RECOMENDACIONES GENERALES

1.-La hora de entrada tendr 5 minutos de tolerancia, despus de este tiempo, no se permitir al acceso al laboratorio 2.-Al entrar al laboratorio, el alumno deber ponerse la bata y abotonarla completamente, slo podr quitrsela al salir de ste. 3.- Las mesas debern estar siempre limpias y desocupadas, las mochilas debern ser colocadas donde se le indique. 4.- No comer ni fumar en el laboratorio, no introducirse ningn objeto a la boca. 5.- Recogerse el pelo para efectuar el trabajo de laboratorio. 6.- Limpiar y desinfectar el rea de trabajo antes y despus de usarla. 7.- No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo deber efectuarse sentado y en su equipo de trabajo. 8.-Hablar slo lo necesario con los compaeros. 9.- Das antes de iniciar la prctica lea cuidadosamente que es lo que se va a realizar, si no entiende pregunte al profesor. 10.- Si hay necesidad de llevar material biolgico para la realizacin de la prctica, es necesario conseguirlo de lo contrario la prctica se suspender para todo el equipo. 11.- El asa utilizada para el cultivo de microorganismos deber esterilizarse en la flama del mechero, antes y despus de su uso. 12.-Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra. 13.-En caso de derramar material que contenga microorganismos, cbralo con fenol o benzal y deje actuar diez minutos y de aviso al profesor. 14.- Todo el material que se va a incubar o desechar, debe colocarse en el sitio indicado por el profesor. 15.-Etiquete todo el material que va a incubar con los siguientes datos: equipo, grupo, fecha, nombre del material e iniciales del nombre del alumno. 16.- Despus de la incubacin es necesario la esterilizacin del material para eliminar microorganismos que pudieran hacernos dao a nuestra salud. 17.- Lvese las manos con agua y jabn antes de salir del laboratorio. 18.- Es obligacin de cada equipo entregar todo el material limpio.

MONTAJE DE PREPARACIONES FRESCAS Y TEMPORALES

Fecha____________________________

ANTECEDENTES Para poder observar al microscopio clulas, tejidos animales o vegetales y microorganismos es necesario hacer preparaciones sobre portaobjetos. Hacer una preparacin consiste por lo tanto en colocar y extender el tejido o la muestra sobre un portaobjetos, cubrindolo despus con un cubreobjetos. Las preparaciones pueden ser temporales, frescas y permanentes. Las primeras son aquellas que solo se van a utilizar durante la prctica, unos das; las frescas se usan solo durante la prctica y posteriormente se lavan. Y las permanentes son aquellas preparaciones que duran para siempre, por lo que deben hacerse con un material especial (blsamo de Canad) para que el cubre-objetos permanezca perfectamente adherido al porta-objetos, durante aos. OBJETIVOS: Aprender a montar preparaciones frescas y temporales. MATERIAL: Portaobjetos Cubreobjetos Aguja de diseccin Agua de charco Moho de pan, de tortilla o de cualquier fruta Tejidos meristemticos Solucin fisiolgica Barniz de uas. Blsamo de Canad PROCEDIMIENTO: Para hacer preparaciones frescas, simplemente coloca un corte muy delgado de tejido meristemticos, una gota de agua de charco o una muestra pequea de moho (extendida con la aguja de diseccin) sobre el portaobjetos. Si el material utilizado es moho o tejidos meristemticos, coloca sobre tu muestra una gota de agua o solucin fisiolgica. Cubre tu muestra con el cubreobjetos dejndolo caer suavemente para que no haga burbujas. Observa la figura: A) Clulas vegetales (Epidermis de cebolla) 1. Se corta la cebolla por la mitad y se separa una de las capas de la misma.
2

2. Marca con el bistur o con las tijeras una cuadrcula de pequeo tamao (1 cm de lado) en la parte interna o cncava de la capa. 3. Separa el fragmento de epidermis con las pinzas y colcalo en el centro del portaobjetos. 4. Coloca el portaobjeto en la placa de Petri, aade unas gotas de colorante sobre la muestra y djalo actuar durante cinco minutos. 5. Lava con cuidado el exceso de colorante y scalo con un poco de papel de filtro. 6. Aade una gota de agua a la muestra. 7. Coloca el cubre apoyndolo por un lado y dejndolo caer para que no queden burbujas. 8. Observa la preparacin al microscopio, utilizando varios objetivos, realiza un dibujo detallado de las clulas e indica el aumento del mismo. B) Clulas animales (Epitelio de la mucosa bucal) 1. Raspa suavemente el interior del carrillo con las pinzas o con un palillo (siempre por la parte roma, procurando no cortarse). Coloca la mucosa blanca que se obtiene en el portaobjetos. 2. Realiza una extensin (frotis) deslizando el borde de un porta sobre el que tiene la muestra. 3. Calienta suavemente con el mechero (que no llegue a quemar!) la parte inferior del porta que contiene la mucosa. 4. El resto del procedimiento es idntico al de la epidermis de cebolla. Esta preparacin est lista para que hagas observaciones microscpicas. Su duracin es de aproximadamente una hora ya que al evaporarse el agua con el calor de la lmpara del microscopio, las clulas o los organismos morirn. Para hacer preparaciones temporales, coloca un corte o una muestra sobre el portaobjetos y aade agua o colorante segn se te indique. Cubre tu muestra con el cubreobjetos dejndolo caer suavemente para que no haga burbujas; con un pincel de barniz de uas cubre los cuatro lados del cubreobjetos, djalo secar y tendrs una preparacin temporal. Esta preparacin est lista para que hagas observaciones microscpicas. Su duracin es de aproximadamente de un mes o mas dependiendo de la muestra. Esquematiza el procedimiento que seguiste para obtener tus preparaciones. RESULTADOS: Esquematiza aqu tus resultados.

CUESTIONARIO: 1.- El hacer estudios biolgicos con preparaciones frescas es muy importante, explica por que?______________________________________________ ___________________________________________________________________________ 2.- Investiga por qu debe ponerse una gota de agua o de solucin fisiolgica a la muestra.______________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ 3.Cul es el medio de montaje en una preparacin fresca?_____________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ CONCLUSIONES:

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO PTICO COMPUESTO

Fecha____________________________ OBJETIVO El alumno reconocer el microscopio compuesto, identificar cada una de sus partes y lo manejar correctamente observando la Presencia de microorganismos en muestras biolgicas MATERIAL. Microscopio compuesto Sarro dental Porta y cubre objetos Sol. de yodo-lugol Palillo, Hisopo INTRODUCCIN. El microscopio es el instrumento ms frecuentemente utilizado y el ms til en un laboratorio de microbiologa, proporciona la amplificacin o agrandamiento que nos permite ver organismos y estructuras invisibles a simple vista. Los microscopios permiten una amplia gama de amplificaciones, desde cien veces a cientos miles de veces. Las dos categoras de microscopios disponibles son los microscopios pticos y los microscopios electrnicos. Los microscopios pticos utilizan un sistema de lentes pticas y comprenden los microscopios de campo claro, campo oscuro, fluorescencia y contraste de fases. Los microscopios electrnicos emplean haces de electrones en lugar de ondas de luz para producir una imagen ampliada.

Manejo y uso del microscopio ptico 1. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogi correctamente en el uso anterior, ya debera estar en esas condiciones. 2. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas. 3. Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparacin es de bacterias. 4. Para realizar el enfoque:
5

a. Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos. b. Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntida la muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino. 5.- Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin. PROCEDIMIENTO TECNICAS DE MONTAJE HMEDO La gota pendiente o las preparaciones hmedas permiten examinar organismos vivos suspendidos en un fluido. Las preparaciones hmedas se hacen colocando una gota del fluido que contiene el organismo sobre una lmina de vidrio y cubrindola con una fina pieza de vidrio (cubreobjetos): para reducir la tasa de evaporacin y eliminar corrientes de aire, generalmente se rodea la gota con vaselina. Cuando se examinan las preparaciones hmedas por microscopa de campo claro, es importante ajustar la fuente de luz de forma adecuada. Es posible disminuir la intensidad de la luz mediante la utilizacin de filtros especiales. MONTAJE EN SOLUCION SALINA FISIOLGICA (NaCl 0.85%) O AGUA Utilizada para estudiar la movilidad de las bacterias A) 1.- En el centro de un portaobjetos coloca una gota de solucin salina 2.- Con un hisopo toma muestra de sarro dental de un compaero que no se haya lavado los dientes y colcala en la solucin salina mezclando cuidadosamente 3.- Examinar con objetivos de 40X y 60 X. B) 1.- Centrfuga minutos. aproximadamente 10 ml de orina a 2,500 rpm durante 5

2.- Desecha el lquido sobrenadante y procede a mezclar el sedimento urinario 3.- Coloca una gota del sedimento mezclado en el centro de un portaobjetos limpio y seco 4.- Sobre el sedimento pon un cubreobjetos y observa con el objetivo de 40X y 60X MONTAJE EN SOLUCIN YODO LUGOL Utilizada para identificar en Protozoos con sus organelos citoplasmticos 1.- En un portaobjetos limpio y seco, coloca una gota de solucin de yodo lugol. 2.- Con un palillo de madera toma una pequea cantidad de muestra y depostala en el portaobjetos mediante movimientos de rotacin y extendiendo la muestra por toda la gota 3.-Coloca un cubreobjeto sobre la preparacin y observa en el microscopio CUESTIONARIO: 1.- Que es poder de resolucin?__________________________________________ ___________________________________________________________________________ 2.- Qu finalidad te proporciona el utilizar microscopio compuesto: ____________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ 3.- Cul es la importancia que tiene el diafragma en el microscopio?________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ 4.- Qu tipo de bacterias pudiste observar en las muestras que se estudiaron ____________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ 5.- Qu importancia tiene el estudiar y observar los microorganismos en muestras biolgicas? ______________________________________________________ ____________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ 6.- Dibuje y escribe el nombre de cada una de las partes del microscopio compuesto

OBSERVACIONES Dibuja lo observado en los diferentes objetivos para cada muestra que preparaste durante el experimento. CONCLUSIONES ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________

ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO

Fecha____________________________ OBJETIVO: El alumno conocer y aplicar el procedimiento de esterilizacin por calor hmedo, as como las ventajas del procedimiento. MATERIAL Reloj Agua de la llave Autoclave u olla Extran Mechero Material de cristalera limpio, seco y empacado Asa de platino INTRODUCCIN AGENTES FSICOS ANTIMICROBIANOS. A) CALOR HMEDO.La temperatura elevada, combinada con una humedad elevada, es uno de los mtodos ms efectivos para matar microorganismos. El calor hmedo mata a los microorganismos coagulando sus protenas. Es mucho ms rpido y efectivo que el calor seco. El vapor a presin proporciona temperaturas por encima de las que se pueden obtener al hervir. Tiene la ventaja de un calentamiento rpido, as como penetracin rpida y abundante humedad.. El aparato a esterilizar que utiliza vapor de agua a presin regulada se denomina autoclave. Consta de una cmara de doble pared que se llena de vapor saturado libre de aire y se mantiene a la temperatura indicada y a la presin establecida durante un periodo de tiempo determinado. Generalmente el autoclave funciona a una presin de 15 libras/ pulgada cuadrada a 121C ( 249F). El tiempo de funcionamiento para lograr la esterilidad depende de la naturaleza del material que se va a esterilizar, del tipo de envase y del volumen del material. Una temperatura de l00C es la suficiente para matar a todas las formas bacterianas en 2 o 3 minutos, excepto a las esporas, para matar a estas se requiere una temperatura de 121C durante 15 minutos y a una presin de 15 libras. Este mtodo es adecuado para esterilizar aparatos que tienen hule, jeringas que contienen metal, para medios de cultivo que contienen un
9

de

presin.

azcar especial dextrosa. El autoclave se puede sustituir por la olla de presin. B) CALOR SECO.- En este tipo de esterilizacin existe una destruccin de los microorganismos oxidando sus constituyentes qumicos, desnaturalizando las protenas y los cidos nucleicos de las clulas as como fragmentando las membranas celulares. Para materiales que deben permanecer secos como ciertos instrumentos de vidrio de laboratorio tales como: cajas de petri, pipetas, as como aceites, polvos ( por ser impermeables al vapor), los materiales que no se pueden esterilizar por calor seco son: Material textil (algodn, sedas, lino, etc.), Gomas y Materiales sintticos Todo material que se altere a la temperatura de trabajo se dispone de hornos elctricos por los que circula aire caliente, en vista de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se acostumbra a aplicar una temperatura de 160C a 170C durante una hora o ms. Para materiales de vidrio de laboratorio es suficiente una exposicin de dos horas de duracin a 160C ( 320 F) para que quede esterilizado. Otras formas tiles de calor seco incluyen incineracin para objetos que deben ser destruidos y flameados por pasaje de agujas o pequeos instrumentos a travs de la llama de un mechero bunsen PROCEDIMIENTO b) ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO (vapor a presin) 1.- Lava el material que te proporcione tu profesor con mezclas adecuadas como Extran, mezcla Crmica con concentraciones adecuadas tomando en cuenta lo sucio del material, seca en estufa o en forma manual con papel absorbente y empcalo. Tenlo listo para su esterilizacin. 2.- Coloca el agua necesaria en la autoclave u olla de presin hasta la marca e introduce unas gradillas metlicas que servirn de base al material a esterilizar. Coloca el material a esterilizar dentro de la autoclave u olla de presin, evitando que el material toque las paredes. 3.- Cierra la autoclave u olla de presin, cuidando de dejar abierta la vlvula de salida de vapor que ayudar a expulsar el aire contenido dentro y que ste es desplazado por el vapor que se produce. si el aire no fue eliminado totalmente de la autoclave, el manmetro aumentar a 15 libras. Pero la temperatura no habr alcanzado los 121C Por esto se debe medir el tiempo cuando la temperatura llegue a l21C 4.- Cierra la vlvula cuando el vapor sea continuo. La temperatura de l05C indica que est libre de aire. Vigila el termmetro. Cuando vaya en 120C,
10

mantenla durante 15 minutos para que se efecte la esterilizacin (15 libras de presin). Transcurrido este tiempo se apaga. 5.-Deja enfriar hasta que el manmetro marque cero. Abre la vlvula de salida de vapor, para expulsar el vapor restante. Abre el autoclave y retira el material 6.- Si el material no est en estado lquido la vlvula se puede abrir rpido a la salida de vapor, pero si est en estado lquido la rpida prdida de presin las hace hervir o bien saltar los tapones. Por lo tanto se espera unos minutos a que se enfre perfectamente CUESTIONARIO. 1.- Cul material se puede esterilizar por calor seco y cul no. Porqu? ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ 2.- Qu tipo de material se puede esterilizar por calor hmedo?_____________ ___________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ 3.- A qu condiciones de temperatura y presin se destruyen todas las formas vegetativas?________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ 4.- A qu condiciones de temperatura y presin se destruyen las esporas? ____________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ 5.- Cules son las condiciones necesarias de tiempo y temperatura para esterilizar por calor seco?__________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ 6.- Cules son las condiciones necesarias de tiempo y temperatura para esterilizar por calor hmedo?_______________________________________________ ___________________________________________________________________________ 7.-Cmo acta la esterilizacin por calor seco en los microorganismos? ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ 8.- Cmo acta la esterilizacin por calor hmedo en los microorganismos? ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________
11

9.- Qu tipo de esterilizacin es ms recomendable y por qu? ____________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ OBSERVACIONES: Realiza esquemas y dibujos correspondientes a la esterilizacin por calor hmedo que realizaste en la prctica

12

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO SLIDOS

Fecha____________________________ OBJETIVO: Adiestrar al alumno en la preparacin de diferentes medios de cultivo. MATERIAL Frasco Schot 1 Bao mara Tripies Mecheros Fisher Telas de asbesto o placas de calentamiento Agitador Vaso de precipitado de 250 ml 1 Esptula Cajas de petri Tapones de algodn Autoclave u olla de presin Papel estraza Tubos de ensayo 16X150 Medios de cultivo INTRODUCCIN Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo.. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuado, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes. El Agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el
13

valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. Por su aspecto fsico. Los medios de cultivo preparados pueden ser clasificados por su aspecto en: : Lquidos, Semislidos, Slidos. Y por su uso en: I.- Medios de cultivos bsicos II:_ Medios de cultivos especiales como: mejorados, selectivos, diferenciales, de transporte. PROCEDIMIENTO: 1- Primeramente se desinfecta el rea de trabajo con fenol al 5% o alcohol y se enciende el mechero PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO SLIDOS 1.- Leer las instrucciones del fabricante para cada medio de cultivo y pesar la cantidad necesaria segn el volumen requerido. 2.- Colocar el medio en un vaso de precipitado que contenga el agua destilada en el volumen requerido, agitar y calentar a ebullicin para disolver el Agar. En el ltimo paso se debe tener cuidado ya que el recipiente se calienta en exceso y el producto tiende a hervir y proyectarse, lo cual puede producir serias quemaduras. El Agar disuelto hace transparente al medio que originalmente estaba turbio. Puede utilizarse un bao mara para aumentar la solubilidad. 3.- Si se va a envasar en cajas de petri, es necesario conservar el medio en un frasco schot y esterilizarlo a 121C durante 15 minutos. Al terminar, es conveniente mantener el mechero encendido para formar un rea de esterilidad al momento del vaciado en las cajas de petri aproximadamente de 15 ml a 20 ml de medio de cultivo por caja procurando que no se forman burbujas. Tapar la caja inmediatamente 4.- Si se desea que el Agar quede en tubos, entonces se esterilizar el Agar directamente en ellos a 121C durante 15 minutos tapados con algodn, gasa y papel estraza. Si desea que solidifiquen inclinados, colocarlos en una superficie lisa inclinndolos en un ngulo de 20 a 30 sobre una varilla de vidrio. A) VACIADO EN CAJAS DE PETRI 3.- No destapar las cajas de petri, sino hasta el momento que vayan a ser utilizadas. Es conveniente colocarse un cubre bocas la persona que va a realizar el vaciado y evitar hablar en todo momento para no contaminar el medio de cultivo. 4.- Es conveniente mantener el mechero encendido y trabajar cerca del rea estril al momento del vaciado en las cajas de petri. Levantar la tapadera de la caja petri con la mano izquierda , sin soltarla y sin retirarla demasiado de la base de la misma caja mientras que con la mano derecha
14

tomar el matraz que contiene el medio de cultivo y realizar el vaciado de aproximadamente 15 ml a 20 ml de Agar por caja procurando que no se forman burbujas, se procede a tapar la caja inmediatamente 5.- Si se forman burbujas, tomar el mechero, flamear el medio de cultivo sobre la superficie de la caja de petri y de manera rpida. Se procede a tapar la caja. 6.- Esperar a que el medio solidifique, Se rotulan los medios de cultivo, anotando la fecha y con iniciales el tipo de medio de cultivo. Si las placas no se van a utilizar el mismo da se sujetan con cinta y se colocan en el refrigerador de manera invertida para evitar que el vapor condensado caiga sobre el medio de cultivo y lo pueda contaminar. 7.- Cuando se vayan a utilizar los medios de cultivo preparados, ser necesario secar las placas invertidas en estufa a 37 C. Antes de realizar el sembrado de microorganismos.

CUESTIONARIO 1.Qu es un medio de cultivo? ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ 2.- Qu es un cultivo de microorganismo? ____________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ 3.- Qu finalidad tiene utilizar medios de cultivo slidos? ____________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ 4.- Escribe el nombre de 5 medios de cultivo que pueden ser empleados en el laboratorio de microbiologa. ____________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ 5.- De dnde es obtenido el extracto Agar- Agar para la preparacin de medios de cultivos?________________________________________________________ 6.- Por qu es necesario esterilizar la mesa entes de realizar el vaciado del medio de cultivo en las cajas de petri?______________________________________ ___________________________________________________________________________ 7.-Por qu la base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona?_______________________________________________________ ___________________________________________________________________________ 8.- Escribe la composicin qumica un medio medio de cultivo que utilizaste.__________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ OBSERVACIONES. Dibuja todos los pasos realizados en la preparacin de los medios de cultivo.
15

CONCLUSIONES: ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________

16

TCNICAS DE SEMBRADO
Fecha____________________________ OBJETIVOS Observar la gran variedad de microorganismos presentes en el medio ambiente, determinando las diferentes morfologas de colonias que se obtienen. Los efectos de un desinfectante por medio del crecimiento de colonias de bacterias en un medio de cultivo en cajas de Petri. MATERIAL cajas de Petri estriles preparadas con medio de cultivo PDA Cinta pegante Marcador permanente o lpiz de cera Un desinfectante con 70% de solucin de alcohol, 10% de una solucin blanqueadora, jabn lquido Extran o alkox. INTRODUCCIN La poblacin microbiana existente en nuestro entorno es grande y compleja. Cientos de especies microbianas habitan normalmente en distintas. Ellos flotan alrededor hasta que entran en contacto con una superficie que ofrezca comida y resguardo. Se encuentran ms frecuentemente en la oscuridad, en objetos hmedos que a menudo entran en contacto con la comida, la suciedad o la vegetacin. Un estudio adecuado de microorganismos que hay en estos hbitat requiere tcnicas que permitan conocer y ordenar la compleja poblacin mixta o cultivo mixto, separndole en sus distintas especies como cultivos puros. Un cultivo puro consta de una poblacin de clulas derivadas todas ellas de una clula parental. Los microorganismos se cultivan en el laboratorio sobre materiales nutritivos denominados medios. Se dispone de una gran cantidad de medios y la clase que se debe de utilizar depende de muchos factores, uno de los cuales es la clase de microorganismos que se va a cultivar. El material que se inocula sobre el medio se denomina inculo mediante alguna tcnica (siembra por estra en placa o siembra en masa en placa). Durante la incubacin a 37C, las clulas microbianas individuales se reproducen tan rpidamente que en un lapso de 18 a 24 horas producen masas visibles de clulas denominadas colonias. Una colonia es visible a simple vista. Cada colonia diferente es presumiblemente un cultivo puro de una sola clase de microorganismo. Si dos clulas microbianas procedentes del inculo original quedan muy cerca una de otra sobre el medio de Agar, la masa de clulas observables no ser un cultivo puro. La mayora de los microbios en nuestro cuerpo y otras superficies son inofensivas, pero algunos son patgenos o causan enfermedad. Por esta razn, queremos controlar el nmero de microbios que nos rodea. La posibilidad de infectarnos aumenta con el
17

nmero de microbios en los objetos circundantes. Pero qu podemos hacer para reducir el nmero de microbios en las superficies que nos rodean? PROCEDIMIENTO A partir de una suspensin bacteriana o cultivo mixto: - Agotamiento, con asa de platino y en placa de AN. Tomar una muestra del cultivo mixto, con ayuda del asa de siembras previamente flameada. Debe flamearse la boca del tubo antes y despus de tomar la muestra. La muestra se extiende con suavidad con el asa sobre la superficie del medio de agar nutritivo en placa Petri. Para ello la placa se destapa ligeramente en las proximidades del Mechero bunsen. Una vez finalizado se vuelve a tapara la placa y est se dispone en posicin invertida para llevar a incubar. Este es el proceso general para la siembra de placas. - Estras escocesas, con asa de platino y en placa de AN Para obtener colonias aisladas por este procedimiento, segn se ndice en el esquema, se realizan una serie de estras sobre la superficie del medio, tras lo cual se cierra la placa y se flamea el asa. Con el asa estril se realizan nuevas estras arrastrando clulas de las estras anteriores, y por tanto diluyendo la muestra. El proceso se repite varias veces, flameando el asa entre cada nuevo paso de estras. Al final se puede realizar un pequeo agotamiento. La placa se lleva a incubar, invertida, como en el caso anterior. Ello permitir obtener colonias aisladas. Incubar a 27 C Ver esquema:

18

CUESTIONARIO 1.- Qu es un cultivo puro de microorganismos? ___________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ 2.- Qu es in inculo? ___________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ 3.- Fsicamente en un medio de cultivo de microorganismos cuando se dice que no forma un cultivo puro?_____________________________________________ ___________________________________________________________________________ 4.- Qu tipo de tcnica empleaste para la siembra de microorganismos? ____________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ 5.- En cul caja crecieron ms y ms grandes las colonias? Por qu piensas eso? ______________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ 6.Cmo podemos controlar la contaminacin microbiana? ___________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ OBSERVACIONES: Dibuja todos los pasos empleados en el sembrado de las cajas de petri con Agar nutritivo.

19

CONCLUSIONES___________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ______________

20

AISLAMIENTO DE HONGOS MEDIANTE EL MTODO EXTENSIN EN PLACA

Fecha____________________________

OBJETIVO: El alumno aislar poblaciones fngicas del suelo mediante el mtodo extensin en placa utilizando una varilla angular de vidrio MATERIAL Muestra de suelo 1 varilla de vidrio doblada pipetas de 1 ml cajas con medio de cultivo estril PDA Tubos de ensayo con tapn de rosca Asa bacteriolgico Alcohol al 70% INTRODUCCIN Uno de los problemas ms frecuentes en Microbiologa es el aislamiento de un cultivo puro de una especie bacteriana dada. A pesar de que es muy difcil aislar una sola clula, existen tcnicas capaces de aproximar este ideal En Microbiologa, todas las manipulaciones deben ser llevadas a cabo de modo que se impida cualquier tipo de contaminacin en el rea de trabajo. Los procedimientos utilizados para conseguirlo se conocen con el nombre de tcnica asptica, y se citan a continuacin: -Las asas deben esterilizarse antes de utilizarlas y enfriarse sobre el agar o el material de vidrio (en zonas estriles) antes de tomar la muestra de microorganismos, con objeto de no destruirlos por calor. -Despus de utilizarlas, las asas se vuelven a esterilizar. -Las bocas de los tubos y matraces de vidrio se flamean ligeramente una vez destapadas, y despus de la inoculacin. -Durante la inoculacin, los tapones se mantienen en la mano sujetndolos por la parte que no entra en contacto con tubos y matraces. -Los tubos abiertos deben mantenerse en posicin inclinada para que el riesgo de contaminacin sea mnimo.

21

-Las tapas de las placas Petri no deben colocarse nunca sobre la mesa de trabajo. Tcnicas de siembras: La siembra de microorganismos puede realizarse en medios lquidos o en medios slidos. En el primer caso, para la inoculacin se utilizar asa estril si el medio de partida es slido, o pipeta estril (Pasteur o graduada) si es lquido. En el segundo caso, cuando se parte de otro medio slido, se utiliza el asa de platino normal para siembra en placa o tubo inclinado y el asa recta para siembra en picadura en tubos rectos o, en general, cuando se quiere introducir el microorganismo en el seno del medio de cultivo slido; cuando el medio de partida es lquido, se puede pasar al medio slido con un asa de platino calibrada, con la que se extiende la muestra directamente, o con pipeta (Pasteur o graduada), depositando la muestra que luego se extender sobre la placa con un asa de platino o con una varilla doblada. En general, en Microbiologa se trabaja con cultivos puros de microorganismos. Un cultivo puro es aqul en que todas las clulas provienen de una sola clula inicial. Una colonia de cualquier microorganismo es un cultivo puro, ya que todas sus clulas proceden de una inicial; por lo tanto, cuando se desea aislar un microorganismo de una muestra cualquiera, es preciso ver colonias del mismo, lo que implica que el aislamiento ha de realizarse en medio slido en placa. Los pasos de un proceso de aislamiento de una especie microbiana se pueden resumir en los siguientes: -Siembra en placa de la muestra de partida. -Tomar una colonia de la placa una vez incubada, resuspenderla en agua estril y sembrar una segunda placa, en la que todas las colonias que crezcan deben ser idnticas. -A partir de la segunda placa se puede resuspender una de las colonias en medio lquido, consiguindose ya un cultivo puro. -Para la conservacin de los cultivos puros de un microorganismo existen diversos mtodos, el ms simple es la resiembra en tubos inclinados que se mantienen, normalmente refrigerados, durante 3-6 meses. PROCEDIMIENTO Tcnica se aislamiento y recuento. Diluciones en serie. Tcnica que consiste en obtener una suspensin de la mezcla de microorganismos y hacer diluciones seriadas que se vierten en una placa Petri hasta conseguir colonias aisladas. Instrucciones: Se debe trabajar, como siempre, en condiciones estriles, flameando la boca de los tubos antes y despus de introducir la pipeta, en las proximidades del mechero. Mediante una pipeta estril, tomar una muestra del cultivo mixto, y depositar 1ml en el primer tubo con 9ml de suero fisiolgico ( en nuestro caso: 0,5ml en 4,5ml respectivamente) (dilucin 10-1).
22

Agitar hasta conseguir una suspensin homognea. Tomar otra pipeta estril, y transferir de esta primera dilucin 0.1ml al siguiente tubo con 10ml de suero fisiolgico (10-2), y as sucesivamente. A partir del tubo con dilucin 10-2 y 10-4, con una pipeta estril , inocular 0,1ml en placa AN extendiendo la muestra sobre la superficie con el asa de vidrio, la cual se debe esterilizar mediante su introduccin en alcohol y posterior flameado, por lo que se pasa el asa impregnada en alcohol por el mechero y se deja consumir el alcohol completamente. Tras incubar se podrn obtener colonias aisladas. El recuento de estas colonias permitir conocer el nmero de clulas existentes en el cultivo original.

1.- Hacer diluciones decimales a partir de la muestra de suelo hasta 10-5 2.- Slo vas a necesitar las ltimas dos diluciones es decir: 10-4 , 10 5 las dems se desecharn. 3.- Rotula 4 cajas de petri con el nombre del medio de cultivo PDA, en dos anota la dilucin 10-4, y en las otras anota la dilucin 10-5. 4.- Rotula dos cajas de petri con el nombre del medio de cultivo (PDA) en una anota la dilucin 10-4, y en la otra anota la dilucin 10-5 5.- Esteriliza el asa bacteriolgica en el mechero, espera que se enfre cerca del rea estril e introdcela en la dilucin 10-4 6.- Inocula con 0.5 ml de cada dilucin 10-4 en el centro de la superficie del Agar en el primer medio de cultivo, tapa la caja de petri 7.- Vuelve a introducir en la misma dilucin 10-4 y coloca 0.5 ml en el siguiente medio (PDA), repite lo mismo y coloca una gota en el tercer medio de cultivo. No olvides tapar las cajas para evitar que se contamine. 8.-Esteriliza el asa bacteriolgica y ahora introdcela en la dilucin 10 -5 repite los pasos anteriores, pero ahora para todas las cajas que estn rotuladas con la dilucin 10-5 No olvides tapar los medios de cultivo. 9.- Vierte una o dos gotas de alcohol al 70% sobre el brazo ms corto de la varilla de vidrio y con el mechero enciende el alcohol que se encuentra en la varilla . Permite que arda hasta que se queme todo el alcohol. Deja que la varilla de vidrio se enfre por un minuto 10.- Utiliza el brazo corto de la varilla para dispersar uniformemente la gota de cada dilucin sobre toda la superficie de cada placa de Agar inicia con las diluciones 10-5 11.- Invierte la caja de petri, incbala a temperatura de 28C por 48 horas. CUESTIONARIO 1.- A qu grupo de microorganismos pertenecen los actinomicetos? ___________________________________________________________________________ 3.-Qu tipo de tcnica utilizaste para sembrar hongos?
23

___________________________________________________________________________ 4.- Menciona otra tcnica para aislar cultivos puros de microorganismos? ___________________________________________________________________________ 5.- Cul fue la finalidad de quemar el alcohol sobre la varilla de vidrio? ____________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ 6.- Por qu iniciaste a distribuir con la varilla en forma uniforme las diluciones l0-5 que contenan a los microorganismos y no con las diluciones de l04? ____________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ 7.-Qu apariencia presentaron las colonias despus del tiempo de incubacin? ____________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ 8.- Esquematiza el proceso de dilucin realizaste para la muestra de tierra que

24

Figura: Diluciones seriadas OBSERVACIONES Dibuja todo el proceso llevado a cabo para el aislamiento del cultivo puro de microorganismo por extensin en placa, as como los resultados obtenidos al cabo de 24 horas.

CONCLUSIONES ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ________________

25

CUENTA DE MICROORGANISMOS VIABLES POR DILUCIN EN PLACA INTRODUCCIN Existen diferentes tcnicas para determinar el nmero de microorganismos en suelos o aguas, tanto directas como indirectas, Para la determinacin de microorganismos hetertrofos totales e hidrocarbonoclastas aerobios, se seleccion la cuenta microbiana por dilucin en placa. Es una tcnica indirecta de cuantificacin; sin embargo, provee una medicin de la viabilidad microbiana, permite determinar indirectamente el potencial de biodegradacin en un suelo contaminado, es la ms adecuada para medios con hidrocarburos como substrato, es rpida de efectuar y no requiere de mucho material (Lorch et al., 1995; Bossert y Kosson, 1997). MTODO El conteo de poblaciones microbianas por dilucin en placa es un mtodo simple y rpido para la cuenta viable de clulas microbianas en el suelo. Sin embargo, la cuenta obtenida es generalmente 10 a 100 veces menos que aquella determinada por cuenta directa por microscopia. Las razones para esta discrepancia incluyen la exclusin de la cuenta no viable directamente en el suelo y la inhabilidad para proveer apropiados nutrimentos en el medio de crecimiento, para obtener la cuenta total en placa. FUNDAMENTO El mtodo de dilucin en placa se fundamenta en que cualquier clula viable inoculada en un medio de cultivo se multiplica y produce datos de fcil identificacin, como la formacin de colonias en placas de agar. Este mtodo consiste en la preparacin de una serie de diluciones de una muestra de suelo en un diluyente apropiado, esparciendo una alcuota de una dilucin sobre la superficie de un medio de cultivo slido e incubando la placa de agar bajo condiciones ambientales apropiadas. La dilucin debe permitir generar colonias separadas, cada colonia puede proceder de una sola clula o de una agrupacin (unidad viable), la cual se contar como una bacteria. Bajo este fundamento, estas placas pueden ser usadas no slo para el conteo de poblaciones microbianas, sino tambin para el aislamiento de organismos. Un medio selectivo o no selectivo puede ser usado dependiendo de la naturaleza del microorganismo que se desea contar o aislar (Ramrez et al., 1992). Interferencias Los errores ms frecuentes en este mtodo son: a) Que durante la realizacin de las diluciones no se logre separar perfectamente los agregados bacterianos y ms de una bacteria forme una colonia. b) Cuando el diluyente se esteriliza en tubos tapados con torundas de algodn el volumen inicial generalmente se altera, por lo que se recomienda el uso de tubos con tapn de rosca o la esterilizacin separada del diluyente y tubos, a fin de pipetear en cada tubo el volumen exacto del diluyente al que se agrega el volumen exacto de la muestra.
26

c) Debe evitarse el choque osmtico cuando se hacen las diluciones; se recomienda el empleo de agua peptonada, solucin salina isotnica; el medio de cultivo utilizado para su crecimiento o diferentes soluciones amortiguadoras. d) La temperatura de la varilla para extender el inculo en la placa. Cuando la varilla queda muy caliente despus de ser esterilizada con alcohol y flameada, puede quemar el inculo. e) Durante el recuento se pueden producir dificultades ocasionadas por la carencia de uniformidad en la extensin de los microorganismos (Ramrez et al., 1992). Material y equipo Tubos de vidrio de 15 ml para cultivo con 9 ml de solucin salina 0.85% estril. Matraz Erlenmeyer con tapa con 99 ml de solucin salina 0.85% estril. Pipetas de 1 ml y de 0.2 ml, estriles. Vrtex. Balanza. Esptulas. Campana de flujo laminar o rea estril. Cajas de Petri con medio de cultivo-agar. Varilla de vidrio. Muestra de suelo o agua. Incubadora. Papel aluminio estril. Soluciones y reactivos 1) Solucin salina 0.85% estril. Adicionar 8.5 g de cloruro de sodio (NaCl) en 1 L de agua destilada. 2) Cajas de Petri con medio de cultivo adecuado para el crecimiento. 3) Etanol (CH3-CH2-OH). Procedimiento 1) En condiciones estriles (trabajar en campana de flujo laminar), adicionar 1 g del suelo a una botella de dilucin o matraz con tapa de rosca con 99 ml de solucin salina isotnica estril (dilucin 10-2). Dispersar el suelo y homogeneizar con agitacin vigorosa en vrtex. 2) Tomar 1 ml y transferirlo a un tubo con 9 ml de solucin salina estril (dilucin 10-3). De ah se hacen diluciones sucesivas hasta completar diluciones decimales hasta 10-10 o las adecuadas, asegurndose de utilizar una punta o pipeta estril diferente en cada paso. Agitar de forma constante con vrtex en cada paso. 3) Tomar 0.1 ml de la dilucin seleccionada y colocarla en el centro de la superficie del medio de cultivo seleccionado para el crecimiento. Realizar esto por triplicado y con tres diluciones prximas (ej. 10-3, 10-4 y 10-5) para asegurar la cuenta. 4) Extender la alcuota en la superficie de la placa con una varilla de vidrio previamente esterilizada (inmersa en alcohol y pasndola por la flama del
27

mechero permitiendo su enfriamiento). Asegurar una distribucin homognea por toda la superficie del medio. 5) Incubar las placas de forma invertida a 30C en ausencia de luz. 6) Despus de un periodo de incubacin (de 3 a 7 das, dependiendo del tipo de microorganismo), contar el nmero de colonias y reportar como unidades formadoras de colonias (UFC)/ g de suelo seco. Clculos 1) Contar slo aquellas cajas (diluciones) que contengan de 30 a 300 colonias. 2) Con la siguiente ecuacin calcular las UFC/g s.s. UFC/g s.s. = (NC * 1/FD * 1/ V) / (P * FH). Donde: UFC/ g s. s. = unidades formadoras de colonias / g de suelo seco. NC= nmero de colonias en una caja. FD = factor de dilucin que corresponde a la dilucin de donde se tom la muestra con la que se inocula la caja (10-2 a 10-10). V= volumen inoculado en la caja = 0.1 ml. P = peso de la muestra hmeda = 1 g. FH = factor de correccin de humedad (1-(%humedad/100)).

INFORME Escribir en la tabla siguiente el nmero de colonias encontradas en cada una de las diluciones. Bacteria aerobias Dilucin No. De Colonias UFC/ml

28

COLORACIN DE GRAM

Fecha___________________

INTRODUCCIN Las coloraciones diferenciales se emplean junto con otras tcnicas en la identificacin y diferenciacin de las bacterias. La coloracin de Gram permite separar a las bacterias en dos grandes grupos, las Gram positivas y las Gram negativas En esta tcnica se utiliza el cristal violeta como colorante primario el lugol como mordente, una mezcla de etanol-acetona o etanol como agente decolorante y safranina como colorante de contraste. Las bacterias que retienen el cristal violeta despus de la decoloracin se observan de color morado y son Gram positivas. Las bacterias Gram negativas por el contrario pierden el colorante primario por el tratamiento diferencial y toman el colorante de contraste, se observan entonces de color rojo. La capa de peptidoglicano de la pared celular bacteriana juega un papel fundamental en la coloracin, el cristal violeta y el lugol forman una laca en el interior de las bacterias. Al aplicar el agente decolorante, las bacterias Gram + sufren una deshidratacin y la red de peptidoglicano que es muy abundante, se condensa y constituye un obstculo para la salida del complejo cristal violeta-lugol. Las bacterias Gram tambin contienen peptidoglicano pero en menor cantidad por lo que constituye una barrera laxa, de modo que las bacterias queda mqs permeables que las Gram + y el complejo cristal violeta-lugol sale con ms facilidad dejando asi lugar a la safranina. A la coloracin de Gram estn asociadas otras propiedades de las bacterias como son: su sensibilidad a diferentes antibiticos, a los colorantes del grupo de trifenil metano, a la lisozima, su capacidad de producir toxinas diferentes entre si, etc. Objetivo El alumno aplicar una tcnica de coloracin para la diferenciacin de bacterias. III. Material Mechero bunsen Asa bacteriolgica Portaobjetos y cubreobjetos Aceite de inmersin Solucin de cristal violeta Solucin de lugol Solucin de alcohol-acetona Solucin de safranina Puentes de coloracin Cepas PROCEDIMIENTO
29

1) El primer paso es preparar y fijar un frotis de la siguiente manera: Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica y esperar que enfre un poco. - Tomar el asa (previamente flameada) y con sta tomar un poco de muestra. - Una vez obtenida una pequea cantidad de la muestra (con el asa), hacer que sta tenga contacto con una lmina portaobjetos, la cual servir para depositar la muestra contenida en el asa. Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lmina portaobjetos, proceder a realizar la extensin de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lmina, de tal forma que al terminar la extensin, tengamos como producto un espiral en la parte media la lmina. Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (slo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfologa celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aquel en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente pare ser colocado sobre el dorso de la mano. 2) Una vez obtenido el frotis con la muestra, se procede a teir la misma con violeta cristal o violeta de genciana, utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tincin de 1 minuto est dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 grados 3) Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lmina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, sta debe caer sobre la parte superior de la lmina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un centmetro de espesor. Tambin el enjuague se debe realizar poniendo la lmina en posicin inclinada hacia abajo. Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordente yodo o lugol durante 1 minuto ms. El mordente es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con colorantes y determine su fijacin a las bacterias 5) Pasado el minuto de haber actuado el mordente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, de 5 a 15 segundos. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van aadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que ste salga totalmente transparente. 6) Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lmina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita.
30

7) Una vez que la lmina ya sec, procedemos a teir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto. 8) Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lmina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observacin microscpica.

Informe Despus de aplicar la tcnica de Gram a las cepas proporcionadas y de acuerdo a sus observaciones indique la morfologa microscpica y la reaccin de Gram de cada microorganismo. Realizar esquemas a colores de las preparaciones observadas con los diferentes pasos. Cuestionario 1. Qu importancia tiene la tcnica de coloracin de Gram en la identificacin de las bacterias? 2. Cul es el paso crtico en la tcnica de Gram? Diga porque. 3. Diga el nombre de tres bacterias (genero y especie) Gram positivas. 4. Diga el nombre de tres bacterias (genero y especie) Gram negativas. 5. Por qu en general, las eubacterias son el nico grupo microbiano que responden a la coloracin de Gram?

31

COPROPARASITOSCOPICO CONCENTRACIN POR SEDIMENTACIN

INTRODUCCIN. La sedimentacin de parsitos intestinales en heces se logra por centrifugacin ligera o por gravedad del material fecal, conduciendo a la recuperacin de todos los protozoarios, huevos y larvas, especialmente huevos de trematodos. Concentra bien estas formas y elimina bastantes detritus orgnicos. Aunque se inactivan las formas mviles de los protozoarios, se mantiene la integridad de los organismos. Es efectivo an en heces con cantidades excesivas de grasas y pueden observarse la mayora de los quistes de protozoarios, as como huevecillos y larvas de helmintos, incluyendo los huevos con oprculo y tiene una eficacia moderada para los huevos de Esquistosoma . La tcnica es til para examinar heces que contienen substancias grasas que interfieren en los mtodos de flotacin. APLICACIN La tcnica de flotacin es recomendada generalmente para Oocystis de coccidios, quistes de protozoarios, huevos de nematodos y algunos huevos de gusanos y planos acintados. La tcnica de sedimentacin consiste en concentrar quistes de protozoarios, trematodos, acantocfalos y algunos huevos de gusanos aplanados. OBJETIVO Desarrollo y comprensin de la tcnica para identificar parsitos intestinales en heces. EQUIPO Y MATERIAL 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Centrfuga Microscopio Balanza Tubos de centrfuga 2 Pipeta de 10 ml 1 Pipeta de 5 ml Portaobjetos y cubreobjetos Colador de plstico o gasas Pipeta pasteur Aplicador de madera Guantes de plstico Gasa cortada en cuadros de 15 cm por lado Embudos de polietileno Vasos de precipitado de 50 ml

32

REACTIVOS: 1. Solucin salina(cloruro de sodio 7 g agua destilada 1000 ml) 2. Formalina (10 ml de formol al 40%, 90 ml agua destilada, neutralizar agregando tetraborato de sodio hasta llevar a un pH de 7.0 o 7.3) 3. ter etlico (grado analtico) MTODO DE CONCENTRACIN Y LAVADO- CUALITATIVO El examen para la identificacin de parsitos y protozoos se realiza por el mtodo de concentracin por centrifugacin y lavado, el que consta de dos procedimientos, el de flotacin (sulfato de zinc) y el de sedimentacin (formolter). TCNICA DE SEDIMENTACIN Mtodo del Formol-ter (Mtodo de Ritchie): 1. Coloque en un vasito 1 g de heces (aprox. el tamao de un cacahuate) mediante la ayuda con un abatelenguas y adicione 10-12 ml de solucin salina fisiolgica. Mezcle con un aplicador de madera y homogenice. 2. Filtre la suspensin a travs de un colador o malla y reciba el filtrado en un tubo de centrfuga de vidrio de 14 ml 3. Centrifugue 1 min a 2000 r.p.m. Elimine el sobrenadante y resuspenda en solucin salina. 4. Repita el paso anterior, dos o tres veces para lavar, resuspendiendo el sedimento en solucin salina y homogenizando con un aplicador, para obtener un sedimento ms limpio. 5. Agregue al sedimento 10 ml de formol al 10% en solucin salina, mezcle y deje en reposo durante 5 min. 6. Aada 3 ml de ter y agite vigorosamente 30 segundos. 7. Centrifugue 1 min a 1500 r.p.m. 8. Despus de centrifugar, se observan 4 capas en orden descendente. 1) ter y lpidos en la superficie 2) un tapn de restos fecales 3) formaldehido 4) sedimento en el fondo del tubo conteniendo los parsitos. 9. Se decanta la muestra y se conserva el sedimento. Se le adiciona unas gotitas de lugol y se homogeniza. Se toma una gotita con una pipeta Pasteur y se monta entre portaobjeto y cubreobjetos. Se observa a 10 y a 40 X. 10. Fuentes comunes de error: una suspensin fecal demasiado cargada, suspensin fecal pobre, centrifuga mal equilibrada, tiempo y velocidad de centrifugacin inadecuados Haga dibujos detallados de los parsitos encontrados e identifquelos mediante la comparacin de su morfologa con los manuales y libros.
33

FLOTACIN DIRECTA CON CENTRFUGA (F.D.C.): Solucin concentrada de sacarosa (Sheather) 1. Coloque en un vasito 1 g de heces (aprox. el tamao de un cacahuate) mediante la ayuda con un abatelenguas y adicione 10-12 ml de solucin Sheather sugar. Mezcle con un aplicador de madera y homogenice. 2. Filtre la suspensin a travs de un colador o malla y reciba el filtrado en un tubo de centrfuga de vidrio de 14 ml 3. Se centrifuga a 500 r.p.m. durante 5 min. 4. Se toma un poco de la superficie y se coloca en portaobjetos y cubreobjetos. Se observa con 10 y a 40 X. RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES. En caso de encontrar algn parasito durante la realizacin de esta prueba se Deber anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito as como su estado evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos) Haga dibujos detallados de los parsitos encontrados e identifquelos mediante la comparacin de su morfologa con los manuales y libros.

34

TCNICA DE ZIEHL NEELSEN MODIFICADA PARA OBSERVAR COCCIDIAS: FUNDAMENTO: Se basa en el comportamiento acido-resistente de la cubierta de estos parsitos, los cuales se tien de rojo y destacan sobre un fondo verde o azul , dependiendo del colorante de contraste usado. MATERIAL Y EQUIPO: Portaobjetos Cubreobjetos Puente para tincin Fucsina fenicada Verde de malaquita o azul de metileno acuoso Metanol Hidrxido de sodio al 4% Alcohol acido MTODO: a) Realizar un frote de heces en el portaobjetos y dejar secar. b) Colocar las lminas sobre el puente de tincin c) Fijar la lamina con alcohol metlico de 2 a 3 minutos y dejar secar d) Agregar hidrxido de sodio, sobre el preparado por un minuto y eliminar el exceso con agua de la llave. e) Cubrir la lamina con fucsina fenicada (previa agitacin del frasco que contiene dicho reactivo). Por 5 minutos. Es importante recordar que la fucsina debe ser diluida previamente con agua al tercio (1 ml de colorante mas 2 ml de agua). f) Lavar suavemente la lamina con agua corriente g) Cubrir el portaobjetos con alcohol acido por unos segundos hasta quitar el colorante. h) Lavar suavemente la lamina con agua corriente i) Colocar el colorante de contraste a la lamina que puede ser verde de malaquita al 1% o azul de metileno al 1.4%, durante 5 minutos( diluidas previamente al tercio) j) Lavar suavemente la lamina con agua corriente y secar a temperatura ambiente. k) Realizar el montaje con cytoseal, blsamo de Canad o Permount, cubrir con un portaobjetos. l) Observar al microscopio. NOTA: Los ooquistes de Cryptosporidium, Isospora y Cyclospora, aparecen de un color rojo fucsina, sobre un fondo verdoso (verde de malaquita). En algunos no se colorean bien, pero la refringencia caracterstica permite diferenciarlos. INTERPRETACIN DE RESULTADOS:

35

En caso de encontrar algn parasito acido alcohol resistente en la tincin se deber anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito as como su estadio evolutivo. Mtodo del embudo de Baerman El mtodo del embudo de Baerman se utiliza para extraer nematodos del suelo o de material vegetal macerado. Se basa en la movilidad que presentan los nematodos, que tienden a emigrar hacia el fondo del embudo, cuando la muestra de suelo o vegetal est saturada de humedad. Algunos gneros se obtienen rpidamente y en grandes cantidades con este mtodo pero otros, de movimientos torpes son difciles de obtener. Para los nematodos que presentan una estructura hinchada algunas hembras) o cutcula segmentada el papel filtro utilizado en este mtodo les forma una barrera difcil de atravesar. MATERIAL NECESARIO Soporte universal Anillo Embudo de vidrio Manguera de goma de 10 cm Pinza mohr Pizeta Malla de plstico PROCEDIMIENTO 1. El dispositivo consiste en un soporte metlico con un anillo donde se suspende el embudo de cristal de cuello largo unido al tubo del embudo va un trozo de manguera que se cierra en su extremo libre mediante una pinza mohr. 2. El embudo se llena de agua con una pizeta, dejando vacios unos 2 cm bajo el borde, sobre el embudo se coloca una malla de plstico. 3. Para poseer datos cuantitativos, se pesan aproximadamente 100 gramos de suelo y se depositan sobre el papel y cuidadosamente se coloca sobre la malla de plstico. 4. Asegrese que el nivel del agua rebase ligeramente la muestra de suelo drenando agua o agregando por la parte de arriba depositndola por un lado. 5. Doble los bordes del papel sobre la muestra, de manera que ningn borde el papel salga de los lmites del embudo. 6. Solamente cuando los nematodos sean numerosos se podrn extraer. Por lo general conviene dejarlos de 24 horas hasta cinco das. Se sugiere un trmino medio de 48 horas. Los nematodos por movimiento propio atravesarn el papel filtro y sedimentarn en la parte inferior del embudo. Las partculas de suelo
36

quedarn retenidas en el papel filtro. Debe evitarse que los borde del papel sobrepasen el dimetro del embudo. 7. Terminado el periodo de espera, habr las pinzas mohr, recoja en un frasquito unos 10 ml del agua del fondo que contiene los nematodos. 8. observe bajo el microscopio estereoscpico los nematodos colectados. RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES Haga dibujos detallados de los nematodos encontrados e identifquelos mediante la comparacin de su morfologa con los manuales y libros.

37

Fecha _____________________

FERMENTACIN

ANTECEDENTES El complemento de la fotosntesis es la respiracin, pues los productos de uno son empleados en el otro y viceversa, formando un ciclo de vital importancia, pues gracias a ellas se produce ATP, que es la molcula energtica de los organismos. Todos los seres vivos respiran, sean bacterias, protozoarios, hongos, vegetales o animales. Sin embargo, no todos lo hacen de la misma manera; hay organismos que no requieren el oxgeno para poder respirar, incluso en su presencia pueden morir. ste tipo de organismos reciben el nombre de anaerobios. La fermentacin, es tambin conocida como respiracin anaerobia, es la respiracin que se realiza en ausencia de oxgeno y consiste en el rompimiento de compuestos orgnicos granes (azucares) formndose compuestos pequeos que contienen menos energa qumica que las molculas con que se inicia el proceso. En sta va metablica la glucosa se rompe en dos molculas de cido pirvico; cada molcula de este cido tiene tres tomos de carbono y adems se producen dos molculas de CO2 y dos molculas de ATP. Las variantes de la fermentacin se refieren al destino del cido pirvico. Por ejemplo, en las clulas animales (cuando la ausencia de oxgeno impide la respiracin aerobia), este cido se convierte en cido lctico. En clulas vegetales, levaduras y algunas bacterias que tienen condiciones pobres de oxgeno, el cido pirvico se convierte en CO2 y etanol. OBJETIVOS: Conocer el proceso de fermentacin, a travs de la degradacin de la glucosa hasta la obtencin de CO2 MATERIAL: 5 tubos de ensayo grandes 5 tubos de ensayo pequeos 1 gradilla 1 balanza 1 probeta de5 ml Levadura de pan Suspensin de levaduras en sacarosa al 5% Jugo de naranja, manzana o uva PROCEDIMIENTO: 1. Con uno de los tubos de ensayo grandes mide primero con agua el volumen necesario para que el jugo cubra partes del tubo. 2. Coloca en los cinco tubos de ensayo grandes la misma cantidad de jugo de fruta. Cada equipo puede realizar la experiencia con diferente jugo. 3. Etiqueta y numera cada uno de los tubos.
38

4. Pesa las siguientes cantidades de levadura: 1.0g, 1.5g, 2.0g, 2.5g y 3.0g. 5. Agrega las diferentes cantidades de levadura a cada tubo de ensayo. 6. Introduce los tubos pequeos, boca abajo, en los tubos grandes. Debes llenar el tubo pequeo con la mezcla del jugo y levadura, procurando que no quede ninguna burbuja de aire. Para llenar los tubos pequeos con la mezcla del tubo grande introdcelo en este ltimo inclinndolo, despus mueve lentamente el tubo hacia abajo. Cuando ambos tubos estn en posicin horizontal enderzalos, de sta manera el tubo pequeo se llenar con el contenido del tubo grande. 7. espera de 20 a 40 minutos el experimento; al trmino de este tiempo mide con una regla milimtrica la longitud de la burbuja de cada tubo. RESULTADOS: Haz aqu tus esquemas y anota tus observaciones. Con tus resultados elabora la siguiente grfica: Cantidad Nmero de tubo de levadura Longitud de la burbuja en mm

g. de levadura CUESTIONARIO. 1. Qu puedes concluir acerca de la relacin entre la cantidad de sustrato y la produccin de CO2?______________________________________________________ ____________________________________________________________________________ __ 2. Qu usos industriales tienen el proceso de fermentacin?_______________ 3. Qu tipo de organismos son las levaduras?

Conclusiones:

39

CONTROL BIOLGICO PRUEBAS DE ANTAGONISMO

Fecha ____________ INTRODUCCIN El uso de agroqumicos ha permitido obtener incrementos en la produccin no obstante sus efectos adversos estn impactando de manera significativa la sostenibilidad de la agricultura. La prctica del monocultivo y la contaminacin por el uso indiscriminado de agroqumicos han reducido la biodiversidad de los agroecosistemas, causando la inestabilidad de los mismos, la cual se manifiesta en otros efectos nocivos, en una mayor incidencia de plagas y enfermedades en los cultivos, esto y los problemas de seguridad pblica inherentes a la fabricacin y uso de agroqumicos han conducido a la bsqueda y establecimiento de alternativas de manejo y enfermedades. As surge el inters por el control biolgico que puede definirse como cualquier forma de control que reduce la incidencia o severidad de la enfermedad o incrementa la produccin del cultivo aun cuando no haya aparentemente un efecto significativo en la reduccin de la enfermedad o inculo y su impacto nocivo en el ambiente sea mnimo o nulo. Los agentes de control biolgico de plagas del suelo son bacterias, hongos y otros organismos no patgenos que compiten por el espacio y los nutrientes de patgenos o son antagnicos de alguna manera contra stos en el rea de la rizsfera y, en algunos casos, pueden actuar como protectores contra posibles infecciones de la raz. Varios ejemplos de patgenos como Sclerotium rolfsii Socc, Rhizoctonia solani y Pythium spp. han sido controlados biolgicamente utilizando antagonistas como Trichoderma spp, Penicillium spp, Aspergillus spp y algunas bacterias. OBJETIVO: El alumno conocer la capacidad antagnica de los organismos para controlar el crecimiento de otro. Para la evaluacin comparativa de la actividad antagnica en cultivos duales se utilizaran como Fitopatgenos Sclerotium sepivorum, Fusarium spp y Botritis cinrea y como potenciales biocontroladores sern evaluados Trichoderma spp., y Bacillus subtilis.
MATERIAL Y EQUIPO NECESARIO: 1. 2. 3. 4. 5. Cajas con medio de cultivo PDA Campana de flujo laminar Navaja con bistur Cepas fitopatgenos Cepas antagnicas

40

PROCEDIMIENTO 1. De la periferia de las colonias se cortan discos con sacabocados de 0.5 cm de dimetro que sern transferidos a caja petri con PDA en posiciones opuestas de tal modo que queden enfrentadas uno del fitopatgeno y otro del antagonista a probar en cada tratamiento. 2. Para la siembra de Bacillus subtilis se realiza por estra a lo largo del medio de cultivo en un extremo y en el otro extremo un disco de 0.5 cm tomado del borde del crecimiento del fitopatgenos. 3. Cada prueba debe realizarse con tres repeticiones como mnimo. 4. Se realizar la siembra de un testigo que consistir en el crecimiento de los distintos aislamientos de fitopatgenos sin la presencia de antagonistas. 5. Las cajas sern mantenidas en incubacin a una temperatura de 25 27C. 6. Se medir el dimetro de las colonias a las 24, 48 y 72 horas efectundose un anlisis de varianza y prueba de Tukey de los valores obtenidos. RESULTADOS: Observe las placas bajo lupa y/o microscopio. Describa las alteraciones que se observan. RESULTADOS: Mediante una grafica reporte los resultados

41

BIBLIOGRAFA:

Cndom, Mara A. - Mazza, Silvia - Gutirrez, Susana A. - Mazzanti de Castan, Mara A. Evaluacin de Tricoderma spp. contra Rhizoctonia solani in vitro e ivernculo Ctedra de Fitopatologa - Facultad de Ciencias Agrarias .E:mail: [email protected]. E. Savaleta Meja. 1999. Alternativas de manejo de las enfermedades de las plantas. Terra latinoamericana. Julio-septiembre ao/vol. 17, nm. 003. Gavio de la Torre Gonzalo.1993. Tcnicas Biolgicas Selectas de Laboratorio y de Campo. Editorial Limusa S. A. de C. V. Primera edicin pag.147155.

42