Preparacin de Medios de Cultivo
Fundamento
El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. La composicin precisa depender de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varan considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales y microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer. Existen medios cuya composicin permite el crecimiento de: 1. un gran nmero de especies (agar nutritivo, caldo ordinario, agar de Sabouraud), 2. determinados microorganismos (impidiendo el desarrollo de otros), son los denominados medios selectivos. 3. Otros en cambio, se desarrollan para el estudio de determinadas pruebas fisiolgicas o test bioqumicos (utilizacin de citratos, acidificacin a partir de azcares, etc.).
Los medios de cultivo poseen una serie de componentes: 1. Indispensables: Entre los primeros se incluye el agua, nutrientes orgnicos (hidratos de carbono, aminocidos, vitaminas, etc) y nutrientes inorgnicos (P, Fe, N, Mg, S, etc) 2. Alternativos: sustancias isosmotizantes (NaCl), agente solidificante (agar-agar), tampones, indicador de pH, etc.
Durante las prcticas se van a manejar medios de cultivo de composicin muy variada y de tres tipos diferentes en cuanto a consistencia: medios slidos, semislidos y lquidos. Este ltimo aspecto es importante a la hora de la preparacin de los mismos. Aunque los medios artificiales o sintticos se pueden preparar a partir de sus componentes individuales, se pueden adquirir comercialmente como medios deshidratados a los que solamente hay que aadir la cantidad de agua necesaria. El fabricante indica la composicin, la caducidad, y la cantidad que debe pesarse por cada litro a preparar e incluso como debe esterilizarse.
Objetivos concretos de la prctica 1. Preparar medios de cultivo como soporte y fuente de nutrientes para el desarrollo de los microorganismos in vitro. 2. Manejar los instrumentos de uso rutinario, a la vez que imprescindibles, en el laboratorio de microbiologa. 3. Hacer un primer acercamiento a la manipulacin de microorganismos. Adquirir la idea de la importancia del trabajo en condiciones de esterilidad y las tcnicas ms comunes para realizarlo. Realizacin prctica
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Cada mesa de trabajo se encargar de la preparacin de una cantidad suficiente de un determinado medio de cultivo, para ser utilizado, en su momento, por todos los alumnos del grupo de prcticas. Las instrucciones a seguir dependern del nmero de mesa y el medio de cultivo asignado, pero en todos los casos, los pasos son los siguientes: 1. Disolver los componentes del medio en agua destilada. En muchos casos se parte de un preparado comercial con todos los componentes deshidratados. Siguiendo las instrucciones del fabricante o del profesor, aadir la cantidad de agua adecuada para conseguir la concentracin deseada de los mismos. Si el medio contiene un agente solidificante (agar-agar) hay que calentar el preparado hasta la ebullicin del mismo agitando de vez en cuando, para asegurar una completa disolucin del agar (medios slidos y semislidos); para medios lquidos no es necesario calentar, nicamente se agita la mezcla hasta la completa disolucin de la misma. 2. Esterilizar la disolucin.- Una vez disuelto el medio se debe esterilizar para evitar el crecimiento de contaminantes. Dependiendo de la forma en que vaya a utilizarse el medio, el procedimiento ser diferente:
a) Medios slidos en placa.- Tapar el matraz con tapn de algodn y cubrir con papel de aluminio. 0 Llevar a esterilizar al autoclave (121 C) durante 15-20 minutos. Una vez estril repartir en placas de Petri estriles y dejar en reposo para que solidifique.
b) Medios lquidos.- Una vez disueltos los componentes repartir en tubos a razn de unos 2-4 ml por tubo, tapar con tapn de aluminio y llevar a esterilizar enautoclave.
Esterilizacin, Desinfeccin y Antisepsis
En el laboratorio de microbiologa es imprescindible trabajar con material y soluciones estriles con objeto de que los resultados que se obtengan correspondan al microorganismo o microorganismos que estn presentes en la muestra en estudio y no a contaminantes que procedentes del medio o los materiales, puedan desarrollarse y falsear las pruebas. Para ello antes de comenzar el trabajo prctico se esterilizar, junto con los medios de cultivo, el material que posteriormente va a ser utilizado. Asimismo, se aprendern las tcnicas de laboratorio que nos permiten manejar esos medios e instrumental de forma que se minimice el riesgo de contaminacin.
Autoclave Mechero Bunsen Ebullicin Filtracin Radiaciones: Ultravioleta
Autoclave
En el laboratorio de Microbiologa es imprescindible trabajar con material y soluciones estriles con objeto de que los resultados que se obtengan correspondan al microorganismo o microorganismos que estn presentes en la muestra en estudio y no a contaminantes que procedentes del medio o los materiales, puedan desarrollarse y falsear las pruebas. Para ello antes de comenzar el trabajo prctico se esterilizar, junto con los medios de cultivo, el material que posteriormente va a ser utilizado. Se entiende por esterilizacin los procedimientos por los cuales se eliminan todas las formas vivas de microorganismos, sean patgenos o no, que se hallen en un material. Esta esterilizacin suele efectuarse con calor hmedo en unos aparatos denominados autoclaves. Qu es el autoclave? El autoclave es un instrumento habitual en los laboratorios de Microbiologa. Es un sistema cerrado donde se forma vapor de agua que se somete a una presin elevada, una atmsfera, lo que hace que el agua alcance una temperatura de 121C causando la desnaturalizacin de enzimas lo que conlleva a la muerte de los microorganismos y la destruccin de las esporas. Habitualmente, se esteriliza a 121C durante 20 minutos.
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El funcionamiento del autoclave El proceso completo de esterilizacin en un autoclave se compone de diferentes fases: 1. Fase de purgado: A medida que la resistencia calienta el agua del fondo del caldern, se va produciendo vapor que desplaza el aire, hacindolo salir por la vlvula de purgado que est abierta. Esta fase termina cuando se alcanza la temperatura de esterilizacin. 2. Fase de esterilizacin: Una vez cerrada la vlvula de purgado y alcanzada la temperatura de esterilizacin previamente seleccionada se inicia el proceso de esterilizacin. 3. Fase de descarga: Terminado el proceso de esterilizacin, deja de funcionar la resistencia calefactora, con lo que deja de producirse vapor y la presin y temperatura del caldern empieza a bajar poco a poco.
Algunas consideraciones para una correcta esterilizacin del material 1. Para que la esterilizacin de medios de cultivo sea eficaz, la temperatura y el tiempo seleccionados deben alcanzarse en todo el lquido. 2. Los recipientes con cierre hermtico deben ser introducidos en el autoclave sin cerrar totalmente el tapn, para facilitar la entrada del vapor durante el proceso. Al vaciar el autoclave despus de la esterilizacin procederemos a cerrar totalmente estos recipientes. 3. Los recipientes vacos precisan de un tiempo de esterilizacin mayor que los recipientes con lquido en su interior.
Ebullicin
La ebullicin no es un procedimiento de esterilizacin. Con este procedimiento fsico tan slo alcanzamos temperaturas de 100C, insuficientes para eliminar formas de resistencia como las endosporas. Peroe ste procedimiento nos puede permitir la eliminacin de formas vegetativas, sobre todo de patgenos, reduciendo significativamente la carga microbiana. Para la realizacin de esta prctica se parte de un tubo con un cultivo mixto que debe de contener al menos una especie bacteriana del gnero Bacillus.
Inoculamos 100 microlitros del cultivo mixto en una placa de agar nutritivo. Este ser nuestro control con el que comparar. El tubo debe de cogerse con las pinzas de madera, encendemos el mechero Bunsen y le aplicamos la llama. Debemos estar vigilantes para evitar que el lquido rebose debido a la ebullicin, o que el tapn salga despedido por los gases emitidos. El tubo debe de ebullir al menos tres veces. Posteriormente lo dejamos enfriar e inoculamos un volumen de 100 microlitros en otra placa de agar nutritivo. Tras incubar a 37C durante 24 horas las dos placas, observaremos que la placa con el inculo que no ha sido llevado a ebullicin muestra una gran cantidad y diversidad de colonias. Si la concentracin microbiana era muy alta incluso puede observarse un cesped bacteriano. En cambio, la placa con el inculo que ha sido llevado a ebullicin slo debe de mostrar unas cuantas colonias y todas ellas muy similares.
Filtracin
La filtracin es un procedimiento fsico de esterilizacin de fluidos en el cual los microorganismos no son destruidos, sino simplemente retenidos por un material filtrante. La filtracin slo puede ser utilizada con fluidos, sean lquidos o gaseosos. Se suele utilizar con soluciones cuyos componentes sean termolbiles y por lo tanto no pueden ser esterilizadas en el autoclave, por ejemplo, soluciones concentradas de azcares, de urea, vitaminas, factores de crecimiento, etc. La filtracin tiene la desventaja de que es ineficaz con determinados microorganismos, como los virus o los micoplasmas. Los primeros son mucho ms pequeos que el tamao del poro, por lo que no son retenidos. Los segundos son pleomrficos ya que carecen de una pared de peptidoglicano y pueden adaptarse al tamao de poro, por lo que tampoco son retenidos. El material filtrante debe de ser inerte para no reaccionar con los componentes de la solucin, presentar resistencia mecnica y tener un tamao de poro menor que los microorganismos que deben ser retenidos. Tradicionalmente se usan filtros de nitrocelulosa desechables con tamao de poro de 0,45 o de 0,22 micras. El fluido es impulsado mediante la presin ejercida por el embolo de una jeringuilla, o bien mediante el uso de un quitasato y un sistema de vaco. Material Cultivo mixto Placa con agar nutritivo Filtro desechable de 0,45 micras Jeringuilla desechable Tubos esteriles
Abrimos el recipiente del filtro pero no lo sacamos. Ajustamos la jeringuilla desechable sin el mbolo. Tomaremos 5 ml del cultivo mixto con una pipeta y los depositamos en el interior de la jeringuilla. Disponemos el filtro sobre la boca de un tubo steril y mediante el mbolo hacemos pasar el cultivo a travs del filtro. Sembramos una alcuota del filtrado sobre una placa de agar
nutritivo y lo llevamos a incubar a 37C. Observamos la ausencia de crecimiento tras 24 horas de incubacin.
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Radiaciones: Ultravioleta
Las radiaciones electromagnticas ionizantes son una forma de esterilizacin fsica muy efectiva pero su manejo se ve restringido por la necesidad de disponer de instalaciones especiales para la emisin radioactiva. Durante las prcticas se manejar material adquirido de casas comerciales esterilizado mediante radiacin , una radiacin muy penetrante y til para la esterilizacin de material termolbil como el plstico. En el laboratorio de prcticas utilizaremos la luz ultravioleta (UV) cuyo efecto biocida se debe a que provoca la formacin de dmeros de timina en el DNA. Esta radiacin tiene muy baja capacidad de penetracin por lo que su uso se ve restringido al tratamiento de superficies o a la esterilizacin del aire en "salas limpias" como los quirfanos o las instalaciones como las unidades de cultivo celular. Material necesario: Cultivo mixto Placa con agar nutritivo Papel de aluminio Lampara de luz ultravioleta germicida
Para la realizacin de esta prctica lo primero que haremos ser inocular mediante un agotamiento de asa un cultivo mixto en una placa con agar nutritivo. Posteriormente, levantamos la tapa y cubriremos la mitad con el papel de aluminio (sin que ste toque la superficie del medio). Colocar la placa abierta bajo la accin de la lmpara ultravioleta durante 5 minutos. Transcurrido este tiempo, quitar el papel de alumnio, cerrar la placa y llevar a incubar a 37C. Tras 24 horas de incubacin observaremos el desarrollo microbiano en la parte protegida de la radiacin, frente a la ausencia de crecimiento en la parte expuesta.
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Tcnicas de Aislamiento y Recuento
Fundamento En el manejo de muestras contaminadas o cultivos mixtos en los que se encuentran diversos microorganismos, el primer paso para proceder a su estudio es el aislamiento, es decir la separacin de cada uno de los posibles integrantes microbianos de la muestra. Existen diversos mtodos para conseguir esta separacin, la mayora de ellos basados en la inmovilizacin de las clulas microbianas en la superficie de los medios de cultivo slidos. Al depositar una clula bacteriana o una levadura en un punto del medio de cultivo, sta quedar inmovilizada en ese punto y en l se reproducir por absorcin de los nutrientes del medio. Las
nuevas clulas generadas permanecern igualmente inmviles y tras sucesivas generaciones conformarn lo que denominamos una "colonia" que no es ms que un montn de clulas derivadas de una sola clula madre inicial, es decir, un clon de la bacteria o levadura depositada al sembrar. Esta colonia es visible al ojo humano y presenta diferentes caractersticas segn el microorganismo que la genera. Esto nos permite distinguir las diferentes poblaciones microbianas que se encuentran en la muestra sembrada y separarlas transfiriendo una colonia de cada tipo a un nuevo medio de cultivo estril, a estos cultivos los consideraremos "puros" por poseer un slo tipo de microorganismo. (El fundamento es vlido teniendo en cuenta slo microorganismos cultivables) Objetivos Distinguir los conceptos de cultivo puro y cultivo mixto. Aplicar tcnicas de aislamiento para la localizacin de microorganismos concretos en muestras contaminadas o con flora mixta. Aplicar las tcnicas del agotamiento y las estras escocesas como las ms habituales en aislamiento de microorganismos cultivables. Observar la influencia de la temperatura sobre el desarrollo de los microorganismos. Realizacin prctica
Tcnicas de aislamiento. Se realiza un aislamiento de los microorganismos presentes en un cultivo mixto en caldo ordinario, sobre agar nutritivo. Se siembran dos placas de agar nutritivo, una mediante la tcnica del agotamiento de asa y otra mediante la de estrias escocesas. Estas tcnicas pretenden diluir la carga microbiana que se deposita sobre el medio de cultivo de forma que, en los ltimos trazos de la siembra, haya tan pocas clulas que queden suficientemente separadas unas de otras y puedan desarrollar colonias independientes.
Tcnica de aislamiento y recuento: el banco de diluciones. Se realizan una serie de diluciones seriadas a partir del cultivo mixto Con esta tcnica conseguimos adems de aislar colonias, obtener un recuento del nmero de bacterias que tenemos en el cultivo.
Esquema que representa el aislamiento de un microorganismo cultivable unicelular (dibujos de Jos M Costa).
Influencia del medio ambiente
Las condiciones fsico qumicas del medio ambiente tienen una gran influencia sobre el crecimiento de los microorganismos. La temperatura, el pH, la tensin de CO 2, el potencial de oxidoreduccin, la humedad, la presin osmtica y la aireacin, son factores externos que deben ser controlados para optimizar la velocidad de crecimiento microbiano.
Temperatura
Influencia de la temperatura en el crecimiento microbiano Contenido Factores que influyen en el desarrollo de microorganismos: la temperatura. Temperatura mxima, ptima y mnima. Hipertermfilos, termfilos, mesfilos y psicrfilos. Fundamento
El crecimiento de los microorganismos se encuentra influenciado por varios factores. Entre ellos los ms importantes son la aireacin y la temperatura. En cuanto a este ltimo, la Temperatura, los microorganismos tienen un margen de temperaturas en el cual pueden crecer. Este margen viene delimitado por la temperatura mxima de crecimiento, a partir de la cual no pueden vivir e incluso mueren; la temperatura mnima por debajo de la cual no pueden crecer aunque generalmente no
mueren; y la temperatura ptima a la cual ofrecen el mejor crecimiento.
Atendiendo a este margen de temperatura de crecimiento, los microorganismos se clasifican en: Hipertermfilos:Su temperatura ptima se encuentra por encima de los 80C. Muchos de ellos son arqueas. Termfilos: Su temperatura ptima se encuentra entre 45-70C. Suelen ser microorganismos de vida libre Mesfilos: Su temperatura ptima se encuentra entre los 25-45C. Incluye microorganismos patgenos y comensales del hombre y animales de sangre caliente y algunos de vida libre. Psictrofos: La temperatura ptima de los microorganismos de este grupo est por debajo de los 25 30C incluye microorganismos de vida libre. Psicrfilos: Su temperatura ptima de desarrollo se encuentra entre los 12 15C
Los mtodos que se emplean para obtener una temperatura constante para el cultivo in vitro de los microorganismos son: 1. La estufa de cultivo.- En ella pueden haber oscilaciones de 1 a 3C. 2. El bao termostatizado.- Permite un mantenimiento ms estable de la temperatura. En l las oscilaciones suelen ser inferiores a 1C. Objetivos Observar la influencia de la temperatura sobre el desarrollo de los microorganismos. Realizacin prctica Se siembran tres placas de agar nutritivo con el cultivo mixto mediante la tcnica de agotamiento
de asa o de las estras escocesas. Se llevan a incubar a temperatura ambiente (25C aproximadamente), 4C, 37C y 60C durante 24 horas. Tras la incubacin se observa que las placas que estuvieron a 4 y 60C no presentan crecimiento alguno, mientras que las dos placas incubadas una a temperatura ambiente y otra a 37C, ambas presentan crecimiento aunque este es mayor en la que se incub a 37C. Por lo que la conclusin es que los microorganismos presentes en el cultivo son mesfilos, ya que crecen ptimamente a 37C, mientras que la temperatura ambiente, de entre 22-25C, se encuentra dentro de su rango de crecimiento ya que han crecido pero menos.
24 horas a temperatura ambiente 24 horas a 37C
24 horas a 4C 24 horas a 60C Para comprobar el efecto de la temperatura mnima (4C) y la temperatura mxima (60C) se llevan a incubar estas dos placas ahora a 37C durante 24 horas. Tras este periodo de incubacin se observa que los microorganismos previamente sometidos a 4C crecen normalmente mientras que en la placa que haba sido incubada previamente a 60C o no crece nada, o pueden aparecer unas pocas colonias lo que indica que alguna especie presente en el cultivo mixto es productora de esporas, estructuras que son resistentes a factores ambientales adversos como las altas temperaturas.
Placa de 4C incubada 24 h a 37C Placa de 60C incubada 24 h a 37C
Observacin Microscpica
El microscopio es una herramienta de gran importancia para la observacin e identificacin de los microorganismos. Debemos distinguir entre las tcnicas para observacin de microorganismos vivos y las preparaciones para tincin. Las tinciones ofrecen una informacin adicional a la simple observacin de la morfologa, ya que ponen de manifiesto caractersticas de la pared celular o la existencia de estructuras especiales, como las esporas bacterianas. Para observar bacterias al microscopio se utiliza el objetivo de inmersin (mximo aumento). Para ello se coloca sobre la preparacin una gota de aceite de inmersin. Para enfocar con este objetivo, colocar la preparacin con el aceite en la platina del microscopio, aproximarla con el tornillo macromtrico MIRANDO DESDE FUERA, hasta que el objetivo toque el aceite.
Posteriormente, ya mirando por el ocular, hacer un enfoque grosero con ayuda del mismo tornillo. Cuando se aprecie una imagen ms o menos clara, ajustar el enfoque con el tornillo micromtrico.
Observacin en fresco Fijacin al calor Tincin de Gram Tincin de esporas Tincin de Ziehl-Neelsen
Observacin en fresco
Material Cultivo puro Portaobjetos Cubreobjetos Microscopio Aceite de inmersin
A partir de cultivos en medio lquido se procede de la siguiente forma: Cargar el asa bacteriolgica con una gota de de cultivo y depositarla en un portaobjetos limpio. Colocar un cubreobjetos procurando que no queden atrapadas burbujas de aire. Si la cantidad de cultivo que recoge el asa es muy pequea se carga 2 o 3 veces. A partir de cultivos en medio slido, en primer lugar se procede a colocar una gota de agua en el portaobjetos. A continuacin se carga el asa con una pequea cantidad de bacterias de una colonia del cultivo y se resuspende en la gota de agua. Colocar el cubrebjetos. La preparacin se observa al microscipio pudiendo determinar su morfologa (cocos o bacilos) al igual que la movilidad.
A continuacin se muestran imgenes de preparaciones bacterianas en un microscopio conectado a una televisin
Observacin en fresco de un cultivo de Staphylococcus (cocos)
Observacin en fresco de un cultivo de Pseudomonas (bacilos)
Fijacin al calor
A partir de cultivos en medio lquido se carga el asa bacteriolgica con una gota de de cultivo y se deposita en un portaobjetos limpio realizando una extensin de la muestra hasta conseguir una capa fina (frotis). Si partimos de un cultivo en medio slido, primeramente dispondremos una pequea gota de agua en el portaobjetos. A continuacin se carga el asa con una pequea cantidad de bacterias de una colonia del cultivo y se resuspende en la gota de agua, tras lo cual realizaremos el frotis. Posteriormente debemos secar la preparacin acercndola a la llama del mechero evitando que se caliente demasiado (comprobar con el dorso de la mano que no quema). Una vez seca, se procede a la fijacin, haciendo pasar la preparacin 3-4 veces por la llama del mechero (la llama debe tocar la parte inferior del portaobjetos). A partir de este momento la preparacin est lista para teir y el procedimiento a seguir depende del tipo de tincin.
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Tincin de Gram
Material
Portaobjetos con muestra fijada al calor Batera de colorantes. Cristal-Violeta y Safranina Solucin de decoloracin de Alcohol-Acetona Pinzas metlicas Cronmetro
Procedimiento 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Sumergir el portaobjetos en cristal-violeta de genciana y mantener durante 1 minuto. Lavar con agua y dejar escurrir Sumergir en lugol. Dejar actuar 1 minuto. Lavar con agua y dejar escurrir Decolorar con alcohol-acetona durante 15 segundos. Sacarlo e inmediatamente sumergirlo en safranina para contrastar. Dejar actuar 1 minuto. Lavar con agua y secar con papel de filtro.
En la observacin microscpica las bacterias Gram-positivas aparecen teidas de color violeta, y las Gram-negativas de rosa.
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Tincin de Ziehl-Neelsen
La Tincin de Ziehl-Neelsen es una tincin para micobacterias
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Tincin de esporas
Material Portaobjetos con muestra fijada al calor Batera de colorantes. Verde Malaquita y Safranina Hisopo para flamear Pinzas metlicas Cronmetro
Procedimiento 1. 2. 3. 4. 5. Cubrir el portaobjetos con verde malaquita. Calentar hasta la emisin de vapores. Mantener durante 3 minutos. Lavar con agua. Cubrir del portaobjetos con safranina para contrastar. Dejar actuar 1 minuto. Lavar con agua y secar con papel de filtro.
En la observacin microscpica las esporas aparecen teidas de verde y las clulas vegetativas de rosa.
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Identificacin Bacteriana
Contenidos: Pruebas fisiolgicas y bioqumicas de identificacin bacteriana. Fundamento Para identificar bacterias es imprescindible poner de manifiesto rasgos especiales de su metabolismo y fisiologa ya que, la simple observacin de su forma y tamao, ofrece una informacin muy limitada que apenas nos permite encuadrarlas en grandes grupos. Incluso las tinciones diferenciales son una herramienta muy til pero insuficiente para llegar al nivel necesario de informacin que nos permita dar un diagnstico, orientar la terapia y facilitar un pronstico del proceso infeccioso. Objetivos concretos Utilizar medios de cultivo y reactivos para poner de manifiesto peculiaridades en el metabolismo bacteriano. Leer resultados de pruebas metablicas interpretando adecuadamente los mismos. Identificar una bacteria mediante la realizacin de pruebas bioqumicas y observacin microscpica en fresco y con tinciones. Realizacin prctica Para la realizacin de esta prctica se trabajar con un cultivo puro en medio slido (agar nutritivo) que se suministrar a cada mesa. Se repartirn distintas bacterias identificadas por un nmero o letra. Al finalizar la prctica, cada mesa de trabajo debe tener una sospecha de identificacin para la cepa suministrada.
Acidificacin de hidratos de carbono
Fundamento Se determina la capacidad de la bacteria para utilizar hidratos de carbono produciendo cido o cido y gas. Para ello se utiliza el medio con hierro de Kliger (Kliger Iron Agar o KIA), en el que tambin se puede observar la produccin de sulfhdrico. Este medio contiene lactosa y glucosa como sustratos de carbono fermentables. Tiosulfato de sodio como sustrato necesario para la produccin de sulfhdrico, citrato de hierro y amonio como fuente de iones de Fe+3 que se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro de color negro. Adems contiene rojo de fenol como indicador de pH. Realizacin prctica Se realiza una siembra de la bacteria problema utilizando el asa bacteriolgica, comenzando por una picadura desde el centro de la superficie inclinada (slant) hacia el fondo del tubo; al retroceder se realiza una estra en la superficie del slant.
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Se incuba durante 24 horas a 37C. Transcurrido este tiempo se observa la aparicin de coloracin amarilla en la superficie y en el fondo del tubo. a) La coloracin amarilla del fondo indica que se ha fermentado la glucosa, adems esta fermentacin puede haber producido gas (metabolitos gaseosos) que se manifiestan por burbujas o roturas del agar del fondo. b) La coloracin amarilla en el slant o superficie inclinada del medio indica que se ha degradado la lactosa produciendo acidez. Segn esto podemos encontrarnos diferentes resultados que se observan en las figuras .
Glucosa - Lactosa - Gas - Glucosa- Lactosa + Gas -
Glucosa + Lactosa - Gas + Glucosa + Lactosa + Gas +
Capacidad hemoltica
Fundamento Muchos microorganismos son capaces de crecer en agar sangre y cuando lo hacen responden de diferente manera segn realicen o no la lisis de los glbulos rojos (hemlisis) producida por la accin de una enzima llamada hemolisina Podemos diferenciar tres tipos de hemlisis: Hemlisis alfa: es una hemlisis parcial y la zona de crecimiento aparece rodeada
de un halo de color verdoso.
Hemlisis beta: en este caso la hemlisis es total y el halo que rodea a las colonias es totalmente transparente.
Hemlisis gamma (no hemlisis): el microorganismo en cuestin no
es capaz de realizar la hemlisis y por tanto no existe halo alrededor de la colonia.
Realizacin prctica: Se realiza una siembra del cultivo puro mediante la tcnica del agotamiento de asa en una placa de agar sangre. Tras 24 horas de incubacin observar la presencia de halos de hemlisis alrededor de las colonias e identificar el tipo de hemlisis que realiza nuestro microorganismo.
Catalasa
Fundamento Pone de manifiesto la presencia del enzima catalasa en una bacteria. Esta enzima es capaz de descomponer el perxido de hidrgeno (agua oxigenada) en agua y oxgeno, con la consiguiente aparicin de burbujas.
Realizacin prctica Utilizar una placa con el microorganismos crecido y en una zona donde haya bastante crecimiento aadir unas gotas de agua oxigenada y observar si en el transcurso de unos segundos se
produce o no la aparicin de burbujas.
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Catalasa positivo: se produce la aparicin de burbujas que corresponde a la liberacin de oxgeno, lo que indica que la bacteria tiene el enzima catalasa. Catalasa negativo: no se producen burbujas por tanto la bacteria no posee dicho enzima.
Micrococcus luteus: catalasa positivo
Oxidasa
Fundamento Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reaccin de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidacin del citocromo que es reducido por el oxgeno molecular que produce agua o perxido de hidrgeno segn la especie bacteriana. El oxgeno acta por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa slo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algn microaerfilo, pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Se investiga la presencia del enzima citocromo-oxidasa en la bacteria en estudio. Realizacin prctica Utilizamos tiras de papel impregnadas con el reactivo para-amino-N-dimetil-anilina, que se oxida por la citocromo-oxidasa. El procedimiento consiste en impregnar la zona coloreada de la tira reactiva con una masa de bacterias. Se observa si en el transcurso de un minuto la zona impregnada vira a un color azul-violeta.
oxidasa - oxidasa +
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Antibiograma
Para conocer la sensibilidad de una bacteria a distintos antibiticos se siembra una muestra del cultivo puro en un medio en el que conocemos la capacidad de difusin de cada una de las sustancias a testar. Este es el medio de Mueller Hinton. Material Cultivo Puro de un microorganismo Placa con medio de Mueller-Hinton Pinzas metlicas Discos de antibiticos
Para la realizacin de la prueba en primer lugar hay que sembrar el medio con una gran carga bacteriana que nos permita obtener un crecimiento en tapiz o csped. La siembra se realiza mediante un hisopo estril que se empapa con el cultivo lquido o se impregna en un cultivo slido. Se descarga el hisopo realizando una estrella en el centro de la placa y extendindola posteriormente por toda la superficie procurando que no queden espacios sin cubrir. Una vez sembrada la placa se eligen los antibiticos a testar.
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Los antibiticos vienen en impregnados en discos de papel absorbente que se sacan con pinzas metlicas esterilizadas mediante su flameo tras inmersin en alcohol. Los discos se depositan en la superficie del medio de cultivo inoculado, realizando una ligera presin para que queden adheridos al mismo. Hay que procurar que queden suficientemente separados unos de otros para que la lectura de resultados sea clara y no hayan interferencias entre la accin de unas sustancias y otras.
La placa preparada con el inculo y los antibiticos se invierte y se lleva a incubar durante 24 horas a 37C. Tras este tiempo, se leen los resultados midiendo el dimetro de los halos de inhibicin del crecimiento que aparecen alrededor de los discos de papel. Se valora la efectividad de los mismos consultando la tabla correspondiente en la que, segn el antibitico, tenemos la capacidad de difusin en el medio y por tanto, la medida de halo que corresponder a una bacteria sensible, moderadamente sensible/de sensibilidad intermedia, o resistente.
