Biomarcadores y su utilidad en la evaluacin de la biodegradacin del petrleo

El empleo de biomarcadores es til en el estudio de la evolucin de la degradacin del petrleo cuando se emplean microorganismos. En funcin de la resistencia a la degradacin, existen biomarcadores que sirven para evaluar mejor la eficacia de la biorremediacin en las primeras etapas, como es el caso de los hidrocarburos alifticos, mientras que otros, como los hidrocarburos aromticos o los hopanos, permiten determinar la degradacin a ms largo plazo.
Introduccin Los biomarcadores presentan una gran utilidad en el estudio de la eficiencia de la biorremediacin. Se conoce como biomarcadores a aquellos compuestos que pueden ligarse de forma inequvoca con sus precursores biolgicos y cuyo esqueleto de carbonos base se preserva de tal forma que es reconocible a pesar de la diagnesis y de gran parte de la catagnesis. Muchos biomarcadores tienen inicialmente grupos funcionales que contienen oxgeno (dado que muchos de ellos derivan de los lpidos de los organismos) y se ven sometidos al mismo proceso de prdida de grupos funcionales que el resto de la materia orgnica. Por lo tanto, los productos diagenticos son generalmente hidrocarburos, aunque pueden sobrevi-

B i o m a r k e r s a re u s e f u l compounds for the determination of the oil degradation when microorganisms are used. There are some biomarkers such as the aliphatic hydrocarbons which are used to evaluate the bioremediation in the first stages after an oil spill, while others, aromatic hydrocarbons or hopanes, are used to determine the contamination at longer stages.

J.E. Ortiz Dr. Ingeniero de Minas M.J. Garca Ingeniero de Minas Laboratorio de Estratigrafa Biomolecular E.T.S.I. de Minas de Madrid J.L. Rodrguez Gallego Ingeniero de Minas Dpto. Explotacin de Minas-Metalogenia E.T.S.I. de Minas de Oviedo

vir a la diagnesis pequeas cantidades de compuestos con grupos funcionales, como los cidos grasos. Al mismo tiempo, los compuestos no saturados (aquellos que contienen doble enlace C=C) tienden a re-

Figura 1. Esquema de la degradacin de la clorofila-a, que puede derivar mediante procesos diagenticos a pristano (va de la izquierda) o fitano (va de la derecha).

ducirse (mediante hidrogenacin), lo que resulta en la formacin de hidrocarburos alifticos (esteranos, hopanos), o a aromatizarse. Los biomarcadores son muy importantes dado que, en general, pueden proporcionar informacin acerca de: fuentes biolgicas de materia orgnica sedimentaria, medios deposicionales, madurez de la materia orgnica, edad geolgica Estos compuestos son tan slo constituyentes traza, pero pueden ser muy tiles, especialmente en el caso de los petrleos: se emplean una gran cantidad de tipos estructurales en la geoqumica del petrleo y, lo que es ms importante en el tema que nos ocupa, tambin se ha demostrado su gran utilidad en la evaluacin de la efectividad

H C H3C

H C N

H C N

C2H5

g M H3C H Clorofila-a N H H C
2

H C

O H C 2 O C O C H C O O

Diagnesis X X N M N X X N X N X X X N X X X X N M N X X N X X

41

ARTCULO

ARTCULO

de la biorremediacin de vertidos de petrleo como se expondr a continuacin. Aplicacin de los biomarcadores a la biorremediacin El estudio de biomarcadores permite obtener informacin sobre el rendimiento de los distintos mtodos de degradacin de los residuos del petrleo, principalmente los que se refieren el empleo de microorganismos. Asimismo se puede evaluar la eficacia del uso de diferentes fertilizantes o catalizadores que intervienen en la proliferacin de las bacterias y, en consecuencia, en la degradacin de los productos del petrleo. Los biomarcadores son molculas que retienen el esqueleto bsico hidrocarbonado de los compuestos biolgicos a travs de los procesos de maduracin. La mejor opcin para el control van a ser algunos tipos de biomarcadores, en especial aquellos cuya degradacin biolgica es muy lenta o directamente no va a tener lugar. En concreto, los compuestos que se utilicen deberan ser referencias que no se originen en el crudo ni en ningn derivado en procesos de envejecimiento o biodegradacin. Adems, sea cual fuere el tipo de analtica utilizada se debe demostrar que la eficiencia en la extraccin del biomarcador es la misma que para el resto de los compuestos (Riser-Roberts, 1998). Adems, en la aplicacin de las tcnicas de biorremediacin es de vital importancia la seleccin de compuestos que dentro de la mezcla compleja del petrleo no sean biodegradables. Este hecho ser aprovechado para conseguir referencias que permitan medir si la degradacin que tiene lugar es biolgica o no y, si es as, qu microorganismos
Figura 2. Cambios en las relaciones n-C18/fitano en playas de guijarros de Alaska. Modificado de Pritchard (1997).

y de qu manera estn degradando los contaminantes y cules no. Como criterio general, partiremos de que la proporcin entre compuestos biodegradables y no biodegradables en una mezcla de contaminantes disminuye si hay biodegradacin. Entre los hidrocarburos del petrleo es fcil encontrar cantidades relativamente pequeas de biomarcadores (usualmente por debajo del 1% en peso) de origen lipdico. Al final de la diagnesis sus precursores son transformados en hidrocarburos que, despus de la catagnesis, todava permiten fijar los precursores especficos. Cualquier programa de ensayo sobre biorrecuperacin que implique la desaparicin de residuos de petrleo o de hidrocarburos, presentar dificultades analticas. Ello es debido a que existen otros procesos que implican la desaparicin de residuos de petrleo o de hidrocarburos medidos mediante cromatografa de gases, que pueden afectar o contribuir a la desaparicin de los residuos. Para hacer frente a estos problemas, se supone que la desaparicin de algunos grupos de hidrocarburos se puede utilizar como indicador definitivo de la biodegradacin. Los indicadores de la biodegradacin estaran asociados a cambios sustanciales en la composicin de varias fracciones del petrleo,

especialmente los hidrocarburos aromticos. Tambin se supone una correlacin entre los cambios en la composicin de los hidrocarburos y los cambios de peso residual del petrleo, para poder calcular tasas de desaparicin de los pesos residuales como primer indicativo cuantitativo del efecto del fertilizante y, en consecuencia, de la eficacia de la limpieza durante perodos de tiempo ms largos. Existen varios parmetros que se pueden emplear para determinar el grado de biodegradacin. En primer lugar, se puede usar la concentracin de hidrocarburos alifticos, aunque presenta algunas desventajas, ya que constituyen la fraccin ms fcil de degradar, son los menos txicos y suponen solamente un pequeo porcentaje en peso del petrleo. Tambin se pueden determinar los cambios producidos por los organismos y fertilizantes en la fraccin aromtica, que es ms resistente a la degradacin y ms txica. Por ltimo, otro mtodo eficaz para estimar la eficacia de la biorremediacin se basa en la separacin de las distintas fracciones del petrleo: aliftica, aromtica, heterocclica, polar y asfltica, y determinar la disminucin del peso de cada una (Jobson et al., 1972). No obstante, todos estos ndices se vern afectados en mayor o menor medida por los

42

otros procesos, ya citados que puedan contribuir a la desaparicin de los hidrocarburos. Es aqu cuando entra el uso de los biomarcadores, en concreto de aquellos que no son biodegradables, como forma de evaluar qu parte desaparece por biodegradacin y cul por otros procesos diferentes. A continuacin se expondrn los diversos biomarcadores que se emplean en los estudios de degradacin del petrleo. Ratio de n-alcanos normales respecto a n-alcanos ramificados Este ratio se determina calculando la relacin del peso entre un hidrocarburo de biodegradacin fcil, principalmente los n-alcanos de 17 y 18 tomos de carbono (n-C17 y n-C18), y un hidrocarburo que se biodegrada ms lentamente, generalmente hidrocarburos ramificados como el pristano (Pr) y fitano (Ph). Estos dos ltimos compuestos son isoprenoides que derivan de la degradacin de la clorofila-a (Figura 1), generalmente mediante oxidacin y reduccin, respectivamente. Se seleccionan el pristano y el fitano para realizar las comparaciones debido a que son los isoprenoides ms abundantes en el petrleo. Se emplean, por tanto, las relaciones n-C17/pristano o n-C18/fitano, aunque es preferible emplear la ltima, ya que, en ocasiones, el agua del mar presenta pristano de forma natural. La base del estudio se basa en que, por un lado, la mayor parte de los procesos (meteorizacin fsica, lixiviacin, etc) no producen prdidas acusadas de hidrocarburos ramificados y alifticos y, por otro, los alcanos ramificados se biodegradan a distinta velocidad que los alcanos lineales, que en general es ms rpida en los primeros (Prinik, et al., 1977; Mueller

et al., 1992). Por lo tanto, estudiando la evolucin en el tiempo del ratio n-C18/fitano, se puede estimar el grado de biorrecuperacin de una zona afectada por un vertido de petrleo (figura 2). Su utilizacin solamente es vlida al comienzo del tratamiento; si se analizan cuando el proceso ha avanzado mucho, pueden subestimar la biodegradacin. Concretamente, durante la remediacin del vertido del Exxon Valdez, el pristano y el fitano se degradaron rpidamente y slo pudieron utilizarse como biomarcadores adecuados en las primeras semanas (Bragg et al., 1994). Biodegradacin del Fitano En la utilizacin de los biomarcadores influyen tambin las condiciones locales de cada zona. De hecho, en ciertas costas, como en la de Prince William Sound de Alaska, se desarrollan bacterias con gran capacidad de degradar alcanos ramificados como el fitano, por lo que el estudio de la evolucin del ratio n-C18/fitano no es til como indicador de biorremediacin. Es ms, en el vertido del Exxon Valdez se observ en algunas zonas de Alaska una degradacin similar de fitano y de n-C18 (Pritchard, 1997). En estos casos, el contenido total de fitano por s solo se puede emplear como marcador biolgi-

co interno al igual que el del n-C18 (figura 3). Cambios en la composicin de hidrocarburos aromticos Para poder determinar de forma absoluta la efectividad de la biorrecuperacin, no es suficiente nicamente con el estudio de la biodegradacin de la fraccin aliftica. Se debe tambin estudiar el comportamiento y evolucin de la fraccin aromtica, ya que es la ms complicada de degradar (Kennicutt, 1988; Rowland et al., 1986) debido a que presenta una baja solubilidad. Esto es importante no slo porque permite evaluar la capacidad de recuperacin de una zona, sino porque algunos hidrocarburos policclicos aromticos (PAHs) son altamente txicos y potencialmente cancergenos bajo ciertas condiciones. Para evaluar la capacidad de degradacin, se suelen emplear compuestos de forma individual y familias de PAHs (naftalenos, fenantrenos, crisenos, etc). Asimismo, se puede determinar la eficiencia de los microorganismos en una zona sometida a biodegradacin del petrleo, mediante el estudio de la evolucin de la abundancia de la suma total de PAHs con el tiempo (Figura 4). Generalmente, el estudio se realiza comparando la proporcin de los diferentes hidrocar-

Figura 3. Cambios en la concentracin de fitano y n-C18 (expresado como cambio porcentual en relacin a la concentracin media a t=0) en las muestras de petrleo en arena y grava de las playas tratadas en Sung Harbour (Alaska). Modificado de Pritchard (1997).

43

ARTCULO

ARTCULO

Figura 4. Contenido total de PAHs en distintas reas sometidas a la accin de las mareas en Prince William Sound (Alaska) despus de haber sido sometidas a degradacin biolgica. Modificado de Boehm et al. (1995).

panos, los productos diagenticos de los biohopanoides incluyen a los hopanoles, cidos hopanoicos y hopenos. Entre todos los hopanos, el C30-17(H), 21(H)-hopano es un buen biomarcador, porque tiene baja solubilidad y muy baja volatilidad, con lo que no slo la biodegradacin, sino tambin la disolucin o la evaporacin son prcticamente descartables. Para calcular la eficiencia de la biodegradacin del petrleo a partir de los hopanos se puede utilizar la siguiente ecuacin (Douglas et al., 1994):

buros aromticos con el contenido del hopano C30-17a(H), 21b(H), ya que es sumamente resistente al ataque biolgico y, por consiguiente, proporciona un estndar constante para normalizar el contenido en hidrocarburos aromticos. Ms adelante se realiza una descripcin ms detallada de los hopanos y de su empleo en la biorremediacin. Cambio de composicin y cambio en el peso residual En principio se podra pensar que la rpida reduccin en la relacin n-C18/fitano no va acompaada de un cambio importante en el peso residual del petrleo. Sin embargo, diversos estudios han confirmado que cuando comienza la degradacin de la fraccin aliftica, se inicia tambin la descomposicin de otras fracciones del petrleo, aunque a velocidades diferentes. Existe, por lo general, una correlacin entre las variaciones del ratio n-C18/fitano y del peso residual, con el tiempo de actuacin de los organismos. Con este estudio comparativo y a partir de la ecuacin de la recta resultante, se puede determinar la vida media de permanencia del petrleo en la costa, es decir, la tasa de descomposicin del mismo y los das que tardar en desaparecer.

En el caso del vertido del Exxon Valdez, se observ un aumento de ms del doble en la velocidad de desaparicin del petrleo residual sobre los cantos al aadir un fertilizante (tabla I). Hopanos Derivan del acoplamiento de seis unidades de isopreno. Son abundantes en sedimentos y en el petrleo, si los comparamos con otros biomarcadores. Proceden de precursores con grupos funcionales (biohopanoides) presentes en las bacterias. Los hopanoides (bacteriohopanotetroles) estn presentes en las membranas de numerosos organismos procariotas, tanto aerobios como anaerobios, y su funcin parece ser la de mejorar la estabilidad de las paredes celulares. En este sentido, no slo su funcin, sino su estructura est muy relacionada con la de los esteroles (el ms conocido de estos es el colesterol) en organismos eucariotas (Madigan et al., 2000). Los grupos funcionales se pierden durante la diagnesis aunque, en general son resistentes a la degradacin. Adems de a los ho-

% petrleo degradado = (1- Ho/Hs) x 100 Donde Ho es la concentracin del hopano C30-17(H), 21(H) en el petrleo originariamente y Hs es la concentracin del hopano C30-17(H), 21(H) en la muestra despus de haber sido sometida a biodegradacin. Pese a todo, algunos autores (Sasaki et al., 1998; Pollard et al., 1999) ponen en duda su utilizacin por varios motivos: En algunos crudos pesados su presencia es muy limitada, con lo que el error analtico podra ser muy grande. Parece que existe alguna evidencia de su degradacin en arenas asflticas. Las alternativas existentes no son muchas, ya que los mismos problemas se pueden aducir si se usa algn otro compuesto del petrleo, o bien metales pesados seleccionados de entre los ms abundantes (vanadio o nquel).

Tabla I. Anlisis de las tasas de descomposicin en playas de Snug Harbor (Alaska). Modificado de Pritchard (1997).

Playa

Pendiente

Vida media del residuo 44 124

Tiempo para eliminar el 90% T (das) 146 411

Tratada No tratada

-0.016 -0.006

44

Otros biomarcadores Como alternativa a los compuestos ya sealados, se podra elaborar una lista de otros posibles biomarcadores que se podran utilizar para cuantificar la biodegradacin del petrleo: Esteranos: Son compuestos con una estructura similar a la de los hopanos (cuatro anillos frente a cinco). El ms conocido entre ellos es el colestano cuyo precursor es el colesterol de los organismos eucariotas. Esteroides: Tambin con estructura similar a los hopanos, pero con anillos bencnicos en ella. Son, por tanto, hidrocarburos aromticos. Porfirinas: Son un grupo extremadamente complejo de compuestos tetrapirrlicos. Se originan en el mismo proceso diagentico (precursor: clorofila) en el que se formaban pristano y fitano. Metales: Por diversos motivos (Sasaki et al., 1998) se ha propuesto el vanadio como marcador interno de la biodegradacin. Existen otros biomarcadores, entre los cuales se encuentran: compuestos con NSO, tales como porfirinas, carbazoles, fenoles, cidos carboxlicos y compuestos del azufre. Conclusiones En este artculo se pone de manifiesto la utilidad de los biomarcadores en el estudio de la evolucin de la degradacin del petrleo cuando se emplean microorganismos. Generalmente, en funcin de la resistencia a la degrada-

cin, existen biomarcadores que sirven para evaluar mejor la eficacia de la biorremediacin en las primeras etapas, como es el caso de los hidrocarburos alifticos, mientras que hay otros, como los hidrocarburos aromticos o los hopanos, que permiten determinar la degradacin a ms largo plazo y la recuperacin de las zonas contaminadas. Referencias Boehm, P.D.; Page, D.S.; Gilfillan, E.S.; Stubblefield, W.A. y Harner, E.J. (1995). Shoreline ecology program for Prince William sound, Alaska, following the Exxon Valdez oil spill: Parts 2-Chemistry and toxicology. En: Exxon Valdez Oil Spill; Fate and Effects in Alaskan Waters (Wells, P.G., Butler, J.N., Hughes, J.S., Eds.). American Society of Testing and Materials Special publication, pp 347-397. Bragg, J.R.; Prince, R.C.; Harner, E.J. y Atlas, R.M. (1994). Effectiveness of bioremediation fro the Exxon Valdez oil spill. Nature 368: 413-418. Douglas, G.S.; Prince, R.C.; Butler, E.L. y Steinhauer, W.G. (1994). The use of internal chemical indicators in petroleum and refined products to evaluate the extent of biodegradation. In: Hydrocarbon Bioremediation (Hinchee, R.E., Alleman, B.C., Hoeppel, R.E., Miller, R.N.). Lewis Publishers, Boca Raton, pp: 219-236. Jobson, A.M.; Cook, F.D. y Westlake, D.W.S. (1972). Microbial utilization of crude oil. Applied Microbiology 23: 1082-1089.

Figura 5. Representacin habitual del hopano C3017a(H), 21b(H) y su verdadera estructura tridimensional.

Kennicutt, M.V. (1988). The effect of biodegradation on crude oil bulk and molecular composition. Chemical Pollutans 4: 89-112. Madigan, M.T.; Martinko J.M. y Parker, J. (2000). Brock, Biologa de los Microorganismos. Prentice Hall, Madrid. Mueller, J.G.; Resnick, S.M.; Shelton, M.E. y Pritchard, P.H. (1992). Effect of inoculation on the biodegradation of weathered Prudhoe Bay crude oil. Journal of Industrial Microbiology. Pollard, S.J.T.; Whittaker, M. y Risden, G.C. (1999). The fate of heavy oil wastes in soil microcosms I: a performance assessment of biotransformation indices. The Science of the Total Environment 226: 1-22. Prinik, M.P.; Atlas, R.M. y Bartha, R. (1977). Hydrocarbon metabolism by Brevibacterium erythrogenes: normal and branched alkanes. Journal of Bacteriology 119: 868-878. Pritchard, P.H. (1997). Cuestiones reglamentarias y de eficacia en la biorrecuperacin de los derrames de petrleo: experiencias con el derrame del Exxon Valdez en Alaska. En: Biotratamiento de residuos slidos y peligrosos (Levin M.; Gealt, M.A. Eds.). McGraw Hill. Madrid. cap. 12, pp 273-311. Riser-Roberts, E. (1998). Remediation of petroleum contaminated soils. CRC Press. Lewis publishers. Rowland, S.J.; Alexander, R.; Kazi, R.I.; Jones, D.M. y Douglas, A.G. (1986). Microbial degradation of aromatic components of crude oils: a comparison of laboratory and field observatios. Organic Geochemistry 9: 153-161. Sasaki, T.; Maki, H.; Ishihara, M. y Harayama, S. (1998). Vanadium as an internal marker to evaluate microbial degradation of crude oil. Environmental Science and Technology 32, 3618-3621.

45

ARTCULO