DETERMINACIN DE MUTGENOS AMBIENTALES A TRAVS DE LA PRUEBA DE AMES.

OBJETIVO ACADMICO Determinar la presencia de compuestos mutagnicos en muestras de inters o de impacto ambiental empleando la prueba de Ames PROBLEMA Que el alumno obtenga a partir de muestras de inters ambiental, la fraccin que contiene los compuestos de naturaleza orgnica y realice la prueba de Ames para determinar si las fracciones contienen compuestos con potencial mutagnico. MATERIAL BIOLGICO. Cultivo nutritivo de 16 horas a 37C de Salmonella typhimurium, cepas TA98, cuyos marcadores genticos son: requerimiento de histidina (His-), sensibilidad al cristal violeta (mutacin en rfa), presencia del plsmido R (resistencia a ampilicina), sensibilidad a la luz U.V. (mutacin en uvrB) y frecuencia de reversin espontanea.

MUESTRA AMBIENTAL POR EQUIPO Traer por equipo de 6 personas una de las dos muestras siguientes: a) Colillas de cigarro: Recolectar, en una bolsa plstica limpia, 20 colillas de cigarro a las que debern retirar el papel envolvente y conservar nicamente el algodoncillo del filtro. b) Residuos de escape automotriz: Recolectar con un algodn el holln remanente en el escape de un autobs y guardarlo en una bolsa plstica limpia; si es necesario emplear unas pinzas largas para tener acceso hasta el lugar en donde el holln se acumula.
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MATERIAL POR EQUIPO (6 personas). Extraccin 1 1 1 1 1 1 1 Anillo metlico Embudo de cola corta Embudo de separacin Matraz de bola de 100 mL Probeta de 100 mL Vaso de precipitados de 100 mL vidrio de reloj 1 1 1 1 1 4 8 Prueba de Ames Agitador vortex Mechero Bunsen Mechero Fisher Micropipeta 10-100L Micropipeta 100-1000L Pipetas graduadas 2 mL estriles Puntas desechables estriles para micropipetas (6 amarillas + 1 azul) 2 Pedazos de papel filtro 7x7cm 1 1 10 Vaso de precipitados de 100 mL Parrilla de calentamiento Tubos de ensayo de plstico

desechables de 5ml estriles Material para el conteo: 1 1 1 Plumn indeleble de punto fino Lmpara Lupa 1 10 1 1 Pinzas para tubos de ensayo Termmetro Hielo Bolsa de plstico para residuos Cajas Petri con medio mnimo E de Vogel-Bonner 2 Tubos de ensayo 16x150 mm con 15 mL de agar de superficie 1 1 Tubo Eppendorf Unidad Swinex (Millipore, 0.45 m)

REACTIVOS Extraccin Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4) Diclorometano (CH2Cl2) Dimetilsulfxido (DMSO)

Prueba de Ames Hipoclorito de sodio Solucin L-histidina 0.5mM / biotina 0.5mM Mezcla fraccin S9: Amortiguador de fosfatos 0.2 M pH 7.4 Solucin de MgCl2 6H2O 0.4 M/ KCl 1.65 M Glucosa 6-fosfato NADP+ Medio mnimo de Vogel-Bonner (en cajas Petri) Agar de superficie (15mL en tubos de ensayo 16x150mm)

EQUIPO Incubadora Refrigerador Rotaevaporador Lmparas

DESARROLLO EXPERIMENTAL PRIMERA SESIN

NOTA 1. Antes de comenzar el trabajo experimental, los encargados de higiene y seguridad deben verificar que todos los integrantes del equipo porten bata, guantes, cubrebocas y lentes de seguridad. NOTA 2. Colocar las cajas de Petri con medio mnimo de Vogel-Bonner en la incubadora a 37C al inicio de la clase. EXTRACCIN DE MUTGENOS A PARTIR DE MUESTRAS AMBIENTALES. 1. Preparar un sobre doble de papel filtro de aproximadamente de 5 x 5 cm de longitud de acuerdo a la Figura 1.

Figura 1. Elaboracin de sobre doble de papel filtro. 2. Colocar el material de estudio en el sobre y depositarlo en un vaso de precipitado de 250 mL, aadir 100 mL de CH2Cl2, tapar y agitar delicadamente 30 segundos. Macerar durante 30 minutos. (No agitar durante ese tiempo). 3. 4. Filtrar por gravedad el extracto obtenido y recolectarlo en un vaso de precipitado. Colocar el sobre doble de papel filtro sobre papel peridico en la campana de extraccin. Al finalizar la sesin los responsables de seguridad e higiene debern colocarlos en una bolsa de plstico, cerrar y etiquetar como R1. 5. Adicionar al disolvente de extraccin del inciso 3 sulfato de sodio anhidro para eliminar la presencia de agua en la muestra, posteriormente filtrarlo por gravedad a travs de algodn y concentrar in vacuo. 6. Reconstituir el residuo final con 500 L de DMSO.

PRUEBA DE AMES. NOTA 3. Antes de montar el rea de trabajo es importante asegurarse que ya no haya disolventes orgnicos en las mesas. 1. 2. 3. 4. Sanitizar el rea de trabajo limpiando con jabn e hipoclorito de sodio. Enseguida sanitizar con etanol al 70%. Adecuar el rea de trabajo a un ambiente estril de acuerdo a la Figura 2.

Figura 2. rea de trabajo ordenada y sanitizada. 5.

En la parrilla de calentamiento, fundir con mucha precaucin los 15mL de agar de superficie contenido en el tubo de ensayo para evitar proyecciones y prdidas de reactivo.

6. 7. 8.

Aadir 1.5 mL de solucin L-Histidina/Biotina. Mantener la mezcla anterior a 45C en bao mara como indica la Figura 2. Los encargados de seguridad prepararan para todo el grupo la mezcla S9 de acuerdo a las instrucciones del APNDICE I. A los equipos que les corresponda utilizar dicha mezcla se les proporcionar en tubos eppendorf 1.3mL de mezcla S9 para el bioensayo la cual deber mantenerse todo el tiempo en bao de hielo.

NOTA 4: Los pasos del 7 al 12 deben hacerse lo ms rpido posible para evitar riesgos de contaminacin. 9. Tomar uno o dos tubos de ensaye de plstico estriles, segn el tratamiento que se est realizando, quitarles la tapa por presin sin tocar los bordes y aadir a cada tubo 2mL de agar de superficie previamente tratado en el paso 4. Mantenerlos a 45C como los muestra la Figura 2. 10. Realizar slo los tratamientos expuestos en la Tabla 1 o 2 segn el equipo correspondiente, comenzando por el control negativo. CADA REACTIVO DEBE AGREGARSE EN EL ORDEN INDICADO. 11. Desechar las puntas para micropipetas en la bolsa de residuos colocada a un costado del rea de trabajo y etiquetada como R2.

Tabla 1. Prueba de Ames con la Cepa TA 98 para el equipo A Reversin espontnea Control negativo (por duplicado) CDIGO Reactivo CRE1 RE2 Sin S9 (por duplicado) S/S91 S/S92

Tratamientos

1.- Agar de superficie* 2.- Cultivo bacteriano 3.- Mutgeno ambiental

2mL -

2 mL 100 L -

2 mL 100 L -

2 mL 100 L 25L

2 mL 100 L 25L

Tabla 2. Prueba de Ames con la Cepa TA 98 para el equipo B Control negativo Tratamientos Slo mutgeno (por duplicado) CM2 Con S9 (por duplicado)

CDIGO Reactivo 1.- Agar de superficie* 2.- Cultivo bacteriano 3.- Mutgeno ambiental 4.- Mezcla S9**

M1 2 mL 25L -

C/S91 2 mL 100 L 25L 500 L

C/S92 2 mL 100 L 25L 500 L

2 mL -

2 mL 25L -

*Mantener siempre a 45C en bao mara **Mantener siempre en hielo. 12. Sacar de la incubadora dos cajas petri, etiquetar las cajas en la tapa segn el cdigo indicado en las tablas 1 y 2, para cada tratamiento agregando el numero de grupo y equipo. 13. 14. 15. Mezclar el contenido de cada tubo en el agitador vortex. Verter el contenido de cada tubo en la caja de Petri con medio mnimo de VogelBonner correspondiente. Desechar los tubos de plstico en la bolsa de residuos colocada en un costado del rea de trabajo y etiquetada como R2.

16. 17. 18.

Distribuir cuidadosa y homogneamente el agar de superficie realizando movimientos circulares. Dejar solidificar las cajas a temperatura ambiente en una superficie plana durante 10 minutos. Repetir los pasos 7 al 15 para los otros dos tratamientos.

NOTA 5: Recordar en todo momento que se est trabajando con compuestos con posible actividad mutagnica y con un cultivo bacteriano que no es incuo. 19. 20. 21. Colocar el sobrante de la muestra ambiental en DMSO en el contenedor etiquetado como R3. Fijar las tapas de las cajas petri a su contraparte con cinta adhesiva e introducirlas de manera invertida a la incubadora a 37C por 48 horas. Una vez terminado el tiempo de incubacin, guardar las cajas de Petri invertidas en el refrigerador a 4C.

DESARROLLO EXPERIMENTAL SEGUNDA SESIN 22. Antes de comenzar el conteo de las colonias, verificar que el crecimiento sea homogneo, es decir, que las colonias tengan las mismas caractersticas, de lo contrario informar al profesor para recibir instrucciones. 23. Identificar si existe algn tipo de contaminacin por hongos u otras bacterias. En caso de que las cajas presenten estas condiciones, informar al profesor para rechazarlas. 24. 25. 26. Contar el nmero de colonias revertantes que crecieron en la caja con ayuda de una lmpara y una lupa, marcndolas con un plumn indeleble de punto fino. Registrar en la Tabla 3 los resultados obtenidos. Una vez terminada la cuenta, recolectar las cajas de Petri y sujetarlas con cinta adhesiva, colocarlas en la bolsa para RPBI roja y etiquetarlas como R4 NOTA 6. Se considera un resultado positivo cuando el nmero de revertantes inducidas es igual o superior al doble del nmero de colonias revertantes espontneas.
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CUESTIONARIO 1. Anote el nmero de revertantes encontradas en la Tabla 2

2. En cul de las muestras evaluadas, el nmero de revertantes inducidas es igual o superior al doble del nmero de colonias revertantes espontneas? 3. Considera que logr identificar la presencia de mutgenos en la muestra ambiental evaluada? 4. Qu tipo de mutaciones provocan? 5. Cmo influye la biotransformacin en estos procesos? 6. Qu caractersticas de solubilidad poseen los xenobiticos presentes en la muestra evaluada? 7. Qu importancia tiene la concentracin de los mutgenos en la muestra con respecto a la confiabilidad de la prueba?

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Maron, D. & Bruce, A. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Research 113 (1980)173-215. Cortinas, C. & Ostrosky, P. (Editoras) Manual de mtodos para la identificacin de mutgenos y carcingenos qumicos ambientales, Volumen 1. Instituto de Investigaciones Biomdicas, UNAM. Mxico, 1980. Pgs. 31-50. Caldern-Segura, M. E., Gmez-Arroyo, S., Villalobos-Pietrini, R., Butterworth, F. M., Amador-Muoz, O. The effects of seasonal weather on the genotoxicity, cytokinetic properties, cytotoxicity and organochemical content of extracts of airborne particulates in Mexico City. Mutation Research 558 (2004) 717. Villalobos-Pietrini, R., Hernndez-Mena, L., Amador-Muoz, O., Munive-Coln, Z., Bravo-Cabrera, J. L., Gmez-Arroy, S., Fras-Villegas, A., Waliszewski, S., RamrezPulido, J., Ortiz-Muiz, R. Biodirected mutagenic chemical assay of PM10 extractable organic matter in Southwest Mexico City. Mutation Research 634 (2007) 192204. APENDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Concepto de contaminacin atmosfrica. Posibles compuestos mutagnicos existentes en las muestras seleccionadas. Efectos generales que sobre el orgaismo tienen los contaminantes ambientales. Caractersticas generales de solubilidad de dichos compuestos. Fundamento de la prueba de Ames. Concepto de revertante espontnea. Caractersticas generales de las cepas Salmonella typhymurium utilizadas en la Prueba de Ames y especialmente la cepa TA 98. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Utilidad del agar de superficie. Importancia del bao de temperatura a 45C. Finalidad de colocar en el medio una solucin que contenga histidina y biotina. Caractersticas de la fraccin S9 y su utilidad. Numero de colonias revertantes necesarias para considerar un resultado positivo. Precauciones que se deben considerar para obtener resultados ptimos de la prueba en el laboratorio.
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APNCIDE II: PREPARACIN DE REACTIVOS.

a) Sales de Vogel-Bonner 50X. En 600 mL de agua destilada tibia disolver las sales en el siguiente orden: MgSO47 H2O cido ctricoH2O K2HPO4 anhdro NaHPO44 H2O 10 g 100 g 500 g 175 g

Aforar a 1 litro. Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente. b) Bacto-agar En un matraz de 1 L colocar 15 g de Bacto-agar ms 500 mL de agua destilada. Esterilizar en autoclave el material anterior 121C durante 15 minutos

c)

Dilucin de las sales Vogel-Bonner 50x

En un matraz de 1 L colocar 20mL de las sales de Vogel-Bonner 50x ms 500mL de agua destilada. Esterilizar en autoclave el material anterior 121C durante 15 minutos

d)

Solucin de glucosa al 40% p/v

En un matraz de 125mL colocar 20g de glucosa ms 50mL de agua destilada. Esterilizar en autoclave el material anterior 121C durante 15 minutos

e)

Cajas Petri con Medio mnimo E de Vogel-Bonner

En un matraz de 2L limpio, seco y esterilizado en autoclave a 121 C por 15 minutos, aadir los 500mL de bacto-agar, 500ml de la dilucin de las sales Vogel-Bonner y 50mL de solucin de glucosa al 40% p/v, mezclar perfectamente y distribuir en cajas Petri de 15x100 estelizadas por rayos gamma hasta cubrir la base (aproximadamente 30 mL/caja). Esta cantidad de medio alcanza para preparar aproximadamente 33 cajas.

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f)

Solucin Histidina 0.5 mM/Biotina 0.5 mM

Pesar 0.0077 g de L-histidina, 0.0122 g de D-biotina, disolver con agua destilada y con calentamiento, aforar a 100 mL. Esterilizar por filtacin o autoclave. Almacenar a 4C en oscuridad.

g)

Agar de Superficie

Pesar 0.6 g de Bacto Agar y 0.5 g de NaCl, agregar 100 mL de agua destilada. Alicuotar 15mL de la mezcla en tubos de 16x150 mm, cubrirlos con algodn, esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente h) Amortiguador de fosfatos 0.2 M pH 7.4 Solucin A. Disolver 2.84 g de Na2HPO4 en 100 L de agua destilada. Solucin B. Disolver 2.76g de NaH2PO4H2O en 100 L de agua destilada. Para el amortiguador pH 7.4, tomar 81 mL de la Solucin A y 19 mL de la Solucin B. Almacenar a 4C. Esterilizar la solucin final en autoclave.

i)Solucin de Cloruros: MgCl2 6H2O 0.4 M/ KCl 1.65 M Disolver 8.1332 g de MgCl2 6H2O + 12.302 g de KCl en agua destilada, aforar a 100 mL. Esterilizar en autoclave y almacenar a 4C.

j)Mezcla fraccin S9 Para preparar esta mezcla se requieren dos tubos estriles de 16 x 150 mm y descongelar previamente el S9 en bao de agua con hielos (4C). Tomar las alcuotas indicadas en la Tabla 4 y mezclar siguiendo las instrucciones posteriores. Pesar la glucosa 6P y el NADP+, usando aplicadores de madera para poder pesar los reactivos, (con una navaja, una de las puntas del aplicador de madera se plana para poder tomar el reactivo y pesarlo), vaciarlos cada uno a tubos eppendorf de 1.5ml.

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Tabla 4. Alcuotas para preparar mezcla S9 Reactivos Para 1ml de Para 8 mezcla S9 (Cantidad un grupo) Amortiguador de fosfatos 0.2 M pH 7.4 0.9 mL Solucin de Cloruros: MgCl2 6H2O 0.4 0.02 mL M/ KCl 1.65 M Glucosa-6-fosfato* 0.0013 g + NADP * 0.0030 g S9 100L ml de mezcla S9 recomendada para 7.2 mL 0.16 mL 0.0104 g 0.024 g 0.8 mL

*Antes de iniciar pedir al profesor que proporcione los tubos eppendorf de 1.5 mL con la glucosa 6P y el NADP+ pesados en la cantidad correspondiente, empleando para ello aplicadores de madera desechables. En un tubo estril de 16x 150mm, aadir el amortiguador de fosfatos y la solucin de cloruros, mezclar en vortex, tomar una alcuota de 500 l (con micropipeta) y aadirla en el tubo eppendorf que contiene a la glucosa 6P para disolverla y agregarla al resto del tubo de 16 x 150 mm, mezclar nuevamente en el vortex. Tomar nuevamente otra alcuota de 0.5mL y aadirla al tubo eppendorf que contiene el NADP para disolverlo, agregar al resto del tubo de 16 x 150 mm. Mezclar el S9 y tomar la alcuota correspondiente para aadirla al tubo de 16 x 150 mm, mezclar en vortex perfectamente y filtrar utilizando una unidad Swinex (Millipore, 0.45 m), obteniendo el filtrado en otro tubo de 16x150mm ESTRIL. Alicuotar 1.3 ml de la mezcla para cada equipo en tubos eppendorf. NOTA 6: Tomar en cuenta que la mezcla siempre debe estar en hielo. APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS R1: Sobre boble con muestra ambiental y disolvente CH2Cl2. R2: puntas para micropipeta y tubos de plstico. R3: Concentrado de muestra ambiental en DMSO, este extracto puede contener hidrocarburos aromticos policclicos y otros compuestos mutagnicos. R4: Cajas de Petri con cultivo bacteriano de Salmonella typhimurium, cepas TA98.
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