UFPS, Facultad de ciencias agrarias y
Del ambiente, Ingeniera Biotecnolgica, Biologa Molecular, 2013 Informe Vi
POLIMORFISMOS DE LONGITUD DE FRAGMENTOS DE RESTRICCION
Zully Viviana Cceres (1610010), Zully Zenitih Ferrer carrillo (1610614), Luz Francy Yez Meneses (1610653) Entregado el 12 de Noviembre de 2013 INTRODUCCION
La tcnica de tipificacin de ADN se utiliza en la medicina forense, en la antropologa y la biologa de conservacin no slo para determinar la identidad de los individuos sino tambin para determinar su relacin. Este proceso ha sido utilizado para liberar a sospechosos inocentes, reunir a nios con sus familiares, identificar animales robados y demostrar que la carne de ballena ha sido sustituida por el pescado en el sushi. (1) Esta tcnica consiste bsicamente en llevar a cabo una digestin enzimtica del ADN en cuestin. De este modo se obtienen fragmentos de ADN de secuencias conocidas y por lo tanto pueden ser comparables con ADN proveniente de otras muestras. El ADN digerido enzimticamente se somete a un ensayo de electroforesis, el cual se basa en la separacin de dichos fragmentos por sus cargas elctricas y tamao molecular. De este modo es posible comparar los patrones obtenidos de cada muestra y establecer relaciones de parentesco, de identidad, o de contenido segn sea el caso. (2) En este sentido consideramos esencial el conocimiento de las tcnicas de biologa molecular de las que hoy disponemos y que muy probablemente utilizaremos por lo menos alguna vez durante nuestras vidas. Este conocimiento nos permitir entender mejor el entorno en que vivimos y las diferentes situaciones a las que nos enfrentaremos. (2) Las bacterias tiene la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre su DNA y el extrao, las enzimas de restriccin no pueden cortar DNA metilado, de este modo slo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial. As las enzimas de restriccin cortan los enlaces fosfodiester del material gentico a partir de una secuencia que reconocen.
Informe de laboratorio. Profesora Liliana Yanet Suarez Contreras
Cceres, Ferrer y Yaez OBJETIVOS Realizar la digestin con enzimas de restriccin de muestras de ADN.
Identificar el tamao de los fragmentos cortados por las enzimas de restriccin que son especficas.
Realizar la correspondiente electroforesis para comparar el ADN marcador molecular. MATERIALES Y METODOS
obtenido con el
La presente prctica se llev a cabo en los laboratorios de Gentica Molecular de la universidad Francisco de Paula Santander, sede Campos elseos, Los Patios. Para este trabajo el procedimiento se dividi en dos partes: 1.Digestin enzimtica del ADN Para este primera etapa se marcaron 7 tubos ependorf de 2ml los cuales corresponden a los 5 sospechosos, 1 corresponde a la enzima de restriccin (ENZ) y el ultimo al de la escena del crimen (CS), As mismo utilizando puntas nuevas para cada muestra, se toman 10 l de cada muestra y colocarlos a un nuevo tubo correspondiente a cada muestra para as agregar 10l de la enzima de restriccin en el fondo del tubo, cuidadosamente se homogenizo la muestra; Los tubos se llevaron a incubar a 37C/45 minutos . 1.1 Visualizacin del ADN en gel agarosa Previamente de preparar el gel agarosa se retiraron las muestras digeridas de la nevera; con una punta nueva para cada muestra se adicionaron 5 l de colorante LD en cada tubo sucesivamente se cerraron y e homogenizaron en una microcentrifuga. Por otro lado, el gel se verti en la cubeta, dejndolo solidificar retirando cautelosamente el peine, acto seguido a esto se aadieron los colorantes de carga. Se vertieron 2,75 ml de tampn TAE 1X sobre la camara de electroforesis; cubriendo por ultimo con buffer en el cuadro del gel hasta que estn inundados los pozos. Al tanto de tener la camara delectroforesis lista , se cargaron las muestras de ADN digeridos sobre el gel , siempre conservando el orden de izquierda y derecha, comenzando por el marcador de ADN Hind III. Asi mismo se sigui con energizar la camara de electroforesis y terminar con el gel de la camara en la bandeja de tincin. 2.Tincin de gel En esta fase luego de la corrida de la electroforesis se tom el gel de la cubierta y se pas a la bandeja y con cautela se vertieron 120 ml de colorante Fast blast; luego se transfiri a recipientes que contenan agua limpia (44-55 C) para que se enjuagaran del mismo. Se repiti el enjuague dos veces. Por ltimo el gel se coloc sobre una superficie clara y se analiz.
Extraccin de ADN a partir de las clulas epiteliales de la mucosa bucal
Cceres, Ferrer y Yaez RESULTADOS En el gel se usaron los marcadores:
C5
S1
S2
S3
S4
El pocillo 1 contiene los marcadores (de tamao conocido) obtenidos de la digestin de un ADN por la enzima EcoRI. Para aquel marcado como 1 se us un marcador de alelo naranja. El siguiente es el marcador lamda Cada carril contiene una muestra diferente de DISCUSIONES ADN. Cada muestra de ADN fue tratada con las mismas endonucleasas de restriccin.
No logramos observar todas las bandas, solo aquellas etiquetadas como: M, 1 (enzima EcoRI, el marcador de 1 Kb y un marcador de Alelo en el carril 9. Las bandas marcadas se logran observar muy bien pudiendo determinar su peso en pares de bases. No se logra realizar una conclusin global de la prueba debido a que no se observan bandas en la totalidad de los carriles. Los marcadores biolgicos utilizados permiten generar perfiles de ADN cuyos fragmentos de ADN fueron separados por electroforesis
DISCUSIONES Las enzimas de restriccin entonces digieren (separan qumicamente) la molcula de ADN en ese sitio (denominado sitio de restriccin) actuando como unas tijeras moleculares, que cortan el ADN en una secuencia especfica de pares de bases. Si un sitio de restriccin aparece en ms de un punto en la molcula de ADN, la enzima de restriccin har un corte en todos y cada uno de esos sitios, obtenindose mltiples fragmentos. La longitud de cada fragmento depender de la posicin de los sitios de restriccin en la molcula de ADN. Por ultimo debe destacarse el tiempo en el que el kit est en buenas condiciones, se debe respetar su fecha establecida para obtener los resultados esperados por el mismo, de lo
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Cceres, Ferrer y Yaez contrario el paso del tiempo conlleva al envejecimiento de los diferentes colorantes y reactivos que trae el mismo. CONCLUSIONES Las enzimas, las enzimas de restriccin funcionan mejor en un tampn ( buffer) y a una temperatura especfica. El tampn apropiado para las enzimas de restriccin se incluye con la muestra de ADN, de manera que cuando el ADN rehidratado y las enzimas se mezclan, se crean las condiciones ideales para el ptimo funcionamiento de las enzimas No se logr observar todas las bandas en la electroforesis, posiblemente pudo ocurrir un error en el protocolo o quizs los reactivos y muestras no son viables. Tras observar con detenimiento, es evidente que la nica diferencia entre el ADN de diferentes individuos es la secuencia lineal de pares de bases.
CUESTIONARIO El tamao de fragmento de ADN se puede expresar como el nmero de pares de bases del fragmento. Indicar: a. el fragmento ms pequeo tiene 100 pares de bases. b. tamao de fragmento ms largo:250 pb. 1. En el gel, cuantos fragmentos de ADN de diferente tamao aparecen en cada muestra y cul es su tamao relativo de cada una. R/ no se logr visualizar todas las muestras, por tanto no se tiene un nmero exacto de fragmentos. 2. Luego de que las muestras de ADN han sido insertadas en las celdas, estas son forzadas a desplazarse a travs de la matriz del gel. Cules son los fragmentos (tamao) que se esperara que se movieran hasta el extremo opuesto del gel ms rpidamente? Explique R/ Los fragmentos que migraran ms rpido hacia el otro extremo del gel son aquellos con tamaos pequeos y debido a su bajo peso, la velocidad de desplazamiento es mayor. 3. Suponiendo una pieza de ADN plasmidico se utiliz como material de partida, cuantos sitios de restriccin tendra el carril tres? Las enzimas de restriccin se sitan en la molcula de ADN y se desplazan por la hlice hasta que reconocen unas secuencias especficas de pares de bases que indican a la enzima que deje de desplazarse. Las enzimas entonces digieren (separan qumicamente) la molcula de ADN en ese punto llamado diana de restriccin. Cuando las enzimas de restriccin se usan para cortar cadenas de ADN plasmdico circular, como, se obtienen fragmentos de ADN de varios tamaos. Seguramente en el carril tres se obtendran ms de tres fragmentos. 4. Cul sera una explicacin de por qu hay ms de una banda de ADN para cada una de las muestras?
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Cceres, Ferrer y Yaez Las diversas bandas de ADN que se pueden observar es debido a que las enzimas de restriccin han cortado el ADN en ms de un sitio, ya que dichas enzimas han reconocido secuencias especficas de pares de bases. 5. Cul sera la explicacin de por qu hay ms de una banda de ADN para cada una de las muestras? Los individuos muestran diferentes patrones en sus genotipos debido a las distintas aportaciones realizadas a sus genes individuales a lo largo del tiempo, esto los hace nicos.. Las enzimas de restriccin entonces digieren (separan qumicamente) la molcula de ADN en ese sitio (sitio de restriccin) actuando como unas tijeras moleculares, que cortan el ADN en una secuencia especfica de pares de bases. Si un sitio de restriccin aparece en ms de un punto en la molcula de ADN, la enzima de restriccin har un corte en todos y cada uno de esos sitios, obtenindose mltiples fragmentos. La longitud de cada fragmento depender de la posicin de los sitios de restriccin en la molcula de ADN. 6. algunas de las muestras parece provenir de la misma fuente? Justifique
R/ Todas las personas tienen similitudes y diferencias en sus secuencias de ADN, por lo tanto algunas bandas coinciden y otras no. Las posiciones relativas de las bandas marcadas en el gel estn determinadas por el tamao de los fragmentos de ADN que las forman. El tamao de los fragmentos indica variaciones en el ADN de cada individuo. Las muestras son distintas por tanto no son de la misma fuente, de lo contrario deberan observarse completamente iguales todas las bandas ya que se buscan segmentos especficos de ADN, comunes en una poblacin, y que producirn un patrn de bandas nico para cada individuo.
BIBLIOGRAFIA [1] Caracterizacin del perfil de ADN humano como herramienta de identificacin forense [Citado en 2011-0522]. Disponible en internet: http://www.cch.unam.mx/ssaa/new/sites/default/files/1.pdf
[2] Alberts,b.et al. Molecular Biology of the cell ; new york,1999 [3] Tcnicas de anlisis del adn en gentica forense, Disponible en internet: https://www.google.com.co/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=2&cad=rja&ved=0CC4 QFjAB&url=http%3A%2F%2Fwww.ugr.es%2F~eianez%2FBiotecnologia%2Fforensetec.htm&ei =Gt6CUojhBsnMsAT-toGYAg&usg=AFQjCNEBdscV8N__9oE_clh4dJf2OwjXg&bvm=bv.56343320,d.cWc
[4] Evaluacin de la actividad y la diversidad bacteriana, Disponible en internet: http://www.bdigital.unal.edu.co/3409/1/71773008.2011.pdf
[5] Kit de huella gentica, Disponible en internet:
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