Ivn Ferrer Rodrguez, PhD

Catedrtico
Identificacin bioqumica de los
bacilos Gram-negativos
Captulo 9
Hoja de Reporte de Desconocidos
2
Bacilos gram negativos
Identificacin de bacterias:

Morfologa de colonias

Pruebas bioqumicas en tubos

Sistema de identificacin rpidos

Sistema de identificacin automatizados

Ensayos de biologa molecular



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Pruebas bioqumicas
Utilizacin de hidratos de carbono:

Fermentacin de lactosa: glucosa + galactosa:
galactoside permeasa enzima trasportadora
galactosidasa hidrolisa lactosa

Se utiliza la glucosa mediante gluclisis (Figura 9.1)

Bacterias con galactosidasa solamente son fermentadores lentos.

El uso de los carbohidratos puede ser mediante oxidacin (aerbicamente) o
fermentacin (anaerbicamente).

MacConkey



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Pruebas bioqumicas
Prueba de oxidacin fermentacin (OF):

Se usa para diferenciar la familia Enterobacteriaceae (fermentadores) de los
pseudomonads y organismos similares (no fermentadores).

Contiene 1% de carbohidratos y 0.2% de peptonas.

Indicador azul de bromotimol (Figura 9.2):
Verde medio sin inocular
Amarillo medio cido
Azul medio alcalino

Se inoculan dos tubos:
Aerbico
Anaerbico se cubre con aceite mineral



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Pruebas bioqumicas
Tripple Sugar Iron Agar (TSI) & Kligers Iron Agar (KIA) Figura 9.3:

tiles en la identificacin de patgenos intestinales.

TSI contiene:
Glucosa 0.1%
Lactosa 1.0%
Sacarosa 1.0%
Sulfato ferroso
Tiosulfato de sodio (H
2
S)
Peptona
Rojo fenol (pH 7.4)
indicador amarillo bajo 6.8

KIA slo tiene glucosa y lactosa.

Inoculacin, incubacin y lectura de resultados pgina 216:

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Pruebas bioqumicas
Ortho-nitrophenyl- -D-galactopyranoside (ONPG):

Se utiliza para diferenciar los microorganismos fermentadores de lactosa lentos,
de los NO fermentadores.

Se usan discos con ONPG, estructura similar a lactosa.

ONPG entra rpidamente al interior de la clula bacteriana, sin la necesidad de
utilizar la -galactsido permeasa.

Es metabolizado por la galactosidasa y libera galactosa y o-nitro-fenol
generando un color amarillo.

Bacterias que producen pigmentos amarillos NO se deben probar.

Es similar a p-nitrophenyl- -D-galactopyranoside (PNPG).
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Pruebas bioqumicas
Ortho-nitrophenyl- -D-galactopyranoside (ONPG):

Se puede hacer preparando una suspensin de bacterias en salina y aadiendo un
disco comercial o tableta de ONPG.

Se incuba a 37 C y se examina a las 6 horas.

Dado que la galactosidasa es una encima inducible:

El gen slo se expresa si hay lactosa o un sustrato similar

La bacteria debe obtenerse de un medio que contenga lactosa


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Pruebas bioqumicas
Methyl Red, Voges-Proskauer (MR-VP) (IMViC):

Se usa para clasificar las Enterobacterias.

La glucosa en el medio puede ser metabolizada por los microorganismos a
travs de distintas vas metablicas.

Segn la va utilizada, se originarn productos finales cidos (cido lctico, cido
actico, cido frmico), o productos finales neutros (acetil metil carbinol).

Con la adicin de un indicador como rojo de metilo (MR) se puede detectar la
presencia de productos cido (Figura 9.5).

Glucosa cido pirvico fermentacin cido-mixta (pH 4.4)

Color rojo con el indicador rojo metilo


9
Pruebas bioqumicas
Methyl Red, Voges-Proskauer (MR-VP) (IMViC):

Mediante la adicin de alfa naftol e hidrxido de potasio (VP) se puede
evidenciar la presencia de productos finales neutros (Figura 9.5).

Glucosa cido pirvico acetoina Diacetyl + KOH + naftol

Color rojo en presencia de 2-3 Butanediol

Algunas bacterias son negativas para ambas pruebas.

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Pruebas bioqumicas
Decarboxylation Test:

Las descarboxilasas son tiles en la diferenciacin de las Enterobacterias.

Se usan comnmente dos aminocidos: lisina, ornitina y arginina.

Cuando los aminocidos pierden el grupo carboxilo, se convierten en aminas
que incrementan el pH del medio y el indicador (bromocresol prpura) cambia
a violeta.

Las bacterias se inoculan en medios complejos que contienen lisina, ornitina o
arginina al 1% y un indicador de pH (bromocresol prpura).


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Pruebas bioqumicas
Deaminase Test (Figura 9.6):

Las desaminasas catalizan la prdida de NH
3
en un aminocido originando un
cido carboxlico.

Se inoculan tubos inclinados conteniendo un medio complejo y fenilalanina.

Despus de la incubacin se aade una solucin de cloruro frrico al 10%, el
cual reacciona con el acido y se torna oscuro.


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Pruebas bioqumicas
Utilizacin de citrato (IMViC) (Figura 9.7):

Se usa para clasificar las Enterobacterias.

Se basa en la capacidad de usar citrato como nica fuente de carbono y energa
ya que el medio contiene:
Citrato de sodio nica fuente de carbono.
Fosfato monoamnico nica fuente de nitrgeno.

El azul de bromotimol es el indicador de pH, que cambia a color azul en medio
alcalino.

El metabolismo del citrato se realiza en aquellas bacterias poseedoras de citrato
permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico.

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Pruebas bioqumicas
DNasa:

Las DNasas son endonucleasas que
rompen los enlaces fosfodiester del
DNA generando unidades
pequeas.

Algunas bacterias producen DNasas
extracelulares:
Staphylococcus aureus
Serratia marcescens






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Pruebas bioqumicas
DNasa:

El medio contiene DNA al 0.2%.

Se hace un inculo pesado en lnea recta.

Se incuba a 35 C y se examina a las 18-24 horas.

Se aade HCl y se evala la formacin de un precipitado negro.
DNA no hidrolizado es insoluble en HCl y se precipita.
Oligonucletidos se disuelven en el HCl y se ve un rea clara.

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Pruebas bioqumicas
DNasa:

Tambin se puede utilizar Agar
DNasa, el cual es un medio diferencial .

Contiene nutrientes, DNA y verde de
metilo como indicador, el cual se une al
DNA cargado negativamente.

Cuando el DNA se rompe, ya no se une
al verde de metilo y se aparece un halo
claro alrededor del organismo:
Staphylococcus aureus negativo
Serratia marcescens positivo
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Pruebas bioqumicas
Licuefaccin de la gelatina:

La mayora de los polmeros son demasiado grandes para ser transportados
dentro de las clulas.

Las bacterias secretan enzimas extracelulares que hidrolizan los polmeros y
transportan los monmeros al interior de la clula.

La produccin de proteasas, como la gelatinasa, es evaluada incorporando una
protena (gelatina o casena) en un medio slido en placa.

La placa se inunda con cido que precipita la protena no hidrolizada.


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Pruebas bioqumicas
Produccin de indol (IMViC):

Detecta la liberacin de indol en un cultivo bacteriano.

La liberacin de indol se debe a la degradacin del aminocido triptfano, un
aminocido constituyente de muchas peptonas, mediante la enzima triptofanasa.

Su usa un caldo de triptona, NaCl al 0.5% y el reactivo de Kovacs.

Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al aadir el reactivo de Kovacs al
medio, se producir un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba
ser considerada positiva.

Si da negativo a las 24 horas, se repite a las 48 horas.




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Pruebas bioqumicas
Utilizacin de malonato:

Se hace para determinar la
capacidad de utilizar malonato de
sodio como fuente de carbono.

El caldo de malonato tiene azul de
bromotimol como indicador de pH.

Las bacterias que usan malonato
tambin sulfato de amonio como
fuente de N
2
.

Positivo por aumento en alcalinidad
al usar sulfato de amonio, cambia
indicador de verde a azul (Figura 9-
10).

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Pruebas bioqumicas
Motilidad:

La motilidad de las bacterias es consecuencia de la presencia de flagelos.

El movimiento se puede observar en cultivos frescos utilizando un microscopio
de luz compuesto.

La motilidad debe distinguirse del movimiento Browniano debido a las
corrientes en la preparacin.

Se puede hacer en medios de cultivo conteniendo agar al <4%.

Se inocula el organismo en el centro de forma recta y se incuba a 35 C (y a
temperatura ambiente) por 18-24 horas.

Se examina y se compara con en medio sin inocular.
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Pruebas bioqumicas
Reduccin de nitrato y nitrito:

Se detecta una respiracin anaerobia en la que usa nitrato como aceptor final de
electrones.

Los nitratos se reducen a nitritos mediante una reductasa de nitrato y en algunas
bacterias, los nitritos se reducen a productos gaseosos (N
2
y N
2
O) mediante
reductasa de nitrito.

Se inoculan medios conteniendo nitrato potsico y el nitrito se detecta
aadiendo alfanalfilamina y cido sulfanlico producindose un color rojo.

Para saber si el nitrato se redujo a gas:
Tubo Durham.
Aadir zinc en polvo, color rojo indica presencia de nitrato.
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Pruebas bioqumicas
Oxidasa:

La prueba de oxidasa determina la presencia del sistema de citocromo oxidasa.

Es una prueba til en la identificacin de No-fermentadores (Pseudomonas spp.) y
Neisseria spp., los cuales son positivos.

Permite diferenciar entre las Enterobacterias (negativos) y los No-
fermentadores (positivos).

Hay varios mtodos disponibles, incluyendo la prueba de Kovac (0.5-1% de
diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina).

Se aade una gota a un papel de filtro y se toca la colonia con
un palito de madera o algodn y se frota contra el reactivo.

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Pruebas bioqumicas
Oxidasa:

El desarrollo de un color lavanda en
10-15 segundos se considera
positivo.

Oxidasa positivo - Pseudomonas
aeruginosa

Oxidasa negativo - Escherichia coli

El reactivo tambin puede aadirse
directamente sobre la colonia, pero


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Pruebas bioqumicas
Ureasa:

Se usa para determinar la capacidad de un organismo de usar la urea formando
dos molculas de amoniaco por la accin del enzima ureasa.

Las bacterias se inoculan en un medio con glucosa-peptona, urea al 2% y rojo
fenol como indicador de pH.

La enzima hidroliza la urea (H
2
N-CO-NH
2
) y origina amonio, el cual genera un
aumento en el pH, el cual puede detectarse con el indicador.

Es caracterstica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para
diferenciar este gnero de otras enterobacterias que dan negativo o positivo
tardo.


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Pruebas bioqumicas
Lysine Iron Agar (LIA) asignacin




25
Pruebas bioqumicas
Sulfide-indole-motility (SIM):

Es til para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol
y de sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo.

El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovacs o de
Erlich, para originar un compuesto de color rojo.

Las cepas mviles pueden apreciarse por la turbidez que producen alrededor de
la puncin.

Las cepas productoras de sulfhdrico se distinguen por la formacin de un
precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato, siempre que el
medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

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Pruebas bioqumicas
Motility-Indole-Ornithine Agar (MIO):

Medio usado para la identificacin de Enterobacteriaceae.

Por su composicin, es posible detectar tres reacciones en un mismo tubo:
movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol.

La movilidad se demuestra por un turbidez en el medio o por crecimiento que
se difunde ms all de la lnea de inoculacin.

La reaccin positiva a la ornitina est dada por un color prpura del medio.
La fermentacin de glucosa baja el pH y cambia el indicador a amarillo.
La acidez provee condiciones ptimas para la actividad de la enzima.
La ornitina decarboxilasa decarboxila la ornitina presente.
Se alcaliniza el medio y cambia el prpura de bromocresol a color prpura.
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Sistemas de identificacin manuales

Los sistemas de identificacin comerciales e basan en:

Reacciones basadas en pH

Reacciones enzimticas

Utilizacin de carbono

Deteccin de crecimiento bacteriano

Deteccin de cidos grasos voltiles y no-voltiles por cromatografa

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Sistemas de identificacin manuales

Normalmente se incluye una
computadora o libros con cdigos
numricos basados en el perfil
metablico de los microorganismo.

API (Analytical Profile Index) para
identificar Enterobacterias en el
mercado desde 1970.
API 20E

20 cpsulas liofilizadas en una tirilla
con sustratos basados en pH.

Se prepara una suspensin de
bacterias, se inocula, se incuba 18-
24 horas y se lee.



Se genera un cdigo de 7 dgitos.

Requiere oxidasa, no incluida.

Pruebas extras: nitrato y motilidad.
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Sistemas de identificacin manuales

ID Tri-Panel

Paneles para la identificacin de organismos Gram-negativos y Gram-positivos
usando pruebas bioqumicas.

Se pueden probar hasta tres organismos en un panel.

El panel contiene 104 microtubos con sustratos congelados y agentes
antimicrobianos para determinar susceptibilidad.

Se utiliza un sistema computarizado para leer y analizar el panel.

Se utilizan reacciones adicionales: catalasa y oxidasa.




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Sistemas de identificacin manuales

ID Tri-Panel

Paneles para la identificacin de organismos Gram-negativos y Gram-positivos
usando pruebas bioqumicas.

Se pueden probar hasta tres organismos en un panel.

El panel contiene 104 microtubos con sustratos congelados y agentes
antimicrobianos para determinar susceptibilidad.

Se utiliza un sistema computarizado para leer y analizar el panel.

Se utilizan reacciones adicionales: catalasa y oxidasa.




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Sistemas de identificacin manuales
Otros:

Crystal E/NF (Becton Dickinson)

RapID NS Plus (Remel)

Microbact (Oxoid)

Enterotube II (Becton Dickinson)

Uni-N/F Tek (Remel)

GN2 MicroPlate (Biolog)

Biolog tiene una de las bases de datos ms grandes.



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Sistemas de identificacin automatizados

MicroScan

Sensititre

Vitek

BD Phoenix 100

Sherlock








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Resumen:
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