) De la sangre total con EDTA bien mezclada colocar 10 gotas en un tubo de
ensaye, agregar solucin salina isotnica hasta partes del tubo de
ensaye, colocar parafilm en la boca del tubo, mezclar suavemente por
inversin.
b) Centrifugar durante 3 minutos a 1500 rpm.
c) Transcurrido el tiempo de centrifugacin decantar con cuidado el
sobrenadante y desecharlo.
d) Volver a adicionar solucin salina isotnica como en el inciso a y repetir el
mismo procedimiento que en b y c de manera que se deben realizar un total
de 3 lavados.
e) Una vez que se tenga el paquete de eritrocitos lavados, resuspenderlo en
solucin salina isotnica para obtener una concentracin aproximada del
5%.
Procedimiento.
Fase I. Salina rpida.
1. En un tubo marcado como PM (Prueba Mayor), colocar dos gotas de la
suspensin de eritrocitos del donador y dos gotas del suero del receptor.
Mezclar suavemente.
2 Gotas de
suero del
Receptor
2 Gotas de
Suspensin
eritrocitaria
del Donador
2. En un segundo tubo, marcado como pm (prueba menor), colocar dos gotas
de la suspensin de eritrocitos del receptor y dos gotas del suero del
donador. Mezclar suavemente.
3. Centrifugar ambos tubos a 1000 rpm durante 60
segundos.
4. Observar el sobrenadante de ambos tubos en busca
de hemlisis. Resuspender suavemente el, botn de
los eritrocitos en busca de aglutinacin. Anotar los
resultados.
Fase II. Albmina.
5. En caso de no observar aglutinacin en los tubos de la
fase I, agregar a ambos tubos dos gotas de la solucin de
albmina bovina al 22%. Mezclar suavemente.
6. Incubar a 37 C durante 15 minutos.
2 Gotas de
Suspensin
eritrocitaria
del Receptor
2 Gotas de
suero del
Donador
7. Transcurrido el periodo de incubacin centrifugar ambos tubos a 1000 rpm
durante 60 segundos.
8. Resuspender suavemente el botn de eritrocitos y buscar la presencia de
aglutinacin. Anotar sus resultados.
RESULTADOS .
Dentro del desarrollo de la prctica usamos dos grupos sanguneos diferentes
pertenecientes al sistema AB0, y se realizaron las pruebas de forma siguiente:
Prueba Salina Rpida. 00
Donador (Vctor): Grupo 0
Receptor (Sal): Grupo 0
Paquete
Eritrocitario.
Donador.
Grupo 0
Suero.
Receptor.
Grupo 0
Suero.
Donador.
Grupo 0
Paquete
Eritrocitario.
Receptor.
Grupo 0
En la Prueba Mayor (PM)
entre grupos 00 no hay
aglutinacin. Los anticuerpos
y los antgenos son
compatibles y por tanto la
aglutinacin no se
presentara.
En la prueba menor (pm)
entre los grupos 00 no se
presento aglutinacin.
Sucede el mismo caso que
con la PM, sin embargo se
realizaran a la PM y la pm la
prueba de albumina.
Prueba Salina Rpida. A0
Donador (Vctor): Grupo 0
Receptor (Alan): Grupo A
Paquete
Eritrocitario.
Donador.
Grupo 0
Suero.
Receptor.
Grupo A
Suero.
Donador.
Grupo 0
Paquete
Eritrocitario.
Receptor.
Grupo A
En la prueba menor (pm) entre
los grupos 0A se presento
aglutinacin. Esto se debe a
que los antgenos presentes en
los eritrocitos del grupo A
interacciona con los anticuerpos
presentes en el suero del grupo
0, puesto que el grupo 0 posee
anticuerpos Anti-A y Anti-B,
provocando as la aglutinacin en
los eritrocitos.
En la Prueba Mayor (PM) entre
grupos A0 no hay aglutinacin.
Los eritrocitos del grupo 0 no
presentan antgenos que
interacten con los anticuerpos
del suero del grupo A y por tanto
no hay aglutinacin.
Prueba. Albmina. Grupos 00
A los tubos de PM y pm de los grupos 00, donde no hubo aglutinacin se realizo
la prueba de Albumina.
PM No hubo aglutinacin
Al no presentar
aglutinacin significa que
la sangre del receptor y el
donador son
COMPATIBLES.
pm No hubo aglutinacin
DISCUSIN .
Las determinaciones de grupos sanguneos son pruebas de alta demanda en
cualquier laboratorio clnico, sea para el simple conocimiento del tipo de sangre o
para un propsito determinado, sin que este siga algoritmos adecuados de control
de calidad. Estos casos, sin aprobarlos, pueden pasar desapercibidos las simples
tcnicas usadas.
En banco de sangre esto no debe pasar por alto. En la prctica se han
analizado las posibilidades de las diferentes reacciones antgeno-anticuerpo que
se pueden presentar sangre, cuando se encuentran en contacto fluido sanguneo
(tanto plasma como sangre) de diferentes individuos; se ha establecido que
incluso individuos con sangre que en un principio parecen similares, pueden no
ser compatibles y por tanto generar problemas de salud importantes. Por tal
motivo se debe hacer nfasis en el control de calidad de los laboratorios mediante
la aplicacin de tcnicas cruzadas (pruebas cruzadas) para evitar reacciones no
deseables.
Las pruebas cruzadas deben ser obligatorias, realizando toda la metodologa
correspondiente. Un resultado negativo en una reaccin entre individuos de dos
tipos de sangres diferentes no se puede considerar como una compatibilidad
segura. Factores como el potencial Z, la variabilidad de grupos antignicos
presentes en la membrana, el desequilibrio entre la concentracin Ag-Ac
(postzona y persona) generan resultados ambiguos.
Se aaden 2 gotas de
albumina a cada tubo, se
llevan a bao mara a 37C por
15 min, y se centrifugan a
1000 rpm por 1 min.
Las reacciones inmunolgicas entre antgenos y anticuerpos no son simples
aglutinaciones como los que se analizan en las practicas, dentro del organismo,
estas desencadenas patologas graves y es por eso la importancia de estas.
CONCLUSION .
La respuesta inmune generada por el organismo frente a un antgeno se
fundamenta en reacciones de los anticuerpos contra estos antgenos. La
presencia de antgenos sobre la membrana de los eritrocitos permite obtener una
visin clara de estas respuestas, cuando existe una interaccin de estos eritrocitos
con anticuerpos xenbioticos o viceversa.
Las reacciones antgeno-anticuerpo se pueden determinar mediantes pruebas
bsicas y tpicas de laboratorio, como lo son las pruebas de grupo sanguneo
comunes. Estas pruebas nos permiten cuantificar de manera cualitativa
respuestas inmunolgicas sobre antgenos del sistema ABO, observando
reacciones de aglutinacin o de hemlisis. El anlisis de estas reacciones
aglutinantes y/o de hemlisis ilustran las una interaccin entre un antgeno y un
anticuerpo, lo que est determinado por una respuestas inmune. Cuando no se
observan estas caractersticas, podemos imaginar en un principio que no existe tal
respuesta inmune. Hablando en trminos de una transfusin de sangre, estas
reacciones se pueden traducir en compatibilidad o no compatibilidad de sangre
entre donadores y receptores.
En las prcticas de transfusin es importante no cometer errores en la
determinacin de estas reacciones, as como en su apreciacin.
Es por eso de la importancia de realizar pruebas cruzadas, en donde, a sabiendas
de las diferentes interacciones que nos resultaran sin compatibilidad y por tanto
una aglutinacin y/o hemlisis, debemos tener la absoluta certeza de una
compatibilidad. Dos individuos con la mismo tipo de sangre no pueden estar
descartados de una incompatibilidad. La membrana del eritrocito presenta una
variedad de antgenos que pueden afectar la reaccin antgeno-anticuerpo, o
antgenos que no son potencialmente inmunogenos; pueden existir factores como
el potencial Z, que alteran en cierto grado la reaccin. Por tal motivo las pruebas
cruzadas son tcnicas obligatorias para el control de calidad de un laboratorio de
transfusin.
CUESTIONARIO .
1. Menciona al menos cuatro sistemas de clasificacin de grupos sanguneos.
Sistema ABO.
Sistema Rh.
Sistema MNS.
Sistema Lutheran.
Sistema Diego.
Sistema Duffy.
2. Explica el concepto de potencial Z aplicado a las membranas de los eritrocitos.
La superficie de los glbulos rojos tiene carga elctrica negativa debido a las
molculas de cido silico de la membrana. Cuando los hemates estn en
suspensin en soluciones que contienen iones libres, los cationes son atrados por
las cargas negativas de la superficie del glbulo rojo, de modo que se forma una
nube inica positiva alrededor de los glbulos rojos que, por estar constituida por
cargas elctricas del mismo signo, crear una repulsin entre los eritrocitos. Esta
repulsin se conoce con el nombre de potencial Zeta.
3. Cmo est constituida una inmunoglobulina?
Una molcula de inmunoglobulina (Ig) o tambin llamada anticuerpo es una
glicoprotena que se produce por los linfocitos B o sus clulas derivadas, las clulas
plasmticas; tiene una estructura nuclear simtrica compuesta de dos cadenas
ligeras idnticas y dos cadenas pesadas idnticas; dichas cadenas contienen una
serie de unidades repetidas, homologas, de aproximadamente 110 aminocidos de
longitud, que se pliegan en una estructura globular llamada dominio de Ig.
Un dominio de Ig tiene dos capas de lmi na plegadas en , ambas se mantiene
unidas mediante un enlace disulfuro y hlices adyacentes a cada lamina se
conectan mediante asas cortas. Las cadenas pesadas y ligeras constan de regiones
amino terminales variables (V) que participan en el reconocimiento del antgeno y de
regiones carboxilo terminales constantes (C); las regiones C de las regiones
pasadas median las funciones efectoras.
BIBLIOGRAFA .
Abbas, Abul K. Inmunologa Celular y Molecular. 7 Edicion, Editorial
ELSEVIER, Barcelona, Espaa, 2012.
Murphy Kennet, Travers Paul, Walport Mark. Inmunobiologia de Janeway.
7 Edicion, Editorial McGraw-Hill. Impreso en Mexico, 2008
Roit. Inmunologa, Fundamentos. 10 Edicion, Editorial Medica
Panamericana, Barcelona, Espaa.
Kuby. Inmunologa. 6 Edicion. Editorial McGraw-Hill, Impreso en Mxico,
2007.
