ESTUDIO ULTRAESTRUCTURAL Y CITOQUMICO DEL DESARROLLO Y MADURACIN DE LA MICROSPORA DE TOMATE (Lycopersicum esculentum M.

M Begoa Carretero Gmez

NDICE

NDICE Resumen Captulo 1: 1.11.21.31.41.51.61.71.8..................................... Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Antecedentes histricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Importancia del estudio del polen . . . . . . . . . . . . . . . Reproduccin sexual . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . El microsporangio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Microsporognesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Formacin del grano de polen . . . . . . . . . . . . . . . . . Formacin de la pared del grano de polen . . . . . . . . . El tomate como material de estudio . . . . . . . . . . . . . . 1.8.1- Orgenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.8.2- Usos y propiedades . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.8.3- Por que el tomate como material de estudio? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 5 9 13 15 17 19 22 27 28 29 30

Captulo 2: Justificacin y Objetivos 2.1- Justificacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 2.2- Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 Captulo 3: Material y Mtodos 3.1- Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2- Mtodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.1- Cultivo in vitro de anteras de tomate . . . . 3.2.2- Procesamiento de muestras para microscopia electrnica de transmisin . . . . . . . . 3.2.3- Tallado de la pieza, corte y recogida de secciones. Tincin. . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.4- Estudio de cortes al microscopio ptico y microscopio electrnico . . . . . . . . . . . . 3.2.5- Determinacin de polisacridos . . . . . . . .

. . . . . 37 . . . . . 41 . . . . . 41 . . . . . 47 . . . . . 52 . . . . . 53 . . . . . 54

NDICE 3.2.5.1- Test cido peridico-tiosemicarbacida proteinato de plata (Thiery) . . . 3.2.5.2- Tcnica del cido fosfotngstico . . . Tincin regresiva del EDTA (Etilen-Diamino-Tetractico) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Localizacin de la actividad enzimtica de peroxidasa y catalasa . . . . . . . . . . . . . . 3.2.7.1- Tincin citoqumica con 3,3-Diamino minobenzidina (DAB) . . . . . . 3.2.7.2.- Tcnica del cerio . . . . . . . . . . . . . 3.2.7.3- Inmunolocalizacin de peroxidasas . Estudio de elementos inorgnicos en la pared del polen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.8.1- Tcnica del piroantimoniato potsico 3.2.8.2- Preparacin de muestras para microanlisis de rayos X al MEB . . . . Paso de material a travs de las paredes celulares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.9.1- Tcnica del nitrato de lantano como elemento traza . . . . . . . . . . . . 3.2.9.2- Incorporacin del lantano al medio de cultivo de granos de polen. .

. . . 54 . . . 56 . . . 56 . . . 58 . . . 58 . . . 60 . . . 62 . . . 64 . . . 64 . . . 65 . . . 67 . . . 67 . . . 68

3.2.63.2.7-

3.2.8-

3.2.9-

Captulo 4: Resultados 4.1- Cultivo "in vitro" de anteras . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2- Estudio de la organizacin celular del grano de polen durante su formacin . . . . . . . . . . . . . . 4.2.1- Caracteres generales . . . . . . . . . . . . . . . 4.2.2- Fases en las que se divide . . . . . . . . . . . 4.2.2.1- Tetradas . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2.2.2- Microspora joven recin liberada

. . . . . . 71 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 73 74 75 79

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NDICE 4.2.2.3- Microspora media . . . . . . . . . . 4.2.2.4- Microspora vacuolada . . . . . . . 4.2.2.5- Grano bicelular joven . . . . . . . . 4.2.2.6- Grano bicelular medio . . . . . . . 4.2.2.7- Grano bicelular maduro . . . . . . 4.3- Paso de material a travs de la pared del polen . . . 4.4- Microcuerpos: actividad catalsica, peroxidasica y oxidasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.1- Citoqumica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 84 87 90 95 98

. . . . . . 100 . . . . . . 101

4.1.1- Tcnica de la 3,3-Diaminobencidina (DAB) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101 4.1.2- Tcnica del cerio para detectar diferentes oxidasas . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 4.4.2- Inmunocitoqumica: antiperoxidasa . . . . . . . . . . . 103 4.5- Lminas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 Captulo 5: Discusin 5.1- Cultivo "in vitro" de anteras . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2- Cambios sufridos por el grano de polen durante su desarrollo y maduracin . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.1- Citoplasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.2- Ncleo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3- Ontogenia y desarrollo de la pared del grano . . . . 5.4- Microcuerpos: actividad catalasa, peroxidasa y oxidasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . 183 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187 187 194 203

. . . . . . 213

Captulo 6: Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 217 Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 219

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RESUMEN

Resumen
Esta memoria presenta los resultados del estudio evolutivo del grano de polen de tomate (Lycopersicum esculentum, M.), desde la microspora recin formada hasta la consecucin del gametofito masculino o grano de polen propiamente dicho, constituido por las clulas generativa y vegetativa. Se contemplan las transformaciones metablicas que experimenta el citoplasma durante la maduracin del grano as como el posible papel de microcuerpos o glioxisomas en los estadios de ms elevado metabolismo celular. Otro aspecto a destacar son las caractersticas y propiedades de la pared del polen. Es bien conocido que se trata de una pared perfectamente estructurada, muy resistente a agentes fsicos y qumicos y con un elevado grado de impermeabilidad. Sin embargo el grano de polen obtiene nutrientes procedentes del lculo y del tapetum, por lo que resulta de inters conocer a travs de que vas el grano de polen mantiene comunicacin con el medio que le rodea y si realmente hay paso de material desde el exterior hacia el interior del grano. Como objeto de estudio se ha elegido el tomate, por su importancia agrcola y la falta de estudios a nivel celular en esta especie, adems de ser uno de los materiales elegidos en nuestro grupo de trabajo para poner a punto el cultivo de anteras, con el objetivo de inducir la andrognesis. Este trabajo a nivel ultraestructural, se basa en tcnicas de microscopia electrnica, citoqumicas e inmunocitoqumicas e incluye una discusin acerca de las transformaciones que experimenta el polen durante su desarrollo. Este trabajo se encuadra dentro del Proyecto de Investigacin subvencionado por la DGICYT N PB87-00332-CO2 (1988-1992).

RESUMEN

Abstract
This work presents the results of the evolutive study of the pollen grain, from the young microspore (recently formed) to the male gametophyte or pollen grain, which is constituted by the vegetative and generative cells. It also includes the metabolic transformation of the cytoplasm during the pollen grain maturation and the possible role of microbodies or glioxisomes at the highest stages of the cellular metabolism. Other different aspects of this study are the morphological characteristics and properties of the pollen grain wall. It is known that the pollen grain wall is perfectly structurated, with high resistance to physical and chemical agents, and impermeable. However, it is interesting to find out which are the pollen grain routes where the communication with exterior of the pollen is established. It is also important to determine if a flux of material from outside to inside the grain really exists. We have chosen the tomato as a material of study because it is an important species in agriculture and the researches on cellular level are scarce, and also because it is one of the materials chosen to make anther and pollen cultures to induce androgenesis. This ultrastructural work makes use of electron microscopy, cytochemical and inmunocytochemical techniques, and includes a discussion about pollen transformations during its development. This work has been supported by D.G.I.C.Y.T. project n PB87-00332-CO2 (19881992).

RESUMEN

Captulo 1: Introduccin

La reproduccin sexual tiene un papel trascendental en el ciclo de vida de las plantas. Si las diferentes partes de este ciclo sexual pudieran llegar a ser controladas y manipuladas, es evidente que se obtendra un avance espectacular en la mejora de plantas y su produccin. Actualmente, cuando la ingeniera gentica y otros mtodos de manipulacin gentica se encuentran en su mximo apogeo, nos parece conveniente no olvidar los mtodos convencionales mediante los que la variabilidad gentica ha sido introducida en las plantas, as como los mecanismos que intervienen en ello. El potencial del sistema sexual slo podr ser rentable a medida que se invierta tiempo y esfuerzo en profundizar y conocer las bases celulares, moleculares, genticas y fisiolgicas de estos procesos. La funcin principal de la generacin gametoftica en plantas superiores es transmitir la informacin gentica a la prxima generacin esporoftica. En el

RESUMEN proceso de fertilizacin el gametofito masculino juega un papel ms activo que el gametofito femenino (Barnabs y Kovcs 1988). El gametofito masculino debido a su funcin es una estructura muy especializada independiente del esporofito (al contrario de lo que ocurre en el gametofito femenino), que sufre una intensa competicin entre gametos durante el proceso de polinizacin, germinacin y doble fertilizacin (Pfahler 1978). El polen es el vehculo natural para la transferencia de caracteres genticos por lo que en programas convencionales de mejora siempre jugar un papel central en el desarrollo de nuevas variedades de cosechas, tanto en el presente como en el futuro. Por ello el polen y el conocimiento de su biologa son fundamentales para los procesos de mejora vegetal. Los procesos de reproduccin sexual comprenden: meiosis, diferenciacin de gametos, transporte de gametos masculinos hacia los femeninos, reconocimiento (reacciones de compatibilidad-incompatibilidad) y finalmente la fusin para dar lugar a un cigoto. La responsabilidad de que la fecundacin llegue a buen trmino es tanto de la parte masculina como de la femenina. Sin embargo, desde tiempos histricos, el estudio de la parte masculina ha sido el principal centro de atencin, siendo mucho ms numerosas las publicaciones relacionadas con el polen y su desarrollo, que con el vulo. Las razones que han llevado a este desequilibrio pueden ser varias: a- Una ms fcil accesibilidad al polen que a los vulos y por tanto una mayor facilidad de manipulacin del material. Las anteras son rganos externos que normalmente se encuentran en el pice de un filamento constituyendo unidades independientes y que fcilmente pueden ser extirpadas sin causar grandes daos. En cambio el ovario es un rgano mucho ms interno y no siempre fcil de localizar.

RESUMEN b- Mayor cantidad de polen, ya que mientras en una flor es posible encontrar miles de granos, el nmero de vulos existentes es tan slo uno. c- Por ltimo, existe una razn bastante frecuente en investigacin y es que cuanto ms se conoce de una determinada materia, mayor es el nmero de cuestiones que surgen y los deseos de encontrar respuesta a las mismas. Es difcil desear profundizar en algo que no se conoce. Por ello no se puede decir que el polen sea ms interesante que el vulo, sino que las circunstancias son ms favorables para trabajar con xito en l. En nuestro caso, la eleccin no fue difcil, ya que el grupo de Citologa Vegetal de la Unidad Estructural de Bioqumica Vegetal de la Estacin Experimental del Zaidn, en el que se ha realizado este trabajo, viene desarrollando como lnea principal de investigacin el estudio a nivel celular de la formacin y maduracin del grano de polen en angiospermas. En tesis precedentes se ha estudiado a nivel ultraestructural y citoqumico el grano de polen del olivo (Olea europaea L.) desde el estadio de clulas madres del polen hasta polen maduro. Siguiendo esta lnea se plante la realizacin de este trabajo eligiendo otra planta de inters agrcola como es el tomate (Lycopersicum esculentum Miller). Esta Memoria Doctoral se encuadr dentro del mbito del Proyecto de Investigacin "Estudio de la Expresin Gnica del Grano de Polen Maduro" Proyecto Nmero: PB 87-00332CO2 (1988-1992).

1.1- ANTECEDENTES HISTRICOS

El polen segn el "Diccionario de Botnica" (P. Fontquer 1985) fue definido por Palau (1778) como "polvillo muy fino contenido en la antera, la cual, arrojando

RESUMEN sus partculas con mpetu, fecunda la semilla mediante el humor que exuda el estigma o remate del pistilo". Parece lgico que el hombre desde sus primeros contactos con la naturaleza observara que los frutos derivaban de las flores e incluso que supiera de la existencia del polvo amarillento que hay en los estambres. En un principio este polen fue considerado como alimento y utilizado por tener grandes propiedades teraputicas. Los romanos fueron los primeros en utilizar la palabra de origen latino "polen", cuyo significado significa "flor de harina" para denominar a este polvo floral debido a la utilidad que este tena como harina. No fue hasta el siglo XV cuando empieza a ser estudiado el polen como tal, segn recoge Pla Dalmau en su monografa sobre polen (1961). As, Juan Monardi (1462-1536) comenz a estar interesado en los estambres de las flores. En el siglo XVII Jaime Robert, Sir Thomas Millington y Nehemias Grew empezaron a sospechar que la antera corresponda al rgano masculino de la flor. Camaerarius (1665-1721) llega a la conclusin de que el polen es el factor indispensable para la fecundacin, sin existir los frutos si no hay unin previa de dos agentes fertilizadores. De esta forma se establece la existencia de la sexualidad en vegetales. Koelereuter (1733-1806) fue quien obtuvo por primera vez plantas hbridas, con semillas capaces de germinar mediante la polinizacin artificial utilizando polen de plantas ornamentales de Nicotiana sobre estigmas de otras especies del mismo gnero. Tambin lo realiz en plantas de otras especies como Dianthus, Hyoscyamus, Mattiola. De esta forma se dieron los primeros pasos en lo que hoy en da consideramos mejora vegetal.

RESUMEN Juan E. Purkinje (1787-1869) estudi los tejidos fibrosos de los sacos polnicos y estructuras del polen atendiendo a caracteres tales como forma, grado de transparencia, dimensiones, ornamentacin. Fisher (1890) realiz una clasificacin de plenes, siendo el primero en interpretar el significado de la tetrada como cuatro clulas agrupadas para formar un conjunto. Previamente se consideraba que la tetrada era una clula polinucleada. Tambin observ que la intina es siempre la capa en contacto directo con el plasmalema del polen, siendo ms gruesa all donde la exina es ms fina. Strasburger (1884) observ en estudios realizados con Monotropa que en el pice del tubo polnico, existan un ncleo vegetativo y dos gametos masculinos, de los que posteriormente uno se fusionara con la oosfera. Sin embargo, el primero en observar la doble fecundacin fue Nawaschin (1898) en Fritillaria tenella y Lilium martagon. De esta forma todos los aspectos de la reproduccin sexual en plantas quedan estudiados, siendo ya perfectamente conocidos en el siglo pasado. Por otra parte, en el siglo XIX tambin el polen comenz a ser estudiado en medicina por sus implicaciones en la conocida "fiebre del heno", primeramente denominada "catarro de Bostock", por ser este autor el primero que describi sus sntomas. Tambin se le denomina "catarro de rosas". Pero es Blackley (1873) quien reconoce al polen como verdadero responsable de la "fiebre del heno", o tambin llamada "polinosis", al tratarse de una enfermedad estacional cuya aparicin coincide con la floracin de las gramneas y otras plantas. No fue difcil encontrar una relacin entre el polen y esta enfermedad. Sin embargo, no se conoca como el polen penetraba en las vas internas del organismo. No sera hasta comienzos del siglo XX, cuando se avanz de manera notable en el estudio de las

RESUMEN alergias. La mayora de los estudios que siguieron iban dirigidos al campo mdicofarmacolgico. Desde el punto de vista geolgico es a partir del siglo XIX, cuando se comienza a identificar los granos de polen contenidos en las turberas, inicindose la Paleopalinologia. El libro "Textbook of Pollen Analysis" (Faegri y Iversen 1950) recopila la historia, tcnicas y aplicaciones del anlisis polnico de turberas y sedimentos. En el siglo XIX Brown (1773-1858) demostr y utiliz el polen como carcter taxonmico para determinar los lmites de ciertos gneros botnicos. Pero el estudio de la morfologa del polen y sus implicaciones taxonmicas se desarrolla a principios del siglo XX y se recoge en el libro "Pollen Grains" (Wodehouse 1935), primer trabajo palinolgico aplicado a la taxonoma. El mximo exponente de los morflogos polnicos es el sueco Erdtman (1921-1971), cuyas contribuciones a la morfologa del polen y taxonoma de las plantas son de un valor indiscutible y contribuyeron enormemente al desarrollo de la Actuopalinologia. En su libro "Handbook of Palynology. An Introduction to the study of pollen grains and spores" (1969) , recoge su gran experiencia en este campo. Mas recientemente, con el estudio del contenido polnico del aire y la realizacin de calendarios polnicos de diferentes regiones geogrficas, se desarrolla el campo de la Aerobiologa. Al mismo tiempo se han realizado estudios del contenido polnico en mieles (lo cual determina la calidad de las mismas) y que constituye el campo de la Melitopalinologa. Los diferentes aspectos aqu expuestos sobre el estudio del polen, es lo que constituye la PALINOLOGA. Este trmino fue propuesto por Hyde (1950) para

RESUMEN referirnos a la ciencia que estudia el grano de polen y esporas, as como otros materiales biolgicos que puedan ser estudiados por medio de tcnicas palinolgicas. Esta disciplina relativamente joven, se encuentra en pleno auge y desarrollo, dadas las enormes aplicaciones que tiene tanto en investigacin bsica como aplicada.

1.2- IMPORTANCIA DEL ESTUDIO DEL POLEN

El polen es el gametofito masculino y por tanto acta como vector de transporte de los gametos masculinos (un par de clulas espermticas) hasta el estigma femenino de las angiospermas (Knox 1984). Por tanto es parte importante en el reconocimiento polen-estigma, de manera que slo se produce fecundacin entre aquellos gametos de plantas compatibles. El establecimiento de esta interaccin polen-estigma es de vital importancia en la biologa de la reproduccin sexual de formacin de semillas. Cada grano de polen acta como una unidad aislada, con unas funciones encaminadas a mantener la viabilidad de las clulas espermticas durante los procesos de deshidratacin, hidratacin y germinacin del polen. El concepto de unidad germinal masculina compuesta por las dos clulas espermticas y el ncleo vegetativo fue propuesto por Dumas y col. (1984). La competicin que se origina entre los gametos, parece ser la responsable de que las angiospermas sufran una fuerte seleccin que las ha hecho prevalecer sobre otras plantas. Como resultado de la doble fecundacin, propia de plantas superiores, se da origen a un cigoto, a partir del cual se desarrolla un embrin diploide que acaba dando

RESUMEN lugar a una planta (esporofito). En todo este proceso, el polen juega un gran papel por ser el responsable del origen y transporte de los gametos masculinos, indispensables en esta reproduccin sexual. Dado que el polen es parte fundamental en los procesos de reproduccin de plantas, tambin es uno de los vehculos ms utilizados en los programas de mejora de plantas cultivadas para la transferencia de caracteres genticos. El polen es una parte esencial para la planta, con la cual comparte parte del genoma y procesos metablicos bsicos (Mascarenhas 1989; Evans 1990). La gran diferencia es su carcter haploide, carcter que junto con su tamao y abundancia lo hacen un buen material para ser usado en programas de biotecnologa. El polen por s slo y en condiciones especiales, tambin es capaz de dar origen a embriones, debido a una desviacin del proceso sexual y estos a su vez a plantas haploides, las cuales constituiran la fase esporoftica. Este fenmeno puede ocurrir de forma anormal en la naturaleza. Sin embargo hoy en da tienen un gran inters econmico, de ah el intento de inducir la embriognesis a partir del polen o andrognesis para obtener embriones haploides in vitro. Fueron Guha y Mahehswari (1964), los que obtuvieron por primera vez y de forma regular una alta frecuencia de embriones haploides a partir de anteras de Datura innoxia . Posteriormente han continuado este tipo de intentos llegndose a establecer mtodos generales para la induccin y desarrollo de embriones haploides, callos y plantas a partir del cultivo de anteras o polen (Sunderland 1974, 1983; SangwanNorreel y col. 1986; Sangwan and Norreel 1975; Foroughi-Werh y Wenzel 1989). Los estadios ms apropiados para inducir con xito la andrognesis son justo antes y despus de la mitosis de la microspora (Sunderland 1984; Heberle-Bors 1985;

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RESUMEN Prakash y Giles 1987; Benito Moreno y col. 1988). El embrin puede originarse a partir de la microspora por divisin simtrica, o por divisin asimtrica convencional seguida por divisiones, bien de la clula generativa, bien de la vegetativa (ver esquema V, pag. 260). En el Esquema I se muestra como los haploides se pueden obtener a partir del cultivo de anteras o bien por cultivo del polen aislado. La andrognesis puede ser inducida de varias formas: andrognesis directa- cuando la antera o polen forman directamente embriones; o andrognesis indirecta- cuando previamente a la formacin del embrin se forma un callo a partir del cual se diferencian embriones o se produce organognesis. La obtencin de estos embriones haploides va a venir determinada por una serie de factores crticos para la consecucin de la andrognesis, como son: estadio del polen; genotipo y edad del donador; sometimiento del polen a una agresin (stress) previa mediante diferentes pretratamientos, como son choque trmico o falta de nutrientes en el medio (Maheshwari y col. 1980; Praskash y Giles 1987; Benito Moreno y col. 1988). Las aplicaciones de las plantas haploides obtenidas por andrognesis son muchas, y en ello radica su inters. En primer lugar los individuos obtenidos son haploides, con lo cual la expresin fenotpica y su genotipo van a coincidir totalmente, de manera que podemos observar caracteres que por su naturaleza

recesiva no eran observados antes. Adems, y por la misma razn, se expresan mutaciones que podan tambin estar enmascaradas. Debido a que son plantas con una dotacin cromosmica reducida a la mitad son un material ptimo para

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RESUMEN

ESQUEMA I

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RESUMEN experiencias de transformacin gentica. Se pueden detectar interaccin entre genes. Por otra parte facilitan la obtencin de plantas homocigotas diploides, sobre todo en aquellos casos en los que la fase juvenil es larga. Adems ayudan a reducir el nivel de ploidia en plantas poliploides y son idneas para procesos de fusin somtica in vitro. El mayor inters de los haploides es la posibilidad de producir plantas homocigticas por duplicacin cromosmica. Esta es una ruta ms rpida que la natural, para la obtencin de homocigosis y tiene un gran inters en la produccin de plantas. En la polinizacin cruzada de especies, las plantas homocigticas son mucho ms usadas como parentales para la produccin de hbridos por simple o doble cruzamiento. Las plantas haploides son por tanto de gran inters econmico y cientfico. Por ello es necesario que el material a partir del cual van ha ser obtenidas, el POLEN, sea perfectamente conocido. Es importante, pues, estudiar el polen durante su desarrollo tanto "in vivo" como in vitro y determinar las bases que ayuden a abordar la induccin de la andrognesis con una mayor probabilidad de xito. La microspora es una clula fcilmente accesible, individual y totipotente de modo que ofrece ventajas nicas para el estudio de la divisin celular y diferenciacin.

1.3- LA REPRODUCCIN SEXUAL

Conocemos como organismos eucariotas a aquellos en que sus clulas tienen material gentico localizado dentro de un compartimiento llamado ncleo. En este

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RESUMEN grupo incluimos todos los organismos celulares, a excepcin de bacterias y algas verde azuladas. La reproduccin en eucariotas puede ser asexual (reproduccin vegetativa) y sexual. La reproduccin asexual es frecuente en los organismos vegetales (estacas, estolones); sin embargo el mecanismo ms generalizado y que requiere una mayor especializacin es la reproduccin sexual. La reproduccin sexual conlleva la unin de dos clulas diferenciadas, conocidas como gametos, los cuales tienen una dotacin cromosmica haploide; estas clulas sexuales al unirse dan lugar a un cigoto diploide del que se desarrollar un individuo nuevo. Por lo general las clulas gamticas se originan y provienen de organismos progenitores diferentes, aunque en algunos casos puede haber autofecundacin. En organismos eucariotas existen dos formas diferentes de divisin celular: Mitosis, propia de las clulas somticas. Antes de que tenga lugar esta divisin se produce una duplicacin de los cromosomas, resultando de esta mitosis dos clulas hijas con la misma dotacin cromosmica que la clula madre. Meiosis, esta divisin tiene como resultado la formacin de cuatro clulas haploides que darn lugar a las clulas gamticas. Consiste en dos divisiones mitticas pero slo una duplicacin del material cromosmico. Por tanto, el resultado sern clulas con una dotacin cromosmica que es la mitad que la de la clulas somticas. Se trata pues de una divisin reduccional. Los gametos as originados, se unen dando lugar al cigoto del que se desarrolla un individuo completo y con igual dotacin cromosmica que sus progenitores. Este es en definitiva el modelo general de reproduccin sexual de cualquier organismo eucariota.

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RESUMEN En los vegetales las clulas gamticas se originan en sus respectivos rganos, masculinos o estambres y femeninos o carpelos. En la reproduccin sexual en vegetales, el polen, originado en los microesporngios de la antera, una vez maduro es "trasladado" de muy diversas formas y medios (viento, animales, agua) hasta el rgano sexual femenino. Una vez en el estigma, forma el tubo polnico, dentro del cual hay dos clulas espermticas o verdaderos gametos y un ncleo vegetativo. Estas clulas espermticas penetran por el micropilo y tiene lugar la doble fecundacin. Uno de los ncleos espermticos se une a la oosfera (gameto femenino) originando el cigoto. El otro ncleo espermtico, se une al ncleo del endospermo el cual da lugar a un tejido triploide que es el endospermo secundario, encargado de la nutricin del cigoto. De esta manera obtenemos semillas las cuales se encuentran encerradas dentro del fruto, entendiendo como fruto a aquellas partes de la flor que acompaan a la semilla hasta su maduracin y que la ayudan en su diseminacin.

1.4- EL MICROSPORANGIO

El rgano masculino en plantas est constituido por un filamento y una antera los cuales constituyen el estambre. Una antera joven es una masa de tejido meristemtico rodeado de epidermis, dentro de esta existen cuatro grupos de clulas arquesporiales o cuatro microsporangios (esquema II). Una antera madura est formada por cuatro lculos separados entre s por tejido conectivo. Dentro de cada lculo hay un microsporangio o saco polnico donde se encuentran las mi-

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RESUMEN crosporas-granos de polen, rodeadas por el tapetum y el resto de los tejidos de la pared de la antera: capa intermedia, endotecio y epidermis. El Tapetum es un tejido especializado que tiene por funcin la de proveer a las microsporas los nutrientes necesarios para su desarrollo. En ocasiones, estos cuatro microsporangios pueden quedar reducidos a dos por rotura del tabique de separacin. En las angiospermas primitivas el estambre era una estructura laminar y expandida, incluso sin diferenciacin entre las partes frtiles y las estriles, siendo el conectivo muy desarrollado en un principio, para luego ir reducindose progresivamente. Los microsporangios presentan diferentes caracteres segn las especies dependiendo del grado de evolucin de las mismas.

ESQUEMA II

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RESUMEN 1.5- MICROESPOROGENESIS

Entendemos como microsporognesis a la formacin de las microsporas dentro del microsporangio. A partir de las microsporas tiene lugar la microgametognesis, la cual comprende la formacin del polen como consecuencia de una mitosis asimtrica y la formacin de los gametos por mitosis de la clula generativa. Microsporognesis: el tejido esporgeno se multiplica por divisiones mitticas sucesivas hasta alcanzar un nmero determinado de clulas. Estas clulas entran en meiosis pasando a ser clulas madres del polen (CMP). Se desconocen los factores que desencadenan el paso de dichas clulas a la meiosis. El resultado de esta divisin meitica son cuatro clulas haploides reunidas dentro de una pared especial de calosa y conocidas como microsporas (Heslop-Harrison 1964; 1966a,b; Dunbar 1973a,b) que ms tarde quedan libres en el lculo, dando lugar a la formacin del polen. Las tetradas suelen estar en disposicin tetradrica o tetragonal dependiendo de que la tabicacin ocurrida despus de la meiosis sea de tipo sucesivo o simultneo (Wodehouse 1935; Pla Dalmau 1961) . Hay excepciones, existiendo tetradas con formas muy diversas incluso dentro de la misma especie siendo posible encontrar dos o ms tipos de tetradas (segn su disposicin) Musa (Juliano y Alcal 1933), Laurus (Battaglia 1947), Ottelia (Islam 1959). Durante la profase meitica, las CMP se encuentran conectadas entre s por los llamados canales citomcticos o conexiones, a travs de los cuales puede haber intercambio de material citoplsmico e incluso de organlas (Heslop-Harrison 1966a; Risueo y col. 1969). A lo largo de la profase meitica empieza a depo-

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RESUMEN sitarse la calosa alrededor de los meiocitos (Waterkeyn 1962; Svarla y Larson 1966; Alch 1991). Es a partir de paquitene cuando se detectan los primeros depsitos de calosa fcilmente reconocibles por la fluorescencia que presentan con tincin mediante azul de anilina (Currier y Strugger 1956; Alch y col. 1990). En un principio la pared de calosa es incompleta alrededor de los meiocitos, permitiendo que las conexiones citoplsmicas entre clulas se mantengan. En la segunda divisin estos canales han desaparecido totalmente y las clulas estn del todo rodeadas por la pared de calosa. Durante el perodo de tetrada joven se deposita la primexina y los primeros depsitos de las probculas y tectum que definen la futura estructura de la exina. Una vez que las jvenes microsporas ya tienen consolidada la estructura caracterstica de la exina, se produce la degradacin de la calosa, quedando las microsporas libres en el lculo de la antera. Se ha propuesto que la calosa se degrada por la accin de la calasa, enzima que parece proceder del tapetum (Frankel y col. 1969; Izhar y Frankel 1971). La microspora, libre en el lculo de la antera, es la primera clula de la generacin gametoftica. La vida media de una microspora varia segn la especie siendo ms corta en plantas tropicales (Maheshwari 1949, 1950). Estas clulas van aumentando progresivamente de volumen hasta alcanzar una masa crtica para dar lugar a la divisin mittica asimtrica cuyo resultado es el grano de polen bicelular (Knox 1984). Durante el estadio de microspora el ncleo se encuentra en perodo de interfase, durante la que se prepara para la divisin asimtrica. Lo ms caracterstico de ella

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RESUMEN parece ser el largo perodo S en el que ocurre una mayoritaria sntesis de DNA (Testillano 1991).

1.6- FORMACIN DEL GRANO DE POLEN

Como consecuencia de la marcada polaridad que presenta la microspora antes de la mitosis se originan dos clulas desiguales, vegetativa y generativa. La vegetativa de mayor tamao, engloba a la generativa. Estas diferencias de tamao entre las dos clulas hijas lleva implcito un reparto desigual de las organelas, quedando la mayora en el lado del grano que va a corresponder a la clula vegetativa. Generalmente, todos los plastidios permanecen en la clula vegetativa mientras la clula generativa presenta ausencia de ellos, salvo algunas excepciones (Hagemann 1981; Russell y Cass 1983). Existen pocos estudios acerca del la clula generativa, pero la mayora coinciden en afirmar que el nmero de organelas presentes en ella es muy bajo (Mascarenhas 1975; Bhandari 1984). El ncleo vegetativo se sita en el centro del grano mientras el ncleo generativo se encuentra desplazado junto a la pared del grano. Parece existir una relacin entre la apertura del grano de polen y la posicin que la clula generativa tiene dentro de este. Siguiendo la hiptesis de Huynh (1976) o "ley de la distancia mxima", la clula generativa se localiza en el punto ms lejano de la apertura germinativa, existiendo algunas excepciones (Sampson 1981). La placa celular, situada entre ambos ncleos, se curva alrededor del ncleo generativo para fusionarse con la intina en los extremos, formando una envoltura

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RESUMEN semiesfrica y resultando de esta manera dos clulas aisladas pero en cierta medida dependientes una de otra (la clula generativa depende de la clula vegetativa). La pared de la clula generativa, sin ningn tipo de plasmodesmos, se va poco a poco estrangulando hasta llegar a liberarse de la intina, quedando la clula generativa inmersa en el citoplasma de la vegetativa. La clula generativa cambia de forma pasando de ser redondeada a tener una forma alargada (Cresti y Tiezzi 1990). Merece la pena destacar el papel que juega el citoesqueleto en mantener la forma alargada y posiblemente en el desplazamiento de la clula generativa hacia el tubo polnico. Se ha descrito la presencia de microtbulos dispuestos de forma paralela al eje longitudinal de la clula generativa (Ciampolini y col. 1988; Cresti y col. 1984, 1985; Dickinson y Sheldom 1984; Fernndez 1986). El ncleo generativo rpidamente adquiere el aspecto propio de un ncleo inactivo, con condensacin de la cromatina y desaparicin del nucleolo. La clula vegetativa sufre una espectacular transformacin del citoplasma durante la maduracin del polen, pasando por diferentes etapas en cuanto a las sustancias de reserva que almacena. En la madurez puede presentar una elevada cantidad de almidn (Feijo y Pais 1988; Sangwan y Sangwan-Norreel 1987) o bien en otras especies el almidn se transforma dando lugar a la aparicin de cuerpos lipdicos (Miki-Hiroshige y Nakamura 1983; Fernndez 1986; Charzinska 1989). El ncleo presenta las caractersticas propias de una gran actividad en cuanto a sntesis y procesamiento de RNA (Mascarenhas 1989), como se refleja en la estructura nucleolar y en el aspecto descondensado de la cromatina. Inicialmente es de gran volumen, esfrico y ocupa el centro del grano. Slo hacia el final de la madura-

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RESUMEN cin, cuando el grano ya tiene la maquinaria necesaria para germinar, el ncleo presenta sntomas de degeneracin: forma muy lobulada, desaparicin del nucleolo y masas de cromatina condensada. Se desconocen los factores genticos responsables de que el ncleo vegetativo no complete su ciclo para dividirse de nuevo. La clula vegetativa es una clula altamente especializada, que adquiere a lo largo de la maduracin la infraestructura necesaria para la formacin del tubo polnico (Fernndez 1986; Charzynska y col. 1989). Dentro de las transformaciones que ocurren en el citoplasma vegetativo, es importante destacar aquellas encaminadas a la metabolizacin de almidn y cuerpos lipdicos. Se ha descrito la presencia de microcuerpos en gran variedad de tejidos vegetales (Sautter 1989), pero son muy pocas las referencias acerca de la existencia de estos orgnulos en el grano de polen (Charzynska y col. 1989; Pais y Feijo 1986, 1987). Como es sabido estos orgnulos estn intimamente relacionados con procesos de transformacin de sustancias lipdicas a azcares (Beevers 1980). El detectar la presencia de estos orgnulos dentro del grano de polen, o actividades enzimticas asociadas a ellos, es de gran importancia para comprender un poco mejor los procesos metablicos que ocurren durante la maduracin del grano de polen. Antes de que se produzca la antesis ocurre una deshidratacin muy rpida en la antera (Linskens 1976a, b). La dehiscencia de la antera y dispersin de los granos de polen estn influenciados por numerosos parmetros como pueden ser: temperatura, humedad y luz, entre otros (Linskens y Cresti 1988). En relacin con el factor humedad, la germinacin del grano de polen depende esencialmente del

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RESUMEN grado de hidratacin del grano. Los diferentes estados de hidratacin que sufre el polen durante su desarrollo y germinacin han sido estudiados en algunas especies (Dumas y Gaude 1983; Duplan y Dumas 1984). Durante la deshidratacin previa a la germinacin, que puede variar segn las especies, el polen entra en una fase de dormancia que se prolonga hasta que se produce una activacin, bien de forma natural o bien artificial. El polen no vuelve a ser rehidratado hasta que se encuentra en la superficie estigmtica ya listo para germinar (Heslop-Harrison 1987). El tubo polnico emerge a travs de la apertura, la cual es una regin diferenciada de la pared. Esta diferenciacin tiene lugar tanto a nivel de la exina como de la intina. En los plenes inaperturados la salida del tubo polnico tiene lugar por rotura de la exina (Knox 1984). El primer hecho asociado con la germinacin, es la hidratacin e hinchazn que sufre la capa externa de la intina. En el grano de polen de tipo bicelular las dos clulas espermticas se forman por divisin de la clula generativa dentro del tubo polnico. En otros casos la clula generativa sufre la divisin dentro del grano de polen en donde se forman las clulas espermticas antes de la antesis, se trata de plenes de tipo tricelular.

1.7- FORMACIN DE LA PARED DEL GRANO DE POLEN

La pared del grano de polen presenta unas caractersticas peculiares que la hacen diferente tanto en estructura como en funcin al resto de paredes celulares.

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RESUMEN Ello hace que sea merecedora de una especial atencin por nuestra parte. La pared del polen no slo sirve para proteger y aislar al grano, sino que por el contrario debe permitir el paso de sustancias del exterior, necesarias tanto para su desarrollo como para llevar a cabo su funcin primordial: la germinacin. Por tanto la organizacin tpica que presenta la pared del polen hay que interpretarla como una adaptacin para llevar a cabo este tipo de funciones (Blackmore y Barnes 1990). En el esquema III, se muestran las diferentes capas y estructuras de la pared del polen as como las denominaciones que se le han dado segn se atienda a criterios puramente morfolgicos (Erdtman 1952) o a las propiedades de tincin (Faegri

ESQUEMA III

1956). Nosotros hemos elegido la nomenclatura de Faegri por ser esta la ms

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RESUMEN comnmente usada hoy en da. El patrn o estructura de la exina, queda establecido mientras las microsporas se encuentran encerradas dentro de la pared de calosa constituyendo la tetrada (Heslop-Harrison 1988c). Posteriormente continua desarrollndose durante el estadio de microspora ya libre en el lculo. El polen tiene una envoltura muy particular lo cual hace que las caractersticas de esta cubierta puedan utilizarse como dato taxonmico, debido a su apariencia semitectada, reticulada, verrucosa, tectada, etc. La pared del polen est constituida por dos capas: externa o exina y otra interna o intina. La Exina es la capa ms externa compuesta por material resistente a la acetolisis (Erdmant 1969), denominado esporopolenina, asociado a restos de primexina y a depsitos de tapetum (Southworth 1974, 1990). Su origen parece ser por polimerizacin oxidativa de pigmentos carotenoides y steres de carotenoides (Brooks y Shaw 1978; Shaw 1971). Tiene propiedades en comn con la lignina y cutina (Kolattukudy 1980). La pared contiene aproximadamente un 1% de slice (Southworth 1990). La exina se puede subdividir en: Ectexina, consiste en elementos estructurados bsicamente constituidos por columelas y tectum que a su vez pueden presentar ornamentaciones externas diversas. Su formacin va ocurriendo por la adicin de materiales procedentes del tapetum durante el estadio de microspora libre (Blackmore y Barnes 1987a). Endexina, es el estrato exnico que envuelve a la intina; se caracteriza por la presencia de estructuras trilamelares denominadas en la literatura como "whiteline-centred lamellae" o lamelas con una lnea blanca central (Rowley y Southworth 1967). Existen grupos de plantas superiores en los que la endexina

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RESUMEN puede estar ausente (Blackmore y Barnes 1987 a,b). La Intina por su naturaleza y propiedades correspondera a la pared celular propia de una clula vegetal, de naturaleza celulsica (Kress y Stone 1983; Blackmore y Barnes 1990). Esta capa inicia su formacin en el estadio de microspora vacuolada continuando a lo largo del grano bicelular (Blackmore y col. 1988; Blackmore y Barnes 1990). Su espesor es variable y segn las especies se puede apreciar de uno a dos estratos diferenciados (Kress 1986). Uno ms interno de naturaleza celulsica y de apariencia fibrilar, conocido como intina primaria y otro ms externo que corresponde a la intina secundaria y que contiene gran cantidad de polisacridos cidos (Mhlethaler 1953; Sitte 1953; Bailey 1960; Kress 1986). Esta diferenciacin en dos estratos suele aparecer preferencialmente a nivel de las zonas aperturales. El polen maduro puede presentar en la superficie externa de la exina y entre sus cavidades, material de naturaleza lipoproteica procedente de la degradacin del tapetum siendo denominado cubierta del polen o "polen coat" en general. Si este material se ha originado por nueva sntesis predominando en el los componentes de lipdicos se conoce como "Pollenkitt", mientras que si se trata de material proteinaceo procedente de la degradacin del tapetum se le denomina "Trifinas" (Bhandari 1984). En general a estas cubiertas polnicas les ha sido atribuido las responsabilidad del carcter "pegajoso" del polen (Troll 1928; Phol 1930; Knoll 1930, 1936), as como de su color amarillo por contener carotenos y flavonoides. Su papel es ayudar al polen a atraer a los insectos y de que este se adhiera al cuerpo del insecto (Heslop-Harrison 1968b) adems probablemente sea una buena proteccin contra la accin de rayos ultravioleta.

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RESUMEN La pared del polen es la nica a travs de la cual puede existir alguna comunicacin entre el grano y el medio que lo rodea o lculo de la antera. Es lgico pensar que el polen debe de recibir los nutrientes necesarios para su desarrollo desde el tapetum (Knox 1984). Por tanto deben existir lugares a travs de los cuales se produzca este paso. Se ha descrito la existencia de canales o microcanales (Rowley 1975, 1976; Fernndez y Rodrguez-Garca 1990) pero estas estructuras, si estn presentes, varan de unas especies a otras. Las regiones aperturales pueden ser consideradas como zonas de la pared del polen travs de las cuales se producir la salida del tubo polnico durante la germinacin. Estas regiones sufren modificaciones estructurales durante el perodo el desarrollo y maduracin del grano (Fernndez y Rodrguez-Garca 1985, 1989). El nmero de aperturas que puede tener un grano de polen es muy variable, encontrndose plenes que carecen de ellas (inaperturados) mientras otros tienen numerosas aperturas (multiporados). Lo ms corriente es que el polen tenga una sola apertura como ocurre en muchas monocotiledneas, aunque son tambin frecuentes los plenes que constan de tres regiones aperturales como ocurre en muchas de la dicotiledneas. La gran variedad de tipos de aperturas en cuanto a forma y componentes que las constituyen hacen que estas regiones sean tradicionalmente consideradas como un importante dato taxonmico. En el caso de plenes que presenten regin apertural compuesta (endo y ectoaperturas), la estructura de la apertura consiste en una diferenciacin o hinchazn de la endexina denominada "oncus de la endexina" (Fernndez y Rodrguez-Garca 1988) la cual constituye la endoapertura del polen maduro. En estas aperturas germinales del grano maduro la exina no existe o queda reducida a un casquete

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RESUMEN u "oprculo", constituyendo la ectoapertura. A nivel de la intina se produce una hinchazn denominada "oncus de la intina" el cual se ha formado por un engrosamiento en forma de lente en la intina de la regin apertural (Fernndez y Rodrguez-Garca 1988). Las funciones atribuidas a las regiones aperturales son varias, aunque la ms importante y fundamental es la de permitir la germinacin del polen dando lugar a la salida del tubo polnico. Parece ser el oncus de la intina el que facilita esta salida del tubo polnico. Entre las otras funciones en las que parece que las regiones aperturales desempean un papel importante, merece destacar: - Regulacin de los cambios de volumen o harmomegatia (Woodehouse 1935) que experimenta el grano como consecuencia de su desarrollo, as como del grado de humedad o sequedad que tiene el polen en la madurez. Esto ocurre gracias al alto grado de flexibilidad que tienen estas zonas respecto al resto de la pared (Blackmore and Barnes 1986; Fernndez y col. 1992). -Como vas de paso de materiales procedentes del exterior permitiendo el paso de sustancias en los estadios jvenes de desarrollo (Fernndez y RodrguezGarca 1990). - Como lugar de almacn de protenas necesarias para la germinacin (Kress 1983; Heslop-Harrison y col. 1986).

1.8- EL TOMATE COMO MATERIAL DE ESTUDIO

El tomate (Lycopersicum esculentum, Miller) pertenece a la familia Solanaceae

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RESUMEN caracterizada por ser hierbas erectas o trepadoras, arbustos o rboles con hojas alternas, frecuentemente enteras. Flores hermafroditas en general con simetra radiada. Ovario spero, con dos carpelos de dos o ms cavidades, un estilo. Anteras en un cono que rodea al estilo, que se abren por hendiduras longitudinales, no por poros. Las anteras tienen la punta estril, prolongada aguda o estrecha. Lycopersicum esculentum descubierto por Miller es una planta glanduloso paludosa, de olor fuerte, anual, de hasta un metro de longitud, con hojas pinnadas, flores amarillas en ramilletes ramificados, con grandes frutos en baya carnosos y rojos. La corola es de unos dos centmetros de dimetro, con estambres imparipinnados, con foliolos grandes, ovales, irregularmente dentados, con otros foliolos menores intermedios. Fruto globular o lobulado, pero generalmente comprimido de arriba abajo, de color rojo brillante, raramente amarillo (O. Polunin 1982) .

1.8.1- ORGENES

El nombre del tomate deriva del la palabra "Tomatl" en "Nahuatl" que es el idioma de los antiguos mexicanos. No se conocen con exactitud los orgenes del tomate, pero la evidencia sugiere que fue en Mxico donde apareci por primera vez. El tomate cultivado se origin en el Nuevo Mundo antes de ser llevado a Europa y Asia, siendo la primera variedad que se conoce la del tomate cereza (Lycopersicum esculentum var. cesariforme). Todas las variedades cultivadas en Europa y Asia son descendientes de las semillas tradas de Mxico por colonizadores, frailes y comerciantes europeos del

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RESUMEN siglo XVI. Datos histricos indican que el tomate fue trado por Hernn Corts en 1523, poco despus de la conquista de Mxico. Parece que la primera mencin del tomate en Europa es de Pier Andres Matioli en el 1554. Otros mencionan a Mathilous, 1554. Pero en Francia no se conoci hasta 1660 siendo su primera funcin la de planta ornamental.

1.8.2- USOS Y PROPIEDADES

En el captulo primero del libro quinto de "Plantas Medicinales" de Francisco Hernndez (alrededor de 1580), se relata de una forma exhaustiva las diferentes variedades de tomate y de sus virtudes curativas. "Aparte de las dems especies de solano, de las cuales hablamos al tratar de las plantas de nuestro Viejo Mundo, hay en este, otras cuyos frutos, llamados tomatl porque son redondos, estn encerrados en una membrana, son de naturaleza seca y fra y participan de alguna acidez..." "... Curan, aplicados a fstulas lagrimales y los dolores de cabeza, alivian los ardores de estmago, y untados con sal resuelven las paperas. El jugo es bueno contra inflamaciones de garganta, y cura las lceras reptantes mezclado con albayalde, aceite rosado y litargirio. Para las fstulas lagrimales se mezcla con pan; para la irritacin de los nios que llaman soriasis, con aceite rosado; se agrega a los colirios en vez de agua..." Los principios ms importantes del tomate son las vitaminas A y C; La vitamina A defiende al organismo de infecciones de vejiga y riones. La vitamina C es

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RESUMEN importante para el tejido conjuntivo, formacin de huesos y tejido capilar, siendo esenciales en la dieta. El tomate es uno de los alimentos ms populares y de mayor consumo en el mundo. slo fue aceptado universalmente como alimento a partir del siglo XIX. Anteriormente no era consumido, por la creencia existente de que sus frutos contenan alcaloides, al pertenecer a la familia de las Solanceas, al igual que la Belladonna y Mandrgora, y por tanto se tema su toxicidad. Recientemente se ha comprobado que el tomate, contiene alcaloides, aunque slo los tomates verdes, puesto que la solanina que contiene desaparece al madurar. Florece en primavera y los frutos se dan en verano y en otoo, aunque con las nuevas tcnicas de cultivo se consigue durante todo el ao. En los climas

templados, como Canarias, se cultivan durante todo el ao y constituyen un importante artculo de comercio exterior. La simiente de tomate resiste el paso por el tubo digestivo de las personas y adems esto acrecienta las facultades germinativas de las semillas. Por ello, aparecen muchas tomateras cimarronas en lugares retirados, en desages, junto a muros rurales o en cunetas sin tener ningn cuidado ni riego (P. Iglesias 1988).

1.8.3- POR QU EL TOMATE COMO MATERIAL DE ESTUDIO?

Los estudios sobre polen realizados en esta especie son relativamente escasos. En un principio se realizaron estudios a nivel de microscopia ptica (Smith 1935; Rick 1984; Moens 1964; Sawhney y Bhadula 1988). Adems, los estudios existentes a nivel ultraestructural, han sido realizados en otra especie, como es

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RESUMEN Lycopersicum peruvianum en la que se describe el proceso de la microsporognesis (Paccini y Cresti 1978; Pacini y Juniper 1984). A nivel ultraestructural de Lycopersicum esculentum slo existen aportaciones muy especficas (Bonner 1988; Polowick y Shawney 1992; Fernndez y col. 1992), pero falta un estudio completo y sistemtico sobre la microsporognesis del tomate. Por otra parte el tomate es una planta de cultivo muy importante econmicamente por lo que es deseable conocer mejor la formacin y desarrollo de su polen. Este tipo de estudios tambin son de inters en las investigaciones realizadas con lneas que muestran esterilidad masculina, las cuales pueden ser utilizadas en la produccin de semillas hbridas.

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OBJETIVOS

Captulo 2: Justificacin y Objetivos

2.1- JUSTIFICACIN

El grano de polen es un material ptimo para usar en experiencias de transformacin gentica, debido a su fcil manipulacin, el elevado nmero de granos y carcter haploide del mismo, as como por su capacidad de transmitir las transformaciones genticas inducidas a las prximas generaciones. El cultivo de anteras y granos de polen tiene una gran importancia econmica debido a sus implicaciones en la mejora gentica de plantas. El objetivo de los cultivos es la obtencin de individuos haploides los cuales, tienen una serie de

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OBJETIVOS

ventajas como son: reduccin del nivel de ploidia, deteccin de caracteres y mutaciones recesivas y obtencin de individuos homocigotos diploides. Aunque las Solanceas es una de las familias ms utilizadas y con mayores probabilidades de xito en la obtencin de haploides, sobre todo en el gnero Nicotiana (Nakata y Tanaka, 1968); (Reinert y col., 1975); (Sunderland y Wicks, 1971), sin embargo escasean los intentos realizados en tomate Lycopersicum esculentum Mill. (Greeshoff y Doy, 1972); (Levenko y col., 1977); (Sharp y Raskin, 1972). Para abordar con xito el estudio morfofuncional de la induccin del embrioide haploide es necesario una serie de investigaciones a nivel bsico, las cuales conllevan la puesta a punto de determinadas tcnicas, as como un conocimiento exhaustivo a nivel citolgico del material a utilizar. Los estudios sobre el desarrollo del polen son muy numerosos, sin embargo son muchas las incgnitas que permanecen abiertas y que necesitan de una mayor investigacin. Si bien es cierto que el desarrollo del polen sigue un modelo general en angiospermas, existen peculiaridades, dentro de cada especie, como resultado de la evolucin, el medio ambiente y estrategias de la planta a estudiar. Estas peculiaridades deben de ser tenidas en cuenta a la hora de realizar el cultivo de anteras "in vitro". De aqu el inters del estudio del desarrollo del polen, y en nuestro caso el polen de tomate, durante su desarrollo y maduracin.

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OBJETIVOS

2.2- OBJETIVOS

1- Puesta a punto del cultivo de anteras para inducir la embriognesis.

2- Organizacin celular del polen de tomate basndonos en el comportamiento secuencial del ncleo y citoplasma durante el desarrollo del gametofito, desde final de la meiosis hasta la dehiscencia de la antera. Se har mayor nfasis en las fases de desarrollo que han sido descritas como ms propicias para conseguir la embriognesis (microspora vacuolada y grano bicelular joven). Para realizar estos estudios se ha utilizado microscopia ptica y electrnica convencional complementando con tcnicas citoqumicas.

3- Determinar la presencia de microcuerpos durante la maduracin del grano (glioxisomas) y/o actividad catalasa, peroxidasa y oxidasa. Para ello se ha recurrido a tcnicas citoqumicas e inmunocitoqumicas.

4- Determinar las vas de paso de materiales a travs de la pared del grano de polen (exina e intina) mediante la utilizacin de elementos traza como es el Nitrato de lantano.

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MATERIAL Y MTODOS

Captulo 3: Material y Mtodos.

3.1-MATERIAL

Como material utilizamos flores de tomate Lycopersicum esculemtum Miller, var. tvoli de las cuales extraemos las anteras. Las flores se toman de muy distintos tamaos, desde botones florales los cuales estn todava cerrados, hasta flores totalmente abiertas. De esta manera trabajamos con una amplia variedad de tamaos de anteras, desde unos 3mm hasta 8mm de longitud. Las anteras que utilizamos para nuestro trabajo abarcan estadios comprendidos entre tetradas y polen bicelular maduro.

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MATERIAL Y MTODOS

LMINA 1 MATERIAL

a- Flores de tomate (Lycopersicum esculentum).

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Lmina 1

MATERIAL Y MTODOS

3.2- MTODOS

3.2.1- CULTIVO "IN VITRO" DE ANTERAS DE TOMATE

Se tomaron brotes florales de tomate Lycopersicum esculentum var. tvoli de tamaos que varan desde 3mm, hasta flores totalmente abiertas. Los brotes se desinfectaron en etanol de 100 durante uno o dos minutos como mximo, posteriormente se lavaron con agua bidestilada y autoclavada, dando tres lavados de unos diez minutos cada uno, donde se mantienen hasta que se procede a su cultivo. Una vez lavados estos brotes florales se realiz su diseccin con ayuda de una lupa binocular Zeiss Stem SR para luego ser cultivados en placas Petri con unos 15ml de medio solidificado con 8gr/l de agar. Se utilizaron dos medios de cultivo diferentes:

- DBM I y DBM II (Greeshoff y Doy 1972) - MS (Murashige y Skoog 1962)

MEDIO DE GRESSHOFF y DOY

Solucin mineral A: NaH2PO4.H2O 45

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MATERIAL Y MTODOS Na2HPO4 KCl (NH4)2SO4 MgSO4.7H2O KNO3 CaCl2.2H2O KI 15 150 100 125 500 75 0,375

Cantidades expresadas en mg/100ml

Solucin mineral B:

KH2PO4 KNO3 NH4NO3 Ca(NO3)2 MgSO4.7H2O KCl KI

150 500 500 173,5 17,5 32,5 0,4

Cantidades expresadas en mg/100ml

Quelato de Hierro:

FeSO4.7H2O EDTA-Na2

0,0278 0,0372

Cantidades expresadas en gr/5ml

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MATERIAL Y MTODOS Solucin de Vitaminas x10:

A.Nicotnico Thiamina Piridoxina Myoinositol Glycina Cantidades expresadas en mg/10ml

1 10 1 100 4

Solucin de Macronutrientes x1000:

MnSO4.H2O H3BO3 ZnSO4.7H2O Na2M0O4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O

1120 310 430 13 1,3 1,3

Cantidades expresadas en mg/100ml

Solucin de Hormonas:

NAA DBM1 DBM2 DBM3 2 2 5

Kinetina 5 1 0,01

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MATERIAL Y MTODOS DBM2,2 DBM2,3 DBM2,4 DBM2,5 0,1 0,1 5 8 Cantidades expresadas en mg/l. 0 2 2 0,1

Composicin total del medio:

Componentes Sol. mineral Vitaminas Quelato de Hierro Sol. microelementos Agar Sacarosa

DBMI 200 (A)ml 10 ml 5 ml 1 ml 8 gr 20 gr

DBMII 200(B)ml 10ml 5ml 1 ml 8 gr 20 gr

Volumen total de medio 1 litro, pH= 5,8-6,4

MEDIO DE CULTIVO DE MURASHIGE y SKOOG

Solucin de Macronutrientes:

NH4NO3

3,3

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MATERIAL Y MTODOS KNO3 Cl2Ca.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 3,8 0,88 0,74 0,34

Cantidades expresadas en gr/100ml

Solucin de Micronutrientes (x10):

KI H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O NaMoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O

0,166 1,24 4,46 1,72 0,05 0,005 0,005

Cantidades expresadas en gr/100ml

Solucin de Hierro

FeSO4.7H2O EDTANa2

0,0278 0,0373

Cantidades expresadas en gr/5ml

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MATERIAL Y MTODOS Solucin de Vitaminas:

Myoinositol Ac. Nicotnico Piridoxina ClH Thiamina ClH

0,2 0,001 0,001 0,004

Cantidades expresadas en gr/10ml

Composicin del hormonas en el medio: Hormonas NAA Kinetina MSA 2mg/l 5mg/l MSB 2mg/l 1mg/l

Las hormonas utilizadas en ambos casos han sido NAA y Kinetina en las concentraciones siguientes:

NAA 2mg/l 2mg/l 8mg/l 0,1mg/l

Kinetina 1mg/l 5mg/l 5mg/l 0mg/l

El pH del medio fue ajustado a 5,8-6. los cultivo se mantuvieron a 25oC y oscuridad durante un perodo de ocho semanas, pasadas las cuales se cambiaron

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MATERIAL Y MTODOS las condiciones a 25oC y luz con fotoperodo dieciseis horas. Paralelamente al cultivo, se tomaron anteras para su estudio mediante microscopia ptica, con la finalidad de controlar el estadio en que se encuentran las anteras cuando se realiza el cultivo.

3.2.2- PROCESAMIENTO CONVENCIONAL DE MUESTRAS PARA MICROSCOPIA ELECTRNICA DE TRANSMISIN:

El material que va a ser observado a microscopia electrnica necesita ser sometido a una serie de tratamientos previos para conseguir que las estructuras celulares se mantengan con la misma forma y caractersticas que cuando estn vivas. Para ello es imprescindible determinar las condiciones ptimas de fijacin e inclusin, teniendo en cuenta los diferentes parmetros que van a ser decisivos para la obtencin de buenos resultados. Estos factores a tener en cuenta son: concentracin del fijador, molaridad de la solucin tampn, pH, temperatura, tiempo etc. En nuestro laboratorio ya han sido obtenidas previamente las pautas necesarias a seguir en el procesamiento del material objeto de este estudio, las anteras. El preparado de las muestras se realiza siguiendo una serie de pasos que podemos agrupar en las siguientes etapas:

Fijacin Qumica - Para ello utilizamos una solucin de glutaraldehdo al 3%, el cual est comercializado con una riqueza del 25%. Esta solucin se prepara en tampn cacodilato 0,025M a un pH=6,9.

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MATERIAL Y MTODOS
PREPARACIN DEL TAMPN CACODILATO: diluir 2,675gr de cacodilato sdico en 500 ml de agua destilada. PREPARACIN DE LA SOLUCIN FIJADORA: diluir 3ml del glutaraldehdo al 25% en 22ml de Tampn.

Se cortan las piezas del tamao aproximado de 1mm2 y se introducen en el fijador durante cuatro horas. Para eliminar el fijador, una vez pasado el tiempo correspondiente, se introducen las muestras en tampn cacodilato durante una hora dando tres lavados de aproximadamente veinte minutos cada uno. Para mejorar la fijacin anteriormente realizada (prefijacin), sometemos el material a una Postfijacin.

La Postfijacin se realiza con tetrxido de osmio (O4Os) al 1% en tampn cacodilato 0,025M.

PREPARACIN DE LA SOLUCIN PARA LA POSTFIJACIN: diluir 0,1gr de tetrxido de osmio en 10ml de tampn.

Es necesario que tanto la ampolla que contiene al osmio como el recipiente donde se va a preparar la solucin estn muy limpios sin ningn resto de suciedad ya que de lo contrario se facilitara la oxidacin del osmio, disminuyendo su actividad fijadora. Previamente a la disolucin de este en el tampn mantenemos la ampolla, ya limpia, dentro de la estufa a unos 60oC durante dos o tres minutos. De esta manera el osmio pasa de estar cristalizado a estar lquido con lo que al disolverlo dentro del tampn se mezclan mejor. La solucin de osmio debe resguardarse de

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MATERIAL Y MTODOS la luz, en recipiente opaco, para evitar la oxidacin. Las muestras permanecen en esta solucin durante una hora, pasada la cual procedemos a un nuevo lavado en el tampn. Generalmente mantenemos las muestras lavando durante toda la noche. En ocasiones se omite la postfijacin de las muestras con osmio cuando as lo requiere el posterior tratamiento citoqumico.

Deshidratacin- Es necesaria para eliminar el agua de los tejidos ya que la resina que posteriormente utilizaremos es hidrofbica. Dependiendo del tipo de resina que vayamos a usar realizaremos este paso bien en alcohol (cuando las resinas utilizadas son Epn o Araldit), o bien en acetona (para las resinas Spurr o Araldit). Los tiempos para ambas son los mismos.

alcohol/acetona 30% alcohol/acetona 50% alcohol/acetona 70% alcohol/acetona 90% alcohol/acetona 100%

1 hora 1 hora noche 1 hora 3 horas

La deshidratacin se hace de esta forma gradual para que no haya cambios bruscos que puedan alterar la estructura. El material todava no est preparado para la inclusin, primeramente es necesario hacer unos pases intermedios en xido de propileno. Este compuesto es un agente deshidratante muy fuerte que elimina los restos de alcohol que quedan dentro del

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MATERIAL Y MTODOS material y adems es un buen disolvente de la resina. Primero damos un pase de unos cinco minutos de mezcla alcohol/xido de propileno 1:1 de manera que el cambio no sea brusco, para despus pasar a xido puro durante treinta minutos.

Imbibicin- De igual manera que la deshidratacin tambin debe hacerse de forma gradual. Para ello y dependiendo de la resina, hacemos las mezclas: EPON - xido de propileno/Epn 1:1 ARALDITE- xido de propileno/Araldite 1:1 SPURR- xido de propileno/Spurr 1:1 45 minutos 45 minutos 45 minutos (opcional)

PREPARACIN DE LAS RESINAS: EPON: Mezcla A Mezcla B DMP-30 (acelerador) 40 gr 60 gr 1,8 gr

Mezcla A:

Epn Epikote 812

15,5 gr

Anhdrido dodecenil succinato (DDSA) 25 gr Mezcla B: Epn Epikote 812 Anhdrido Metil Ndico (MNA) 50 gr 44,5 gr

ARALDITE: MY 753 DDSA BDMA Dibutyphatalate 49 gr 49 gr 1,5 gr 2,7 gr

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MATERIAL Y MTODOS

SPURR: ERL 4206 DER 736 NSA S-1 2,23 gr 1,33 gr 6,30 gr 0,13 gr

Por ltimo mantenemos las muestras en resina pura durante un perodo de veinticuatro o cuarenta y ocho horas, dentro del frigorfico.

Inclusin- las muestras de dimensiones muy pequeas (de 1 a 2mm), se incluyen en resina la cual al polimerizar nos permite tener un material de mayor dureza y de mayor tamao lo cual facilita su manipulacin en el tallado y corte. Se realiza en cpsulas de gelatina o bien en moldes de silicona. Antes de la inclusin sometemos las muestras a una temperatura de 37oC durante dos horas. Introducimos las piezas en las cpsulas debidamente etiquetadas, las orientamos dentro de estas, finalmente rellenamos toda la cpsula de resina y mantenemos las piezas ya incluidas en estufa a 60oC durante cuarenta y ocho horas para que la resina polimerize. De todas las resinas utilizadas, la que menos problemas ha presentado es el Epn, en cuanto ha facilidad de corte y resistencia a los electrones. Precauciones: Dado el alto riesgo que presentan la mayora de los reactivos utilizados en la preparacin de muestras para microscopia electrnica, se aconseja tomar las medidas necesarias como son: trabajar siempre bajo campana extractora de gases, utilizacin de guantes y mascarilla y procurar que haya una buena ven-

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MATERIAL Y MTODOS tilacin en el laboratorio. Por otra parte es importante recoger los residuos y almacenarlos adecuadamente para ser eliminados como sustancias nocivas y no biodegradables que son.

3.2.3- TALLADO DE LA PIEZA, CORTE, RECOGIDA DE LAS SECCIONES Y TINCIN

Una vez polimerizada la resina procedemos al tallado de la pieza para facilitar la realizacin de las secciones. Este consiste en la formacin de una pirmide cuya base tiene la forma de un trapecio y contiene la muestra, en nuestro caso la antera. Los cortes se realizaron con un ultramicrotmo "Ultracut E" Reichert Jung. Para ello se utilizaron cuchillas de vidrio obtenidas con un ngulo de 45, sobre las que se prepara una pequea balsa de agua. Ocasionalmente tambin se utiliz cuchilla de diamante. Los cortes obtenidos quedan flotando sobre la balsa de donde son recogidos por contacto con la rejilla. Las rejillas son de cobre y generalmente de 400 orificios de malla, aunque en ocasiones se realizan tcnicas especficas que necesiten rejillas de caractersticas especiales (oro, platino o nquel) y con otro tamao de malla . Los cortes realizados suelen ser de un grosor de 60-80nm y de color plateado. La tincin de las rejillas para incrementar el contraste de los cortes, se hace con acetato de uranilo y citrato de plomo, segn describe Reynold (1963). En una placa de porcelana y con cuidado de mantener total oscuridad ponemos las rejillas sobre una gota de acetato de uranilo al 5% en agua destilada. Mantenemos la

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MATERIAL Y MTODOS rejilla en esta solucin durante veinticinco minutos. Posteriormente lavamos durante cinco minutos en agua destilada, la cual cambiamos varias veces. Una vez secas las rejillas procedemos a la segunda fase de esta tincin. Esta se debe realizar en un ambiente alcalino para evitar la presencia de CO2 el cual provoca la precipitacin del plomo. Para ello ponemos las rejillas sobre unas gotas de citrato de plomo dentro de una caja de Petri y rodeadas de lentejas de sosa. Mantenemos los cortes en esta solucin durante un perodo que puede variar entre cinco y diez minutos dependiendo de la edad de la solucin, necesitando ms tiempo conforme es ms vieja. Las rejillas se vuelven a lavar durante cinco minutos con agua destilada.

PREPARACIN DE LA SOLUCIN DE CITRATO DE PLOMO: en 25ml de agua bidestilada disolver (NO3)2Pb (nitrato de plomo) Citrato trisdico + 2 H2O 1,33 gr 1,67 gr

Agitar fuertemente durante un minuto y dejar reposar durante media hora. Aadir 8 ml de NaOH 1N. Completar hasta 50 ml con agua bidestilada.

3.2.4- ESTUDIO DE CORTES AL MICROSCOPIO PTICO Y MICROSCOPIO ELECTRNICO

A primera vista se determin el grado de desarrollo de la antera segn el tamao de la misma. Pero para conocer exactamente el estadio de desarrollo del grano de polen, se procedi a su observacin de cortes semifinos de 1 micra de espesor.

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MATERIAL Y MTODOS Para esta observacin se utiliz como colorante azul de metileno. Se utiliz un fotomicroscopio ptico Zeiss Standard equipado con una cmara modelo M35 y un exposmetro MC-63. Las rejillas con cortes ultrafinos se han observado en un microscopio electrnico de transmisin ZEISS modelo EM 10C.

3.2.5- DETERMINACIN DE POLISACRIDOS

3.2.5.1- TEST DEL CIDO PERIDICO-TIOSEMICARBACIDA-PROTEINATO DE PLATA (Thiery)

El test de Thiery (1967) es un procedimiento ya clsico en microscopia electrnica para la determinacin de polisacridos en especmenes biolgicos. Se trata de una adaptacin de la reaccin de Schiff para microscopia ptica. Con ella se produce el paso de los radicales alcohlicos (uniones 1,2-glicol existentes dentro de las molculas de los azcares) a radicales aldehdos libres mediante oxidacin utilizando el cido peridico. Los grupos aldehdos reaccionan con la tiosemicarbacida, la cual se puede visualizar hacindola reaccionar con una sal de elevado peso molecular como es el proteinato de plata, resultando como producto de la reaccin un precipitado electrodenso indicativo de la presencia de azcares. La ventaja de esta reaccin es que se hace sobre secciones ultrafinas ya recogidas en las rejillas, siendo as un procedimiento ms fcil y rpido que cuando la reaccin

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MATERIAL Y MTODOS se realiza en bloque. Tiene poco ruido de fondo por lo que se puede considerar como una reaccin bastante especfica. Sin embargo tiene el inconveniente de que no permite distinguir diferentes tipos de polisacridos entre s. Para realizar esta tcnica usamos muestras sometidas a un procesamiento convencional para microscopia electrnica, como la anteriormente citada, salvo que en este caso la fijacin se realiza slo con glutaraldehdo (en el caso de que la muestra elegida hubiese sido postfijada, el osmio se elimina incubando las rejillas con los cortes en una solucin de H2O2). Una vez obtenidas las secciones se recogen en rejillas que no sean de cobre y las sometemos al siguiente protocolo:

1- Incubacin de la rejilla sobre una gota de cido peridico al 1% durante aproximadamente veinte a treinta minutos. 2- Lavado en agua bidestilada mantenida en agitacin durante cinco minutos. 3- Mantener las rejillas sobre una gota de la solucin de tiosemicarbazida al 1% en cido actico al 10% durante 30 minutos. 4- Lavamos en diferentes soluciones: a) cido actico al 10% durante cinco minutos b) agua bidestilada cinco minutos. Ambos lavados se hacen en agitacin. 5- Las rejillas se incuban sobre una gota de proteinato de plata al 1% en agua destilada durante treinta minutos. Este ltimo paso se realiza totalmente en oscuridad para evitar la oxidacin de la solucin de plata por la luz. 6- Finalmente lavamos en agua bidestilada y en agitacin.

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MATERIAL Y MTODOS Control: omitir la solucin de tiosemicarbazida o la incubacin con cido peridico.

3.2.5.2- TCNICA DEL CIDO FOSFOTNGSTICO PARA LA LOCALIZACIN DE GLICOPROTEINAS Y POLISACRIDOS CIDOS

Esta tcnica ha sido utilizada por numerosos autores tanto en tejido animal (Pease 1966, 1970; Rambourg 1971; Marinozzi 1968), como en tejidos vegetales (Roland y col. 1973). Las muestras han sido procesadas de forma convencional (sin postfijacin) e incluidas en Epn. Se mantienen las rejillas durante dos horas sobre una gota de la solucin acuosa de cido fosfotngstico al 5% con pH=7 para ser finalmente lavadas en agua. Se pueden utilizar rejillas de cobre

3.2.6- TINCIN REGRESIVA DEL EDTA (cido Etilen-diamino-tetractico) PARA DETERMINACIN DE RIBONUCLEOPROTEINAS.

Utilizando esta tincin (Bernhard 1969) se tien de forma preferencial las ribonucleoprotenas, siendo aplicable en cortes que van a ser observados al microscopio electrnico. Para llevarla a cabo, las muestras son fijadas y procesadas siguiendo los mtodos convencionales, siendo la fijacin slo en glutaraldehdo al 3%. En la tincin habitual introducimos un paso nuevo manteniendo las rejillas en una solucin de EDTA. Los cortes son recogidos en rejillas de cobre y posterior-

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MATERIAL Y MTODOS mente se procesan de la manera siguiente: 1- Solucin de acetato de uranilo al 5% durante quince minutos. 2- Lavado en agua bidestilada en agitacin durante dos o tres minutos 3- Tincin con una solucin 0,2M de EDTA durante perodos que van de cinco a cuarenta y cinco minutos (en nuestro material el tiempo ptimo es de diez a quince minutos). 4- Lavado, de nuevo, en agua bidestilada. 5- Tincin con citrato de plomo durante cinco minutos. 6- Lavado en agua bidestilada y en agitacin durante dos o tres minutos. 7- Dejar secar la rejillas antes de su observacin.

PREPARACIN DE LA SOLUCIN DE EDTA 0,2M Aadimos 0,93 gr de EDTA a 10ml de agua bidestilada. Agitamos la solucin, a la cual vamos constantemente midiendo el pH. Aadimos gota a gota solucin de NaOH 1N de manera muy lenta hasta que el pH es aproximadamente 6,5. Agitamos durante unos cinco minutos de manera que la solucin se homogenice totalmente. Poco a poco aadimos gotas de la solucin de sosa hasta que el pH es de 7. Este paso es muy delicado por lo que hay que aadir la sosa en cantidades muy pequeas puesto que fcilmente el pH puede sufrir un cambio brusco.

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MATERIAL Y MTODOS 3.2.7- LOCALIZACIN DE ACTIVIDAD ENZIMTICA PEROXIDASA Y CATALASA.

3.2.7.1- TINCIN CITOQUMICA CON 3, 3-DIAMINOBENZIDINA (DAB)

En general, las catalasas y peroxidasas son enzimas responsables de la catlisis del perxido de hidrgeno hasta agua. Las catalasas actan produciendo la catlisis del perxido de hidrgeno hasta agua y oxgeno molecular sin la necesidad de otros donadores de electrones.

2H2O2

catalasa

2H2O + O2

Las peroxidasas catalizan la misma reaccin pero para ello necesitan utilizar otros donadores (H2X) de electrones diferentes al agua oxigenada.

H2X + H2O2

peroxidasa

2H2O + X

En estas reacciones citoqumicas el substrato DAB es oxidado en presencia de H2O2. Una vez la DAB ha sido oxidada y al unirse al tetrxido de osmio forma un precipitado denso a los electrones fcilmente visible a microscopia electrnica. Mediante la tcnica de la 3,3-diaminobenzidina (Mller y Beckman 1978) se quiere demostrar si existe actividad catalsica y/o peroxidasa en el citoplasma de los granos de polen maduro. El material es solamente prefijado en glutaraldehdo

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MATERIAL Y MTODOS al 3% en tampn fosfato 50mM pH=6,8 durante dos horas. Eliminamos el exceso de glutaraldehdo por medio de lavados con el mismo tampn. A partir de este momento las muestras seguirn tres procesamientos diferentes segn sean:

Muestras problema- incubacin con DAB ms H2O2 Control de peroxidasas (I)- incubacin en medio con DAB pero sin H2O2. Control de catalasa (II)- aadir al medio de incubacin (DAB ms H2O2) un inhibidor de la catalasa: 3-amino-1,2,4-triazol,(AT).

1- Las muestras son primeramente lavadas con tampn fosfato 50mM pH=6,8 durante treinta minutos. 2- Preincubamos el material de manera que: a- muestras problema y control I) son mantenidas en una solucin de DAB en tampn tris-ClH 50mM pH=9. A temperatura ambiente y durante una hora b- muestras control II) son mantenidas en DAB en tampn tris-ClH 50mM pH=9 con 50mM de AT. Temperatura ambiente y durante una hora. 3- Incubacin: a- problema: dos horas a 37oC en solucin de DAB ms H2O2 al 0,1% en tampn tris-ClH, pH=9 b- Control I) dos horas a 37oC en solucin de DAB en tampn tris-ClH, pH=9. c- Control II) dos horas a 37oC en solucin de DAB ms H2O2 al 0,1% ms AT 50mM en tampn tris-ClH, pH=9.

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MATERIAL Y MTODOS 4- Las muestras son lavadas en tampn fosfato 50mM durante media hora a temperatura ambiente. 5- Postfijacin con tetrxido de osmio al 1% en tampn fosfato 50mM. Continuamos con el procedimiento convencional de preparacin de muestras para microscopia electrnica. La inclusin se realiz en Epn.

3.2.7.2- TCNICAS DEL CERIO Cl3Ce

Estas tcnicas han sido anteriormente utilizadas en tejido animal (Arnold, G. y col. 1979, 1980; Angermller y col. 1986a,b). Realizamos esta citoqumica con objeto de comprobar si las enzimas oxidasas y catalasas se localizan en los mismos lugares. Las enzimas estudiadas han sido: - OH-oxidasa - D-amino oxidasa - Xantina oxidasa.

1- Fijacin: -OH oxidasa y D-aminoxidasa: cuatro horas en glutaraldehdo 3% en tampn cacodilato 0,1 M pH=7,4 con 0,25% de Cl2Ca y 1% de Sacarosa. - Xantina oxidasa: glutaraldehdo 2,5% en Pipes 0,1M pH=7,4 con 2% de sacarosa durante dos horas. 2- Lavado: en el mismo tampn utilizado en la fijacin durante tres perodos de veinte minutos cada uno.

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MATERIAL Y MTODOS 3- Preincubacin: - OH oxidasa y D-amino oxidasa: treinta minutos a 37oC en la solucin formada por: 0,1mM amino triazol (AT) ms 5mM CeCl3 en tampn tris maleato 0,1M pH=7. - Xantina oxidasa: treinta minutos a 37oC en tampn Pipes 0,1M pH=7,8 ms 3mM de CeCl3 y 100mM de NaN3. 4- Incubacin: - OH oxidasa: la misma solucin anterior pero en este caso le hemos aadido como sustrato cido valrico 50mM cido gliclico 50mM. Se realiza a una temperatura de 37oC y durante el tiempo de una hora. - D-amino oxidasa: a la solucin de 0,1mM AT ms 5mM CeCl3 con 50mM de D-Prolina en tampn tris maleato 0,1M pH=7,5 durante una hora a 37oC. - Xantina oxidasa: una hora a 37oC en una solucin igual a la anterior pero con adicin del substrato (xantina) en una concentracin de 0,1mM. 5- Lavados: tampn cacodilato 0,1M pH=6 durante veinte minutos para eliminar los restos de Ce(OH)3. -tampn cacodilato 0,1M pH=7,4 durante veinte minutos (noche). 6- Postfijacin e inclusin: segn los procedimientos convencionales.

Controles: -OH oxidasa: se incuban en un medio sin substrato (cido valrico, cido gliclico).

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MATERIAL Y MTODOS -D-amino oxidasa: no son sometidas a la incubacin con D-prolina (sustrato). - Xantina oxidasa: incubacin sin substrato (Xantina).

3.2.7.3- INMUNOLOCALIZACIN DE PEROXIDASAS

Con objeto de comprobar la presencia de enzimas peroxidsas en el grano de polen, hemos recurrido a tcnicas inmunocitoqumicas. Al no disponer de anticuerpos obtenidos por nosotros mismos, que seria lo ms recomendable, hemos recurrido a utilizar anticuerpos comerciales. slo hemos podido contar con un anticuerpo antiperoxidasa, no siendo posible la inmunolocalizacin de catalasas. Peroxidasa: Utilizamos un anticuerpo policlonal comercial antiperoxidasa (Sigma). El antisuero ha sido desarrollado en cabra usando peroxidasa de rbano como inmungeno. El marcado con oro se realiz con un segundo anticuerpo desarrollado en conejo contra inmunoglobulina de cabra y que se encuentra unido a partculas de oro coloidal de tamao de 10nm. Para evitar en lo ms posible el marcado inespecfico, utilizamos albmina de suero bovino (BSA) en concentraciones de 0,1%; 0,2%; 1%, diluida en fro en tampn PBS (Fosfato Buffer Salino) con 0,2% de Tween 20 (PBST). El protocolo seguido consta de los siguientes pasos: 1- Primeramente mantenemos las rejillas durante un minuto en agua bidestilada y filtrada con la finalidad de que se humedezcan. 2- Preincubacin durante una hora a temperatura ambiente en PBST pH=7,4 con 0,1% BSA.

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MATERIAL Y MTODOS 3- Incubacin con el primer anticuerpo (antiperoxidasa), diluido en tampn PBST con 0,1% de BSA, durante una hora a 37oC. Las diluciones utilizadas han sido : 1:1; 1:200; 1:1000; 1:2000. La concentracin inicial del anticuerpo puro es de 37,6 mg/ml. 4- Lavar a temperatura ambiente con objeto de eliminar los restos de anticuerpo que puedan existir en la rejilla. Para ello utilizamos tres soluciones de tampn PBS con concentraciones crecientes de BSA: a- lavado de treinta minutos en tampn PBS pH=7,4 b- Tres lavados de quince minutos en tampn PBS con 0,2% de BSA. c- Dos lavados de cinco minutos en tampn PBS pH=7,4 con 1% de BSA. 5- Incubacin con el segundo anticuerpo marcado con oro coloidal. Este anticuerpo se diluye igualmente en PBST con 1% de BSA. Las diluciones probadas son: 1/10; 1/9; 1/50. La incubacin se realiza durante una hora a una temperatura de 37oC. 6- Lavar para arrastrar todos los restos que quedan de este segundo anticuerpo. Los lavados se realizan con el mismo tampn PBS con distintas concentraciones de BSA: a- Seis lavados de cinco minutos en PBST pH=7,4 con 0,2% de BSA b- Seis lavados de cinco minutos en PBS pH=7,4 c- Un lavado de cinco minutos en agua bidestilada y filtrada.

7- Contrastar las rejillas con acetato de uranilo al 5% durante veinte minutos y con citrato de plomo cinco minutos.

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MATERIAL Y MTODOS Esta tcnica se realiza sobre cortes recogidos en rejillas de Nquel.

Controles: 1- Para controlar la especificidad del primer anticuerpo se sustituye este por suero preinmune. 2- Para controlar la especificidad del segundo anticuerpo se omite la incubacin con el primer anticuerpo y se mantienen en tampn PBST con 0,1% de BSA. 3- La comprobacin de la existencia de marcaje en otros tejidos de la antera nos puede dar idea del grado de especificidad del primer anticuerpo.

PREPARACIN DEL TAMPN PBS: a 900 ml de agua bidestilada y filtrada aadir: - 1,85 gr de Na2HPO4.2H2O - 0,43 gr de KH2PO4 - 7,2 gr de ClNa - Disolver mediante agitacin. Ajustar pH=7,4 con ClH 1N NaOH 1N. Enrasar hasta 1000ml.

3.2.8- ESTUDIO DE ELEMENTOS INORGNICOS EN LA PARED DEL POLEN

3.2.8.1- TCNICA DEL PIROANTIMONIATO POTSICO

Esta tcnica es utilizada para la deteccin de cationes inorgnicos del tipo de K+, Ca++, Na+ y cationes orgnicos como es el -NH3 (Clark y Ackerman 1971). El

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MATERIAL Y MTODOS resultado es la aparicin de un precipitado en la zona donde se encuentra alguno de estos cationes. Es una tcnica genrica ya que no nos sirve para identificar la naturaleza de los diferentes tipos de cationes existentes, siendo necesario recurrir al microanlisis de rayos-X para identificar los elementos presentes en la muestra.

Fijacin durante dos horas en una solucin de piroantimoniato-Osmio al 1%.

PREPARACIN DE LA SOLUCIN FIJADORA: tomar 10ml de una solucin de piroantimoniato potsico al 5% en agua (0,1M) calentar hasta ebullicin para que se disuelva. Aadir agua hasta restaurar el volumen inicial de la solucin de piroantimoniato. Tomar 10ml de una solucin de tetrxido de osmio al 2% en agua. Mezclar ambos volmenes. Ajustar pH=7,5.

Lavado de las muestras en una solucin de sacarosa al 6% dando tres pases de veinte minutos. Deshidratacin en series de alcoholes. Imbibicin e inclusin en resina siguiendo el mtodo convencional. Inclusin en EPON.

3.2.8.2- PREPARACIN DE MUESTRAS PARA MICROANLISIS DE RAYOS X AL MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDO

Para esta tcnica utilizamos material fijado de dos formas diferentes: -Fijacin qumica con glutaraldehdo al 3% y manteniendo posteriormente

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MATERIAL Y MTODOS las piezas en tampn hasta que vayan a ser utilizadas. -Fijacin Fsica por introduccin del material vegetal directamente en nitrgeno lquido.

El material fijado por mtodos qumicos y mantenido en tampn cacodilato hasta un da antes de su observacin, en el que se procede a su deshidratacin. La deshidratacin se realiza con series graduales de acetonas (30%, 50%, 70%, 90%) durante un tiempo de treinta minutos cada una. Posteriormente se mantiene durante una hora en acetona pura. Una vez terminada la deshidratacin, las muestras se pasan por acetato de amilo durante un tiempo que puede variar desde diez minutos hasta un da, aunque normalmente se mantuvo durante media hora. Para finalizar el proceso el material es sometido al punto crtico (procedimiento en el que el material se mantiene en una atmsfera de CO2 con una presin y temperatura adecuadas para que el CO2 est en estado lquido. Con este paso realizamos la extraccin de los restos de agua que quedan en el tejido). Las muestras fijadas por mtodos fsicos son adheridos al portamuestras de carbn mediante grafito coloidal y posteriormente sometidas durante cuarenta y ocho horas a una desecacin en fro o "freeze-dryer" (cuyo fundamento es el mismo que el del punto crtico). Finalmente las muestras son metalizadas con una fina capa de oro. El anlisis se realiz con un microscopio electrnico de barrido PHILIPS 505 dotado de un analizador de energa dispersiva de Rayos X, utilizando una tensin de 18Kv.

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MATERIAL Y MTODOS

3.2.9- PASO DE MATERIAL A TRAVS DE PAREDES CELULARES

3.2.9.1- TCNICA DEL NITRATO DE LANTANO COMO ELEMENTO TRAZA

Esta tcnica fue utilizada por

Revel y Karnovsky para detectar superficies

celulares y posibles vas de paso de sustancias hacia el interior de la clula. Para ello se aade al fijador un elemento traza como es el nitrato de lantano el cual debido a su elevado peso molecular aparece como un precipitado electrodenso. El protocolo a seguir es: Fijacin en una solucin de glutaraldehdo 3% con 1% de nitrato de lantano en tampn cacodilato 0,025M, pH=6,8, durante cuatro horas. Lavado en tampn cacodilato 0,025M dando tres pases de veinte minutos cada uno. Postfijacin en una solucin de tetrxido de osmio al 1% ms 1% de nitrato de lantano en tampn cacodilato 0,025M, pH=6,9, durante dos horas. Lavado en el mismo tampn durante tres pases de veinte minutos cada uno. Deshidratacin en series de alcoholes siguiendo el mtodo convencional. Imbibicin e Inclusin en resina Epn siguiendo igualmente el mtodo convencional.

PREPARACIN DEL FIJADOR:

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MATERIAL Y MTODOS
Tomar 1ml de gutaraldehido 25% y aadir 9ml de tampn cacodilato 0,025M. A estos 10ml agregar 0,1 gr de nitrato de lantano.

PREPARACIN DEL POSTFIJADOR: Tomar 0,1gr de tetrxido de osmio aadir 10ml de tampn tenemos as una solucin de tetrxido de osmio al 1%. A esta solucin aadir 0,1gr de nitrato de lantano.

3.2.9.2- INCORPORACIN DEL LANTANO AL MEDIO CULTIVO DE GRANOS DE POLEN.

En el caso de polen maduro, se pens en incorporar el elemento traza en un medio de cultivo apropiado. El material utilizado para esta experiencia fueron anteras de tomate Lycopercicum esculentum de un tamao aproximado de 8mm. Esta anteras contenan polen en el estadio de polen bicelular maduro. Como medio de cultivo se utilizaron dos medios diferentes: - MR26 (Benito Moreno y col. 1988) - GK (Benito Moreno y col. 1988)

MEDIO MR26

- Macroelementos del medio Murashige y Skoog - Microelementos del medio Murashige y Skoog - Glutamina 44mg

10ml 100l

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MATERIAL Y MTODOS - Inositol - Agua de coco - Lactoalbmina hidrosalato - Sacarosa El volumen final es de 100ml, pH=7. 10mg 2ml 100mg 17,12gr

nota: la composicin de macro y micro elementos de Murashige y Skoog se encuentra en el apartado de cultivo "in vitro" de anteras.

MEDIO GK

- H3BO3 - Ca(NO3)2.4H2O2 - MgSO4.7H2O2 - KNO3 - Sacarosa

200 300 200 100 1000

Las cantidades estn expresadas en mg/l, pH=5,9.

Una vez preparado el medio donde se va a realizar el cultivo, se aadi el nitrato de lantano (antes de medir el pH) en una concentracin del 1%. Las anteras fueron diseccionadas de la flor y cortadas en varias partes. Se cultivaron aproximadamente 10 anteras por cada 2ml de medio. Una vez que las anteras se encontraban en el medio fueron aplastadas con ayuda de una varilla de vidrio de manera que el polen quede suelto. Posteriormente fueron centrifugadas

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MATERIAL Y MTODOS a 4000rpm durante dos minutos y separamos los restos de antera quedando slo el polen suelto. El tiempo que se mantuvo el polen en cultivo fue variable, siendo de una, dos, tres, cuatro y dieciocho horas. Se mantuvieron a 25oC y en oscuridad. Una vez transcurrido el tiempo de cultivo el polen fue centrifugado, eliminamos el sobrenadante y aadimos glutaraldehdo al 3% en tampn cacodilato 0,025M, pH=6,9. El polen se fij durante cuatro horas. Posteriormente el material fue incluido en agar para continuar con la postfijacin, deshidratacin e inclusin en EPON. Control: se realizaron cultivos de polen con los mismos tiempos pero en un medio que no contena nitrato de lantano. El material fue observado primeramente sin ningn tipo de tincin y ms tarde con tincin uranilo-plomo.

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RESULTADOS

Captulo 4: Resultados

4.1- CULTIVO DE ANTERAS in vitro

En experiencias realizadas con objeto de poner a punto la metodologa para la obtencin de haploides se realizaron experiencias con anteras de tomate Lycopersicum esculentum Miller. A la hora de realizar un cultivo hay que tener en cuenta una serie de factores, como pueden ser: genotipo, variedad y especie del donador adems de las condiciones de crecimiento del individuo donador (temperatura, luz). Los medios utilizados fueron dos: DBM y MS. Las concentraciones ptimas de hormonas fueron: 2mg/l NAA y 5 1mg/l de kinetina. Las anteras seleccionadas para el cultivo fueron variables en tamao y estadio.

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RESULTADOS Como es sabido, existe una relacin entre tamao y estadio de desarrollo de la microspora. Aquellos brotes menores de 4mm contenan anteras de unos 2mm y en estadios de CMP. Las anteras de brotes mayores de 6mm y de flores abiertas se encontraban en estadio de grano de polen. El tamao y estadio ptimo en el que nosotros hemos conseguido resultados ha sido el de anteras de 3-4mm las cuales contenan microsporas. Estos resultados se obtuvieron, despus de una semana en cultivo, pudindose observar las primeras diferencias: las anteras sufren un cambio de color volvindose ms claras. Al cabo de cuatro o cinco das, las anteras se hinchan (Lam. 3a) aumentando de tamao hasta que la pared de la antera se rompe del todo y deja al descubierto una masa blanquecina que corresponde al callo (Lam. 3b). El resto de la antera se vuelve de un color marrn y acaba muriendo, mientras que el callo contina creciendo (Lam. 3c). En algunas ocasiones la estructura (o callo) formada ha sido diferente a las dems, observndose en la antera una masa de apariencia arrosetada (Lam. 3d), resultado de la agrupacin de estructuras o masas globulares. Estas estructuras globosas han sido separadas entre s y se han cultivado aisladas con objeto de inducir diferenciacin. Las condiciones de cultivo fueron de luz y a 25oC, reduciendo la concentracin de hormonas, de 2mg/l a 0,1mg/l de NAA y no se aadi kinetina. El resultado final no fue el esperado, puesto que se produjo la muerte del tejido (callo) antes de que se presentara algn cambio aparente. Por otro lado, tambin intentamos inducir diferenciacin a partir de los callos iniciales y de apariencia amorfa. Una vez transcurrido un perodo de ocho semanas, los hemos cambiado de medio, el cual tiene los mismos componentes

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RESULTADOS minerales solo que hemos reducido la dosis de hormonas de 1mg/l a 0,1mg/l de NAA y hemos eliminado la kinetina. Paralelamente se cambiaron las condiciones del cultivo siendo estas de 25oC y luz con un fotoperodo de 16 horas. Como resultado de este cambio observamos un aumento de tamao del callo y lo ms patente ha sido un cambio de color: al principio el callo se vuelve marrn oscuro para luego empezar a hacerse ms claro (Lam. 3e), hasta que finalmente empezaron a aparecer zonas de color verde. Podemos concluir que hemos obtenido callos utilizando ambos medios, pero sin llegar a conseguir embrioides. Sin embargo los callos obtenidos con el medio MS (Lam. 3f) se han desarrollado ms y mejor que los obtenidos con el medio DBM. Durante un ao se llevaron a cabo estas experiencias, sin llegar a conseguir ningn resultado positivo en la obtencin de embrioides, por lo que nos pareci oportuno dirigir nuestro esfuerzo a profundizar en el conocimiento de los caractersticas celulares del polen durante su formacin.

4.2- ESTUDIO DE LA ORGANIZACIN CELULAR DEL GRANO DE POLEN DURANTE SU FORMACIN

4.2.1- CARACTERES GENERALES

La floracin del tomate, en las condiciones naturales de nuestra regin, abarca desde el mes de Junio hasta finales de Septiembre. Incluso si la temperatura no es

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RESULTADOS demasiado baja, podemos encontrar fcilmente flores en los meses de OctubreNoviembre. El tamao del botn floral varia mucho durante su desarrollo. Los estadios de tetradas se localizan en brotes de 3 mm, los cuales contienen anteras de unos 2 mm de longitud, mientras que el polen maduro se encuentra en brotes de 7-8 mm, incluso llegando a alcanzar hasta 1 cm, con lo que las anteras ya son de un tamao considerable. Dentro de la misma inflorescencia no hay sincrona en cuanto al grado de desarrollo de las flores, de manera que en una misma inflorescencia podemos encontrar brotes de estadios diferentes. Incluso dentro de una misma flor tampoco se puede hablar de sincrona, aunque esta s existe dentro de una misma antera. El estadio de tetradas, al igual que el polen binucleado medio son difciles de encontrar lo cual nos sugiere que deben darse en un tiempo relativamente corto. Por el contrario son ms fciles de conseguir y por tanto de mayor duracin, los estadios de polen bicelular con almidn y maduro. Por otra parte al ser el tomate una planta de polinizacin zofila, el polen permanece ntimamente adherido a la antera hasta que es trasladado por el animal, por lo que siempre encontramos polen dentro de las anteras en mayor o menor cantidad. Esta fuerte adherencia que muestra el polen hace que sea difcil de obtener aislado.

4.2.2- FASES EN LAS QUE SE DIVIDE

Como resultado de nuestros estudios hemos divido el desarrollo y maduracin del

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RESULTADOS grano de polen, en dos partes principales: Microspora y Grano de polen. Las Microsporas son las clulas haploides procedentes de la divisin meitica sufrida por las clulas madres del polen (CMP) diploides. Durante este perodo estas microsporas se preparan a travs de una larga interfase para la divisin asimtrica que dar lugar al grano de polen propiamente dicho (Lam. 4a, b, c). Para facilitar su estudio subdividimos este perodo en varios estadios: - Tetradas - Microspora joven recin liberada - Microspora media - Microspora vacuolada

Grano de polen: es el resultado de la mitosis asimtrica sufrida por la microspora. Durante su desarrollo tienen lugar diferentes cambios, todos ellos encaminados a su maduracin (Lam. 4d, e, f), de manera que podemos distinguir: - Grano Bicelular joven - Grano Bicelular medio - Grano Bicelular maduro

4.2.2.1- TETRADAS

Una vez terminada la meiosis, las cuatro microsporas resultantes se mantienen agrupadas por la pared de calosa formando una Tetrada (Lam. 5a). En secciones

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RESULTADOS de tetradas del tomate, al igual que ocurre en el resto de las dicotiledneas con divisin meitica simultnea, slo nos es posible observar tres de las cuatro microsporas, ya que siempre hay una situada en otro plano. En esta fase ya se inicia la formacin de la pared del grano, perfilndose los elementos estructurales de la exina.

Citoplasma La joven microspora de una tetrada presenta un citoplasma propio de una clula poco diferenciada. El citoplasma contiene orgnulos poco diferenciados y presenta una poblacin ribosmica relativamente baja si la comparamos con estadios ms avanzados (Lam. 5b). Los ribosomas pueden agruparse formando polisomas preferencialmente junto al plasmalema (Lam. 6b). Esto ocurre de manera notable en las primeras fases de la formacin de exina. Tambin se observan bandas de microtbulos muy cercanos al ncleo (Lam. 6b). Los Plastos son fcilmente reconocibles por su forma ameboide y estroma muy denso, aunque no presentan ninguna estructura propia de plastidios diferenciados. Es frecuente la presencia de grnulos de material muy denso a los electrones en el estroma (Lam. 6a,b). Las Mitocondrias de secciones redondeadas y tamao muy inferior al de los plastos, presentan crestas largas y delgadas muy bien definidas (Lam. 6c). Es de destacar que ciertas mitocondrias muestran signos de degradacin desapareciendo sus crestas y mostrando de forma gradual zonas ms claras en su matriz (Lam. 6b, c).

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RESULTADOS El sistema de membrana, constituido por retculo y dictiosomas est escasamente representado. El retculo endoplsmico (RE) se encuentra en forma de cisternas muy cortas con ribosomas adosados a sus membranas. Los dictiosomas, poco numerosos, presentan de cuatro a cinco cisternas cortas y muy delgadas, con pocas vesculas en sus extremos, lo que indica una baja actividad (Lam. 6a). Tambin se observan vesculas de tamao anlogo al de las mitocondrias y de contenido translcido a los electrones, con inclusiones de material denso en su interior (Lam. 6a, b, c).

Pared Al inicio de este estadio, el plasmalema de la microspora aparece en contacto directo con la pared de calosa. Conforme avanza la tetrada observamos los primeros depsitos de la primexina entre el plasmalema y la pared de calosa (Lam. 7b). Se trata de una capa muy delgada en la que se deposita un material denso (Lam. 7b, c, d) de aspecto y densidad similares al que observamos inmerso en la pared de calosa (Lam. 7b, d). Nos ha llamado la atencin en esta fase la acumulacin perifrica de polisomas que forman a modo de una banda paralela al plasmalema (Lam. 7b, c, d). Estos polirribosomas determinan el lugar donde, en disposicin perpendicular al plasmalema, se levantarn las procolumelas (probculas). En este estadio es cuando se delimitan las zonas de la pared en donde ms tarde se localizarn las regiones aperturales, las cuales se sitan justamente en aquellas zonas en las que falta la primexina (Lam. 7c). Tambin en este perodo quedan definidos las caractersticas estructurales de la exina del polen de

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RESULTADOS tomate: procolumelas de una altura extremadamente pequea, y el tectum que forma una continua y delgada capa dispuesta sobre las columelas y en contacto directo con la pared de calosa.

Ncleo Presenta las caractersticas de un ncleo interfsico con una o dos masas nucleolares (Lam. 6a). La cromatina se encuentra parcialmente condensada formando pequeas masas densas localizadas preferencialmente en la periferia del ncleo (Lam. 8a). En el citoplasma adyacente al ncleo observamos masas de material fibrilogranular denso de aspecto morfolgico similar al que presenta cierto material nuclear (Lam. 8a). A veces se observa una estrecha relacin entre este material y la cubierta nuclear. La presencia de poros en la cubierta nuclear es evidente (Lam. 8a). El nucleolo muestra caractersticas propias de una baja actividad. Esta constituido predominantemente por una masa de componente fibrilar denso (CFD) y con pocos centros fibrilares (CF), que pueden estar asociados a vacuola, ausencia de componente granular (CG). La regin organizadora nucleolar (NOR) es muy patente y relacionada estrechamente con la masa nucleolar (Lam. 6a; 8a, b). Tambin el nucleolo puede presentar un estructura tpica en forma de anillo con una gran vacuola central, que tiene grnulos en su interior (Lam. 8a, b). El nucleolo se encuentra desplazado lateralmente dentro del ncleo, pudiendo estar relacionado con la cubierta nucleolar a travs de la regin organizadora nucleolar (Lam. 6a).

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RESULTADOS 4.2.2.2- MICROSPORA JOVEN RECIN LIBERADA

Este perodo comienza con la liberacin de las microsporas en el lculo de la antera una vez que la pared de calosa ha desaparecido. La estructura de la exina ya se encuentra perfectamente consolidada (Lam. 9a)

Citoplasma Prcticamente no se observan diferencias entre el citoplasma de la joven microspora libre en el lculo con respecto al de tetradas, en cuanto a poblacin ribosmica, diferenciacin y distribucin de organelas se refiere (Lam. 9a, b). Dejan de observarse las bandas de microtbulos as como la distribucin perifrica de los ribosomas. El retculo endoplsmico rugoso (REr) incrementa ligeramente en cuanto al nmero y longitud de las cisternas, que con frecuencia pueden estar asociadas a los plastos (Lam. 9b, c). Merece la pena destacar el desarrollo que observamos del aparato de Golgi tanto en nmero de cisternas como en nmero de dictiosomas. Tambin se aprecia el inicio de su actividad secretora, reflejada en la presencia de pequeas vesculas en los extremos de los dictiosomas.

Pared La exina de la microspora recin liberada consta de los elementos bsicos de la ectexina: columelas cortas, que originan arcadas de dimensiones muy reducidas y tectum casi continuo con pequeas interrupciones que comunican las arcadas

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RESULTADOS con el exterior. En la parte externa del tectum ya se observan elementos ornamentales de forma globular o grnulos supratectales (Lam. 10a,b; 9a). A lo largo de este perodo se completa la estructura de la exina con la formacin de la endexina (Lam. 10b). No existe capa basal de manera que las bculas se encuentran desde el primer momento insertadas y en contacto directo con la endexina. Tal y como se observa al microscopio electrnico de barrido (MEB) el grano de polen de tomate presenta tres regiones aperturales de tipo colpo (definida como apertura de forma alargada, con una longitud al menos el doble que su anchura). La apertura se encuentra constreida en su zona ecuatorial por una estructura o "puente" de ectexina (Lam. 1a). Teniendo en cuenta estas caractersticas al realizar secciones del grano de polen de tomate podremos encontrar dos tipos diferentes de imagen: a) Cuando la seccin de la apertura es totalmente meridional (atravesando el puente de ectexina) la exina aparece como una zona ms abultada. La endexina se engruesa considerablemente mostrando forma de lente con estructuras lamelares esparcidas en su interior y denominada oncus de la exina (Lam. 10a). Este oncus se encuentra cubierto por ectexina, observndose con claridad los elementos estructurales de la exina (Lam. 10a). b) Cuando la seccin se realiza mas tangencial, atravesando la apertura solamente a nivel del colpo (sin pasar por el puente de ectexina de la zona ecuatorial) (Lam. 9a). En este caso la exina aparece ms delgada careciendo de ectexina, mientras que la endexina tiene mayor grosor que las zonas interaperturales. Dejan de observarse los elementos estructurales de la exina (Lam. 9a).

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RESULTADOS Ncleo La cromatina presenta un mayor grado de descondensacin que en tetradas (Lam. 9a). Contina observndose pequeas aglomeraciones de material, de caractersticas semejantes a las del material nuclear, situadas en el citoplasma adyacente al ncleo, en contacto con la cubierta nuclear (Lam. 9b). El nucleolo presenta un aspecto diferente al del estadio anterior, teniendo una morfologa ms laxa. Sigue constituido mayoritariamente por componente fibrilar denso (CFD) y algo de componente granular (CG). La gran vacuola que se observaba en tetradas ha desaparecido y ha dado lugar a numerosas vacuolas perifricas de menor tamao (Lam. 9b, 10c). Estas vacuolas suelen estar asociadas a centros fibrilares (CF), que ahora son ms numerosos (Lam. 10c).

4.2.2.3- MICROSPORA MEDIA

En este estadio se detecta un ligero incremento de la actividad citoplsmica y nuclear, as como una marcada diferenciacin entre las dos capas de la exina: ectexina y endexina (Lam. 11a). Todos estos cambios quedan reflejados en los siguientes apartados:

Citoplasma Se observa una mayor densidad citoplsmica consecuencia de un ligero aumento de ribosomas y orgnulos celulares. El aparato de Golgi muestra una mayor actividad reflejada en el nmero de dictiosomas, de cisternas (llegando a tener

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RESULTADOS hasta siete cisternas) y en la mayor secrecin de vesculas (Lam. 11b). Tambin comienza a observarse por el citoplasma algunos cuerpos osmifilos probablemente de naturaleza lipdica (Lam. 11a). Las mitocondrias aumentan ligeramente de tamao y presentan una forma ms ovoide con crestas algo ms hinchadas (Lam. 11b, c). En este citoplasma, existen compartimentos con un tamao comprendido entre vacuolas y vesculas (Lam. 11b, 12a) y que pueden presentar material fibrilar e inclusiones densas. Se encuentran por todo el citoplasma, pero preferentemente muy cercanos al plasmalema sugiriendo un vertido de su contenido hacia el exterior (Lam. 12d). Por otra parte debajo de las regiones aperturales, entre el plasmalema y la exina se encuentran unos espacios periplsmicos (Lam. 11a, 12d) de contenido semejante al de las "vesculas-vacuolas" las cuales, en ocasiones se observan fundiendo con el plasmalema (Lam. 12d). Aparentemente se podra pensar que son lugares de retraccin del plasmalema, pero la persistente localizacin de estos espacios debajo de las regiones aperturales, nos hace pensar que mas bien se trate de depsitos incipientes que contribuyen al desarrollo de la matriz de la regin apertural a nivel de la intina.

Pared La exina en este perodo termina de consolidarse, distinguindose ahora muy bien la ectexina de la endexina, debido a que presentan diferente afinidad en cuanto a su capacidad de tincin: la endexina aparece ms densa que la ectexina (Lam. 11a; 12b, c). Estas caractersticas tintoriales nos permiten apreciar como las

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RESULTADOS columelas se insertan directamente en la endexina (Lam. 12b, c) confirmndonos lo que ya intuamos en el estadio ms joven: la ausencia de una capa basal que sirva para unir a las columelas entre s. En la parte mas externa de la endexina se aprecian unas estructuras lamelares o "white line" semejantes a las que encontrbamos dentro del oncus de la exina de la joven microspora (Lam. 12c). Las columelas alcanzan un desarrollo, que aparentemente no cambia en estadios ms avanzados, siendo de dimensiones reducidas sobre todo en cuanto a su longitud. El tectum aumenta considerablemente en grosor, hacindose casi el doble que en el estadio joven. A simple vista es continuo (Lam. 12a), pero despus de una atenta observacin se detectan pequeas interrupciones o microcanales que comunican el diminuto espacio de las arcadas con el exterior (Lam. 12b). Dentro de las arcadas se aprecia un material fibrilar (Lam. 12a). Las diferencias de tincin entre endexina y ectexina se ponen de manifiesto mediante la tcnica del PTA (Lam. 29a, b). La ectexina no cambia, mientras la endexina aparece muy teida. Tambin es evidente la continuidad entre endexina y columelas, confirmando as la ausencia de capa basal (Lam. 29b). El material fibrilar que se encuentra entre las arcadas tambin muestra una mayor densidad electrnica debido a una mayor tincin, como consecuencia de la reaccin con el PTA (Lam. 29b). De igual manera se tien los grnulos supratectales que constituyen la ornamentacin de la exina (Lam. 29a, b), mostrando una apariencia y tincin similar a materiales que se encuentran en el lculo de la antera y que estn en relacin con los restos de tapetum (Lam. 29a). Todo ello nos indica la naturaleza polisacardica de endexina, ornamentacin y material de las

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RESULTADOS arcadas. En la regin apertural, el oncus de la exina, a partir de ahora pierde su forma tpica de lente aunque continua la presencia de estructuras lamelares. Debajo se encuentra una regin transparente a los electrones de forma tambin lenticular que probablemente corresponde al inicio del oncus de la intina (Lam. 12d).

Ncleo Este compartimento se hace ms grande, ocupando un mayor volumen celular. Se aprecia un ligero aumento del grado de condensacin de la cromatina (Lam. 13a). El nucleolo es ms difcil de localizar, probablemente debido al aumento de tamao nuclear que hace que disminuya la probabilidad de tener al nucleolo en la seccin que observamos. Este nucleolo presenta signos de gran actividad estando constituido por componente fibrilar denso (CFD) y componente granular (CG) entremezclados y un elevado nmero de centros fibrilares (CF) mas pequeos y asociados o no a vacuolas, las cuales tambin son menos frecuentes (Lam. 13b).

4.2.2.4- MICROSPORA VACUOLADA

Esta etapa lleva consigo la formacin de una gran vacuola que llega a ocupar una tercera parte del citoplasma de la microspora (Lam. 14a), lo cual contribuye a un incremento rpido del volumen celular y a una distribucin polarizada de sus componentes. La correcta identificacin de esta fase inicialmente puede representar

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RESULTADOS cierto grado de dificultad, ya que dependiendo del nivel al que hayamos realizado la seccin podremos ver la presencia o no de vacuola. Sin embargo una vez que se profundiza en su estudio y adquirimos esta dificultad desaparece, ya que existen otros parmetros, que nos aportan datos sobre el estadio de desarrollo del grano, como son grado de diferenciacin citoplsmica o el desarrollo de la pared celular especialmente a nivel de las aperturas.

Citoplasma La densidad ribosmica aumenta notablemente lo que hace difcil reconocer a primera vista la presencia de otros orgnulos (Lam. 14a). Las cisternas de REr son considerablemente ms largas que en fases ms tempranas y generalmente se encuentran independientes unas de otras, aunque ocasionalmente estn prximas entre s, formando grupos de tres o cuatro (Lam. 14c). El aparato de Golgi disminuye de forma espectacular. Se encuentran pequeas vacuolas que posiblemente funden entre si, ya que al final de este estadio solo observamos una gran vacuola, la cual ocupa gran parte del citoplasma y desplaza al ncleo lateralmente. La vacuola puede contener material fibrilar en su interior (Lam. 14a), el cual con la tincin de PTA aparece teido indicando su naturaleza polisacardica (Lam. 29c). Mediante inmunolocalizacin de peroxidasa se ha comprobado la presencia de esta enzima en el interior de la vacuola en relacin con este material fibrilar (Lam. 38). La existencia de cationes en la clula puede ser detectada mediante la tcnica del piroantimoniato gracias a la cual observamos un precipitado denso en relacin con el tonoplasto (Lam.

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RESULTADOS 31c). Hacia el final de este perodo se observan los primeros grnulos de almidn en los plastos y aumenta el nmero de cuerpos osmifilos. Las mitocondrias son de mayor tamao hacindose ms alargadas y adoptan una disposicin curiosa rodeando al ncleo (Lam. 14b)

Pared La pared a nivel de exina no experimenta grandes cambios. La intina comienza su formacin en las regiones interaperturales observndose, entre el plasmalema y la endexina, una capa transparente a los electrones con material fibrilar en su interior (Lam. 15b). En las zonas aperturales continua desarrollndose el oncus de la intina por las transformaciones que sufre el espacio periplsmico, situado debajo de las regiones aperturales, dando lugar a una estructura en forma de lente que comienza a "rellenarse" de material fibrilar (Lam. 15a).

Ncleo A lo largo de este estadio la cromatina experimenta una nueva descondensacin (Lam. 16a) para volver a condensarse finalmente antes de que tenga lugar la divisin (Lam. 16c). El nucleolo muestra un aspecto "trabecular" (Lam. 16b) debido a la presencia de una mayor cantidad de componente granular (CG) ya que est entremezclado con el componente fibrilar denso (CFD). Ya no se observa ninguna vacuola y los centros fibrilares (CF) son muy pequeos. En los momentos finales de esta fase el nucleolo disminuye de tamao y presenta un aspecto homogneo sin vacuolas

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RESULTADOS ni centros fibrilares (CF) y se encuentra de nuevo constituido mayoritariamente por componente fibrilar denso (CFD). En ocasiones se observa un cuerpo nuclear de aspecto similar al nucleolo, pero mucho ms pequeo y localizado en las proximidades del nucleolo o incluso en estrecha relacin con el (Lam. 16b, c).

4.2.2.5- GRANO BICELULAR JOVEN

Despus de la mitosis asimtrica de la microspora, las dos clulas recin formadas difieren en tamao y contenido. Aunque a primera vista el citoplasma del grano parece homogneo es fcil de distinguir la existencia de dos clulas gracias al tabique que las separa (Lam. 17a). La clula generativa se localiza en un extremo del grano y presenta inicialmente forma lenticular. Su pared es continua con la intina de la pared del grano (Lam. 18b), teniendo una naturaleza muy similar como se demuestra con los test realizados de PTA y Thiery, ya que ambos dan positivos a nivel de paredes (Lam. 29d; 30a, b, c, d). Mediante estas tinciones se prueba la presencia de componentes polisacardicos en la pared generativa y en la intina.

Citoplasmadel grano La caractersticas citoplsmicas del grano son muy similares a las de la microspora vacuolada. Los ribosomas se agrupan formando polirribosomas (Lam. 18b). La gran diferencia entre los citoplasma de la clula vegetativa y generativa es la

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RESULTADOS ausencia de plastidios y vacuolas en la clula generativa. Se nota un ligero incremento de granos de almidn en la clula vegetativa (Lam. 17a; 18b). La vacuola todava presente, se va reabsorviendo de forma gradual y termina por desaparecer (Lam. 18a).

Pared La nica caracterstica nueva que presenta la pared en este estadio se localiza a nivel de la regin apertural, puesto que se observan tubulaciones dentro del oncus de la intina. Esta estructuras tubulares se originan por invaginaciones o "dedos de guante" procedentes del citoplasma (Lam. 19a, b). Las membranas de estas tubulaciones dan positivas a la tincin del PTA (Lam. 30b) mientras la matriz del oncus da reaccin positiva a la tcnica de Thiery (Lam. 30c, e). El oncus de la exina continua mostrando el aspecto lenticular de estadios anteriores, extendindose sobre el oncus de la intina (Lam. 19a, b).

Ncleo Los ncleos vegetativo y generativo presentan caractersticas diferentes desde el principio, las cuales se van haciendo ms marcadas a lo largo de la maduracin. El ncleo vegetativo se localiza en una posicin central dentro del grano y tiene una forma redondeada (Lam. 17a), mientras el generativo se va adaptando a la forma que en cada momento presenta la clula generativa y que en esta fase es lenticular (Lam. 17a, 18b). Su tamao es relativamente grande si se tienen en cuenta el volumen total de la clula generativa.

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RESULTADOS La cromatina en ambos ncleos presenta un patrn diferente, estando bastante descondensada y solo con pequeas masas densas en la periferia del ncleo vegetativo (Lam. 17a; 20b; 27a, c), mientras que en el ncleo generativo el grado de condensacin es ligeramente mayor, formando masas de ms tamao adosadas a la cubierta nuclear (Lam. 17a; 18b; 20a). Las masas de cromatina y el material ribonucleoproteico fibrilo-granular, esparcido por el nucleoplasma, presentan las mismas propiedades de tincin con uraniloplomo (Lam. 27a). Por ello es difcil de distinguir si se trata de material ribonucleoproteico o de cromatina sin recurrir a la citoqumica. Como primera aproximacin utilizamos la tincin regresiva de EDTA (Berdnard 1969) con la que se tie de forma preferencial el material ribonucleoproteico. Gracias a esta tcnica nos es posible reconocer que son pocas las masas densas decoloradas correspondientes a masas de cromatina, mientras que es abundante el material fibrilogranular, de naturaleza ribonucleoproteica, que se tie en esta fase en el nucleoplasma, adems del nucleolo (Lam. 27b,c). Los nucleolos tambin muestran desde el principio una actividad diferente, reflejada en su tamao, componentes y en el nmero y organizacin de centros fibrilares. El nucleolo vegetativo tiene muchos y pequeos centros fibrilares (Lam. 20b), mientras que el nucleolo generativo solo muestra uno unido al organizador nucleolar (NOR) (Lam. 20a). Tambin tienen en comn la disposicin segregada de sus componentes granular y fibrilar (Lam. 27b, c), aunque la cantidad de componente granular es mayor en el nucleolo vegetativo que en el generativo. Utilizando la tcnica del piroantimoniato potsico se forma un precipitado grueso

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RESULTADOS en el componente fibrilar de ambos nucleolos, indicativo de la presencia de cationes inorgnicos como son Na+, Ca++, K+, (Lam. 31d).

4.2.2.6.- POLEN BICELULAR MEDIO

Este perodo se caracteriza por la forma esfrica de la clula generativa, la cual adquiere esta forma a medida que avanza en su desarrollo. La pared de esta clula generativa se va estrangulando hasta terminar independizndose de la intina, quedando la clula inmersa y completamente rodeada por el citoplasma vegetativo. Este estadio es fcil de identificar por la elevada cantidad de sustancias de reserva (almidn y cuerpos lipdicos) que presenta el citoplasma del grano. En cambio el citoplasma generativo no presenta variaciones respecto al estadio ms joven (Lam. 21a).

Citoplasma del grano El citoplasma tiene una elevada densidad a los electrones debido a la gran cantidad de ribosomas y orgnulos celulares en el presentes. Para visualizar las membranas de los diferentes compartimientos se hace necesario utilizar muestras fijadas slo con glutaraldehdo. Con la doble fijacin glutaraldehdo-osmio es difcil detectar dictiosomas, mitocondrias y otras membranas citoplsmicas. Cuando no tienen tetrxido de osmio, las membranas no se tien y resaltan mas sus perfiles translcidos a los electrones en un citoplasma que presenta un elevado contraste.

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RESULTADOS Plastos y mitocondrias experimentan un notable cambio en nmero y en estructura. A partir de ahora podemos hablar de amiloplastos debido a la gran cantidad de almidn que se detecta en ellos (Lam. 21a,b,d). Cuando sometemos este material a las tinciones de PTA y Thiery, el almidn muestra una fuerte reactividad apareciendo densamente teido. Sin embargo es posible encontrar granos de almidn que no se tien por igual, debido a que esta sustancia de reserva no es homognea, presentando diferentes grados de sntesis o degradacin de los azcares que la constituyen. Las mitocondrias son ms numerosas y de una menor longitud, presentando una forma ovoide y sus crestas son largas, llegando a alcanzar una longitud igual al dimetro de la organela (Lam. 21c). Los grupos de REr se hacen ms frecuentes aumentando el nmero de cisternas que los integran y llamando la atencin su localizacin alrededor de la clula generativa (Lam. 22d). El aparato de Golgi vuelve a ser visible observndose dictiosomas en nmero de cinco o seis y numerosas vesculas muy diminutas en sus proximidades (Lam. 21c). Tambin aumentan los cuerpos osmifilos de manera notable. Es interesante destacar la polaridad que se observa en la distribucin de los amiloplastos y cuerpos lipdicos. Posiblemente esta polarizacin, tambin ocurre con otras organelas pero pasa desapercibida debido a sus caractersticas menos llamativas. Debido a esta polarizacin y dependiendo del nivel en el que se haya realizado la seccin, la imagen que obtenemos es variable en cuanto a la relacin existente entre almidn y cuerpos osmifilos (Lam. 21 a,d).

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RESULTADOS Pared La pared del grano se puede decir que ya est totalmente formada, con las tres capas perfectamente definidas: ectexina, endexina e intina (Lam. 22a). La intina muestra una fuerte reaccin con la tcnica del PTA (Lam. 29e). La ornamentacin externa de la exina es menos marcada que en estadios jvenes (Lam. 22a), convirtindose los grnulos supratectales en pequeos picos. Esto es debido a la sedimentacin sobre la pared de nuevo material que probablemente proceda del tapetum. Mediante la tcnica del piroantimoniato encontramos dos tipos diferentes de precipitado, uno fino y otro grueso, tanto en la superficie de la exina como en las arcadas (Lam. 31a), y en la regin apertural a nivel del oncus de la exina (Lam. 31b). Los diferentes tipos de precipitado responden a la presencia de distintos tipos de cationes (Na+. Ca++, K+). Para conocer la naturaleza de estos cationes se recurri al microanlisis de rayos X. Gracias a esta tcnica nos ha sido posible aproximarnos a la naturaleza de los cationes inorgnicos existentes en la pared del polen. Los elementos detectados son P, S, Cl, K, Ca. En un principio se intent diferenciar entre la zona apertural y la interapertural. Sin embargo las diferencias encontradas, entre los elementos detectados, no eran consistentes, ya que haba diferencias incluso dentro de una misma regin. Por ello se ha considerado la pared como un todo y se realizaron medidas al azar sin diferenciar zonas entre s. Como resultado podemos indicar que el P es el elemento ms abundante seguido por el S y el Ca. Los otros dos elementos (Cl, K) se encuentran en cantidades bastante pequeas y muy similares

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RESULTADOS entre s. Merece destacar las diferencia encontradas segn el mtodo de fijacin utilizado, las cuales son ms significativas en el caso del K y Ca (Esquema IV), aunque hay que tener en cuenta que la fijacin qumica produce una adicin de elementos sobre las cantidades ya existentes.

Ncleo El ncleo vegetativo llega a alcanzar el mayor grado de descondensacin de la cromatina, no observndose prcticamente masas de cromatina (Lam. 22b; 28a). El nucleoplasma tiene una elevada cantidad de material fibrilogranular encontrndose tambin, grnulos densos y agrupados dentro del nucleolo (Lam. 22b). El nucleolo de gran volumen presentando centros fibrilares pequeos homogneos y con el componente granular parcialmente (CG) en la periferia, ndice de cierto grado de segregacin (Lam. 22b,c). No es frecuente, pero, puede tener una vacuola de pequeo tamao y central (Lam. 22c). El ncleo generativo va perdiendo su forma redondeada y va hacindose paulatinamente ms ovoide a medida que lo hace la clula. La condensacin de la cromatina se va extendiendo, desde la periferia hacia dentro (Lam. 22d; 28d). En los primeros momentos de este periodo el nucleolo se va reduciendo de tamao pasando a ser una pequea masa constituida slo por material fibrilar. Posteriormente este nucleolo llega a desaparecer. Mediante la tcnica del EDTA se verifica el alto grado de condensacin de la cromatina en la clula generativa, frente a la prcticamente descondensacin de la cromatina del ncleo vegetativo (Lam. 28a, b).

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RESULTADOS

ESQUEMA IV: Microanlisis de rayos-X- Observar la diferencias entre ambos tipos de fijacin.

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RESULTADOS

4.2.2.7- POLEN BICELULAR MADURO

En este estadio el grano de polen se puede considerar maduro y preparado para poder germinar, siempre que se encuentre con el medio apropiado y las condiciones ptimas de germinacin. Justo antes de la dehiscencia de las anteras, la regin apertural por donde va a germinar el tubo polnico se abulta notablemente. El citoplasma del grano cuenta con la infraestructura necesaria para el rpido crecimiento del tubo polnico y la clula generativa est lista para dividirse y dar lugar a las dos clulas gamticas (Lam. 23a). En este perodo la clula generativa tiene forma muy alargada y una pared celular altamente lobulada (Lam. 24a). Se localiza muy cerca de la apertura por donde saldr a travs del tubo polnico.

Citoplasma La densidad de orgnulos en el citoplasma de la clula vegetativa continua siendo muy notable. Los cuerpos osmifilos o lipdicos son muy abundantes y se encuentran distribuidos por todo el citoplasma. Estos cuerpos aparecen como glbulos densos a los electrones cuando se trata de piezas con osmio, sin embargo cuando el material ha sido fijado solamente con glutaraldehdo, se muestran translcidos a los electrones (Lam. 23e). Generalmente se encuentran rodeados por una, a veces dos, cisternas de REr (Lam. 23e). En la tincin con piroantimoniato se observa la presencia de precipitado fino claramente localizado a nivel de los cuerpos

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RESULTADOS osmifilos (Lam. 31e). En un estadio ms avanzado de la madurez del grano disminuye el nmero de cuerpos osmifilos y el citoplasma se encuentra ocupado por gran cantidad de vesculas con formas y tamaos variables. (Lam. 23a). En ocasiones estas vesculas pueden contener material diverso en su interior, a veces de naturaleza fibrilar. Las mitocondrias alcanzan su mxima representacin en este perodo, encontrndose esparcidas por todo el citoplasma, siendo ms notable su concentracin a nivel de las aperturas. Sus caracteres morfolgicos son anlogos a los ya mencionados en el estadio anterior (Lam. 23b). En muchas de ellas se detecta en su matriz zonas ms claras (Lam. 23d), que incluso llegan a ocupar toda la mitocondria pudiendo transformarse en vesculas. Se reconoce el origen mitocondrial de estas vesculas por su tamao y forma, por contener restos de crestas en su interior (Lam. 23d, 24a) e incluso a veces, por poder observarse doble membrana. Otra caracterstica importante a tener en cuenta al hablar de polen maduro es la ausencia de almidn en los plastos (Lam. 23b), producindose por tanto una desdiferenciacin de los mismos. Estos ahora son ms difciles de identificar al perder su carcter ms llamativo como es el almidn. Son de gran tamao, ovoides y con un estroma homogneo. El REr adquiere unas dimensiones y distribucin espectaculares (Lam. 23a; 24a, b) siendo de sealar la elevada tincin que presentan sus ribosomas. Las cisternas de retculo rugoso proliferan enormemente y forman agrupaciones que cuentan con un nmero elevado de cisternas (Lam. 24b) las cuales suelen estar en estrecha relacin con los cuerpos lipdicos (Lam. 23e). Adems es fcil de observar como

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RESULTADOS grupos de cisternas de RE continan localizndose alrededor de la clula generativa (Lam. 23b). Progresivamente las cisternas de van dilatando. En este caso ya no suelen ser tan largas sino que se fragmentan dando vesculas en sus extremos (Lam. 24b). Tambin encontramos cisternas de REr en la periferia del citoplasma, dispuestas de forma paralela al plasmalema. En este caso se pierden los ribosomas de la membrana adyacente al plasmalema (Lam. 25a). El aparato de Golgi continua siendo muy activo, aunque a primera vista pasa desapercibido debido al gran nmero de orgnulos del citoplasma y a la pequea dimensin de dictiosomas y vesculas, las cuales son especialmente diminutas (Lam. 25b).

Pared Como ya se ha indicado, la pared del grano ya qued consolidada previamente. En cambio la regin apertural es ahora cuando se puede decir que su estructura est completa y preparada para la germinacin. Se observa una protuberancia del oncus de la intina cuya superficie externa carece de exina (ectexina y endexina) (Lam. 26a, b). Dentro del oncus de la intina se encuentra tubulaciones dilatadas llenas de un material denso. Las tubulaciones mayoritariamente localizadas en el pice, ya no tienen contacto con el plasmalema quedando separadas de este por una capa de material de la intina (Lam. 26a).

Ncleo Lo ms notable del ncleo vegetativo es la prdida de su forma esfrica pasando a tener un aspecto irregular. Por ello en una misma seccin es posible encontrar

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RESULTADOS dos compartimentos nucleares como consecuencia del alto grado de lobulacin (Lam. 25d). De nuevo se observan masas de cromatina condensada en la periferia y en contacto con la cubierta nuclear y que progresivamente se extiende por todo el ncleo. El nucleoplasma presenta una matriz griscea densidad electrnica semejante a la del ncleo vegetativo (Lam. 25c). Son frecuente abundantes las agrupaciones de material fibrilo-granular en este nucleoplasma. El nucleolo llega a desaparecer, observndose raramente un pequeo cuerpo nucleolar constituido por el componente fibrilar denso (CFD). El ncleo generativo tiene la misma forma alargada de la clula generativa. En los cortes aparece ms frecuentemente con forma ovoide o esfrica debido a que existe una mayor probabilidad de encontrar cortes transversales que longitudinales. El ncleo presenta la mxima condensacin de la cromatina ocupando un volumen anlogo al resto del nucleoplasma, el cual presenta una matriz griscea muy homognea, completamente diferente a la de un ncleo activo (Lam. 25d). El material ribonucleoproteco en el nucleolo se ha puesto de manifiesto mediante el uso de la tincin con EDTA (Lam. 28a, b, c, d).

4.3- PASO DE MATERIALES A TRAVS DE LA PARED DEL POLEN

La pared del polen maduro, como ya se ha indicado, presenta unas caractersticas especiales que protegen y aslan al grano del exterior. Sin embargo el grano, tanto cuando todava se encuentra dentro de la antera como tras la dehiscencia de la

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RESULTADOS antera, toma sustancias y agua del medio que le rodea. La pared aparentemente forma una barrera slida que impide el paso de sustancias. Con objeto de conocer si realmente existen lugares de paso a travs de ella, se ha utilizado nitrato de lantano como elemento traza que nos permita localizar las posibles rutas de comunicacin entre el grano y su entorno. Para ello se ha utilizado polen aun dentro de la antera y polen suelto que se ha mantenido en diferentes medios de cultivo (medio para germinacin y medio para maduracin). En el primer caso, se fij la antera con una solucin fijadora que contena nitrato de lantano. En el segundo caso el nitrato de lantano se incorpor al medio de cultivo y al cabo de un cierto tiempo se fij el polen (se tomaron muestras despus de diferentes tiempos en los medios de cultivo). En ambos casos se detecta precipitado de lantano, tanto a nivel de la pared como en el citoplasma, lo que indica que efectivamente el paso de sustancias desde el exterior hacia el grano es una realidad. Nuestro estudio se centr en granos en los que la pared ya estaba totalmente desarrollada. Por ello se han considerado dos estadios: polen bicelular medio y polen maduro. En el polen bicelular medio, encontramos un fino precipitado inmerso en el material de la exina, las arcadas y en la intina (Lam. 32a, b) las cuales aparecen totalmente negras por el precipitado. Tambin aparece en los microcanales o "gaps" de la ectexina, adems de observarse por el citoplasma dentro de pequeas vesculas las cules se encuentran llenas de este depsito denso. En las cercanas de la pared se puede ver como estas pequeas vesculas estn incluso en contacto

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RESULTADOS con la intina (Lam. 32b). En la regin apertural es interesante la localizacin del precipitado en las tubulaciones del oncus de la intina pero no en su matriz (Lam. 32c, d). En el polen maduro el esquema de los resultados cambia ligeramente ya que en este estadio no se observa precipitado en la regin apertural, salvo en la periferia (Lam. 33d; 34a). Las tubulaciones aparecen ms dilatadas y llenas de material denso a los electrones (Lam. 34c) pero libres de precipitado (Lam. 33d; 34a). En cambio en la intina adyacente a la apertura si est llena de precipitado. En el resto de la intina tambin hay precipitado pero en menor cantidad (Lam. 33a, c; 34b). La distribucin del precipitado por toda la pared es desigual (Lam. 33c). El citoplasma que se caracteriza por una alta vesiculacin, presenta depsitos densos dentro de algunas vesculas (Lam. 33b). Cuando el lantano se incorpor al medio de cultivo (Lam. 34a, b ,c), se observa un esquema anlogo al que acabamos de exponer, pero existe una relacin directa entre el tiempo que los granos estn en cultivo y la cantidad de precipitado que aparece en ellos.

4.4- MICROCUERPOS: ACTIVIDAD CATALASA, PEROXIDASA Y OXIDASA.

La elevada cantidad de sustancias de reserva en el grano de polen, las cuales se van metabolizando a lo largo de la maduracin, nos hace pensar en la existencia

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RESULTADOS de una gran actividad enzimtica. A nivel celular peroxidasas y catalasas se localizan en pequeos compartimentos redondeados con una matriz homognea y de caractersticas estructurales poco llamativas y que de una manera generalizada se les conoce como microcuerpos. Con objeto de identificar la presencia de estos orgnulos en el polen y debido a que segn nuestros resultados ultraestructurales no se han encontrado orgnulos que respondan a estas caractersticas morfolgicas, se ha recurrido a tcnicas citoqumicas e inmunocitoqumicas para la posible localizacin de catalasas y peroxidasas.

4.4.1- CITOQUMICA

4.4.1.1- TCNICA DE LA 3,3DIAMINOBENZIDINA (DAB)

Cuando las muestras problema eran incubadas con DAB mas H2O2 se observa, tanto en cortes teidos como sin teir, un precipitado muy denso a los electrones (negro), localizado tanto en los cuerpos osmifilos como en el citoplasma perifrico entre REr que los rodea (Lam. 35a, b). Las crestas mitocondriales tambin se tien con esta reaccin (Lam. 35c). Como control se utiliz para la incubacin el mismo medio, pero bien con ausencia de H2O2, o bien aadiendo 3-amino-1,2,4-triazol (AT), un fuerte inhibidor

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RESULTADOS de la actividad catalsica (Margoliash y Novogrodsky 1958; Reicheig y Evans 1963). Cuando las muestras control se incuban slo con DAB pero sin H2O2 permanece un ligero precipitado en los glbulos osmifilos, pero donde las masas de precipitado son ms evidentes es en la periferia de estos glbulos en estrecho contacto con las cisternas de RE que los rodean (Lam. 35f). Si se incorpora AT al medio de incubacin completo (con DAB ms H2O2), encontramos que el precipitado desaparece en la periferia de los cuerpos osmifilos, pero no en su interior (Lam. 35e).

4.4.1.2- TCNICAS DEL CERIO PARA DETECTAR DIFERENTES OXIDASAS

De las diferentes tcnicas citoqumicas utilizadas para la localizacin de enzimas oxidasas ( OH-oxidasa; D-aminoxidasa; Xantina oxidasa) los resultados han sido positivos tan slo en el caso de la xantina, siendo similares a los obtenidos con la DAB, apareciendo precipitado a nivel de los cuerpos osmifilos (Lam. 35d). En las otras dos reacciones ( OH-oxidasa; D-aminoxidasa) la causa de que los resultados no sean los esperados puede ser, debido a la dificultad del cerio para penetrar a travs de las paredes de la clula.

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RESULTADOS 4.4.2- INMUNOCITOQUMICA: ANTIPEROXIDASA

Estas experiencias se han realizado principalmente en el estadio de polen maduro. Sin embargo se han tomado otros estadios ms jvenes, como es el de microspora vacuolada, con el objeto de utilizarlos tanto como controles como de problema. Los resultados obtenidos de la inmunolocalizacin de peroxidasa mediante la utilizacin de un anticuerpo policlonal antiperoxidasa (ver Material y Metdos) nos muestran un marcado a nivel de vacuolas en la microspora vacuolada y de vesculas en el polen maduro (Lam. 36a, b). Estos compartimentos contienen material fibrilar en mayor o menor cantidad, depositndose los granos de oro preferencialmente en este material de las vacuolas (Lam. 37a, b; 38a, b). En mitocondrias y sobre todo en aquellas que muestran signos de degradacin tambin se observa marcado (Lam. 37b). En cambio el resto del citoplasma y ncleo aparece libre de granos de oro. Al contrario de lo que caba esperar, segn los resultados obtenidos con la DAB, los cuerpos osmifilos y cisternas de RE se encuentran totalmente limpios de marcaje (Lam. 37a, b). En este caso dejan de ser osmifilos debido a que se ha fijado slo con glutaraldehdo, pero se reconoce que se trata de estos cuerpos por el tamao, forma redondeada y cisternas de REr que los rodean (Lam. 37b). Los controles aparecen libres de marcado (Lam. 37c; 38b).

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LMINAS

Lminas

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LMINAS ABREVIACIONES UTILIZADAS EN LAS LAMINAS:

A: Arcada Ap: Apertura Ba: Bcula o columela Ca: Calosa CF: Centro fibrilar CFD: Componente fibrilar denso CG: Componente granular CG: Clula generativa CV: Clula vegetativa Cr: Cromatina D: Dictiosoma En: Endexina Ex: Exina In: Intina L: Cuerpo osmifilo o lipdico La: Estructuras lamelares M: Mitocondria N: Ncleo Nu: Nucleolo NG: Ncleo generativo NOR: Regin organizadora nucleolar NV: Ncleo vegetativo

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LMINAS OE: Oncus de la exina OI: Oncus de la Intina P: Plastidio RE: Retculo endoplsmico T: Tectum Ta: Tapetum V: Vacuola Vs: Vesculas

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LMINAS

LAMINA 2

POLEN DE TOMATE a- Polen de tomate, observado al MEB, mostrando dos de las tres aperturas (Ap) de tipo colpo (C) interrumpidas por un puente de ectexina (flecha negra).

b- Seccin de un grano de polen maduro de tomate con dos de sus regiones aperturales (Ap) observada al MET.

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Lmina 2

LMINAS

LAMINA 3

CULTIVO in vitro DE ANTERAS

Diferentes fases del desarrollo de callos procedentes del cultivo "in vitro" de anteras, mantenidas en oscuridad:

a- Antera despus de dos semanas en cultivo mostrando zonas hinchadas (flechas)

b- El callo comienza a ser visible por rotura de la pared de la antera (flecha).

c- El callo aumenta de tamao despus de 30 das de cultivo (flecha).

d- Callo formado por la asociacin de pequeas masas de forma globular (flecha).

e- Callos despus de varios meses en cultivo mostrando un tamao considerable. Obsrvese la existencias de zonas de diferente color (asteriscos).

f- Placa Petri con cuatro callos de diferente aspecto tamao y color. Uno de ellos presenta signos de contaminacin (flecha).

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Lmina 3

LMINAS

LAMINA 4

OBSERVACIN DE SECCIONES AL MICROSCOPIO PTICO

Cortes semifinos de 1 m de espesor teidos con azul de metileno y observados al microscopio ptico en campo claro: a- Tetradas b- Microspora media c- Microspora vacuolada d- Polen binucleado joven e- Polen medio f- Polen maduro.

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Lmina 4

LMINAS

LAMINA 5

TETRADA

a- Vista general de una tetrada muy joven. Obsrvese la pared especial de calosa (Ca) rodeando a tres microsporas de una tetrada.

b- Joven microspora en la que la pared de calosa (Ca) se encuentra en contacto directo con el plasmalema. Citoplasma con orgnulos poco diferenciados.

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Lmina 5

LMINAS

LAMINA 6

TETRADAS

a- Aspecto general de una microspora joven. Citoplasma poco denso en ribosomas, los cuales forman una banda de polisomas justo debajo del plasmalema (flechas). Los plastos (P) y mitocondrias (M) se diferencian entre si por la forma y tamao. Se observan dictiosomas (D, crculo). El ncleo presenta la cromatina descondensada salvo pequeas masas densas en la periferia (Cr). Obsrvese la existencia de dos masas nucleolares (Nu) situadas en la periferia, una de ellas unida al organizador nucleolar (NOR) a travs del cual se relaciona con la cubierta nuclear.

b, c- Detalle del citoplasma. Plastidios (P) en forma ameboide. Mitocondrias (M) algunas con signos de degradacin. Vesculas (asteriscos) de igual tamao que las mitocondrias y a veces con inclusiones de material denso en su interior. Haz de microtbulos (mt) adyacentes al ncleo.

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Lmina 6

LMINAS

LAMINA 7

TETRADAS

a, b- Inicios de la formacin de la pared del polen. Obsrvese la presencia de una delgada primexina y del material que constituye los primeros indicios de las columelas y tectum (flechas delgadas). La calosa presenta inclusiones densas (crculos). Se observan polisomas esparcidos regularmente a lo largo del plasmalema (flechas gruesas).

c y d- Regiones del plasmalema ms gruesas en donde faltan los elementos de la exina estructurada (agrupacin de flechas delgadas). En estas zonas se van a desarrollar las aperturas. Polisomas justo debajo del resto del plasmalema (flechas gruesas).

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Lmina 7

LMINAS

LAMINA 8

TETRADAS

a- Ncleo de la microspora de una tetrada con la cromatina (Cr) parcialmente condensada. Obsrvese en el citoplasma la presencia de pequeas masas irregulares de material denso, con morfologa similar al material nuclear y muy cercanas al nucleoplasma (recuadros). Nucleolo (Nu) en anillo con una vacuola central (V) y adosado a una masa del cromosoma organizador nucleolar (NOR). La cubierta nuclear esta llena de poros.

b- Nucleolo unido a la cromatina del organizador nucleolar (NOR) y constituido solamente por componente fibrilar denso (CFD) muy compacto. Tiene forma de anillo con una gran vacuola central (V) que contiene material granular. Algunos centros fibrilares (CF) asociados a vacuolas.

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Lmina 8

LMINAS

LAMINA 9

MICROSPORA RECIN LIBERADA

a_ Microspora joven libre en el lculo con una la exina (Ex) bien definida estructurada. Se observan las tres regiones aperturales (Ap) bien diferenciadas por la ausencia de ectexina.

b- Citoplasma pobre en ribosomas, plastidios (P) ameboides poco diferenciados y mitocondrias ovoides (M) fcilmente distinguibles por su menor tamao. El sistema de membranas es escaso. El ncleo tiene cromatina ligeramente ms descondensada que en un estadio ms joven. El nucleolo (Nu) menos compacto se encuentra desplazado lateralmente y unido al NOR.

c- Detalle de plastos ameboides (P) que presentan una estrecha relacin con cisternas de retculo (RE).

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Lmina 9

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LAMINA 10

MICROSPORA RECIN LIBERADA

a- Regin apertural en la que se observa el oncus de la exina (OE) en forma de lente. Ntese como la endexina se interrumpe en esta regin y sus estructuras lamelares (La) se esparcen en la matriz del oncus. Grnulos supratectales (flechas).

b- Exina (Ex) con todos los elementos estructurales bien desarrollados. Endexina y ectexina tienen la misma densidad electrnica. Columelas muy cortas, arcadas (A) pequeas, tectum (T) continuo y ornamentacin constituida por pequeos grnulos supratectales (flechas).

c- Masa nucleolar (Nu) constituida por el componente fibrilar denso (CFD) y algo componente granular (CG). En la periferia hay espacios vacuolares rodeados por el componente granular (CG). Obsrvese la existencia de varios centros fibrilares (CF) asociados con vacuolas.

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Lmina 10

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LAMINA 11

MICROSPORA MEDIA

a- Vista general de una microspora media. La ectexina (Ec) ms gruesa y ligeramente menos densa a los electrones que la endexina (En). En la regin apertural (Ap) en donde la ectexina est interrumpida, se aprecia un engrosamiento de la endexina (En). Entre el plasmalema y la pared, cercanas a la regin apertural se observan tres grandes espacios periplsmicos (tringulo) translcidos a los electrones. En el citoplasma se inicia la presencia de cuerpos osmifilos (L).

d- Acumulacin de dictiosomas (D) de cinco a siete cisternas segregando vesculas en sus extremos.

c- Vista parcial del citoplasma con algunas cisternas aisladas y cortas de retculo, mitocondrias ovoides (M) y "vesculas-vacuolas" (estrellas) de contenido semejante a los espacios periplsmicos (tringulos).

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Lmina 11

LMINAS

LAMINA 12

MICROSPORA MEDIA

a- Detalle de la exina en la que los grnulos supratectales estn ms difuminandos (flechas) por engrosamiento del tectum (T). La endexina (En) presenta un grosor similar a la exina. En las arcadas (A) se puede apreciar material fibrilar.

b y c- Detalle de la exina en la que se aprecia como las columelas se introducen directamente (flechas blancas) en la endexina (En) al no existir capa basal. El tectum de la ectexina est interrumpido por microcanales (flechas) que comunican el espacio de las arcadas con el exterior. Estructuras lamelares presentes en la parte ms externa de la endexina (En).

d- Regin apertural con espacio periplsmico (tringulo) translcido a los electrones y en forma de lente situado debajo del oncus de la exina (OE). Vesculas citoplsmicas (asteriscos) fundiendo con el plasmalema (flecha) y poniendo en contacto su contenido con el de la matriz del espacio periplsmico.

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Lmina 12

LMINAS

LAMINA 13

MICROSPORA MEDIA

a- Ncleo de miscrospora media en el que se aprecia un incremento del material condensado por todo el nucleoplasma. la cubierta nuclear presenta poros nucleares. Obsrvese la presencia de masas de material fibrilar denso a ambos lados de la cubierta nuclear (recuadros). Nucleolo (Nu) muy compacto.

b- Nucleolo con los componentes fibrilar denso y granular entremezclados. Presencia de centros fibrilares por toda la masa nucleolar pudiendo estar asociados a vacuolas, situadas generalmente en la periferia nucleolar.

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Lmina 13

LMINAS

LAMINA 14

MICROSPORA VACUOLADA

a- Microspora vacuolada con un citoplasma denso en ribosomas. Una gran vacuola (V) ocupando gran parte del citoplasma y que contiene material fibrilar. El ncleo se encuentra desplazado hacia un lateral del grano, en direccin opuesta a una de las aperturas (Ap).

b- Mitocondrias (M) alargadas y de gran tamao dispuestas alrededor del ncleo (N). Se observan los primeros indicios de almidn (A) dentro de un plasto.

c- Grupo de cisternas largas de retculo endoplsmico rugoso (REr).

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Lmina 14

LMINAS

LAMINA 15

MICROSPORA VACUOLADA

a- Regin apertural costituida por el oncus de la intina (OI) en forma de lente debajo del oncus de la exina (OE) el cual, a su vez, aparece recubierto por la ectexina (EC). La endexina (En) se interrumpe en la regin apertural quedando visibles sus estructuras lamelares (La).

b- Citoplasma rico en ribosomas con algunos granos de almidn (A). Plasmalema (Pm) muy ondulado, dejando un espacio debajo de la exina donde se est

formando la intina (In). La vacuola (V) presenta abundante material fibrogranular.

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Lmina 15

LMINAS

LAMINA 16

MICROSPORA VACUOLADA

a, b- Ncleos (N) de microspora vacuolada presentando la cromatina descondensada. Nucleolo (Nu) bien organizado con numerosos y pequeos centros fibrilares (CF) y los componentes fibrilar denso (CFD) y granular (CG) entremezclados.

c- Ncleo en un estadio ms avanzado de una microspora vacuolada, en el que se observa la cromatina ligeramente ms condensada (Cr). El nucleolo es ms compacto y predomina el componente fibrilar denso. Cuerpo nuclear pequeo (flecha) en las cercanas del nucleolo.

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Lmina 16

LMINAS

LAMINA 17

GRANO BICELULAR JOVEN

a- Vista general de un polen bicelular joven. Citoplasma vegetativo con elevada densidad de orgnulos y ribosomas. Ncleo vegetativo y generativo presentan una descondensacin de la cromatina similar. Los nucleolos de ambos ncleos presentan una polarizacin, que se refleja tanto en su posicin excntrica, como en la mayor acumulacin de masas de cromatina condensada en el extremo prximo al nucleolo.

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Lmina 17

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LAMINA 18

GRANO BICELULAR JOVEN

a- Grano bicelular joven. Citoplasma vegetativo con una vacuola (V) que presenta material fibrilo-granular en su interior. El ncleo generativo (NG) presenta la cromatina ligeramente ms condensada en la periferia que el vegetativo (NV), la cual est prcticamente descondensada. Ambos nucleolos, con un volumen proporcional al del ncleo donde se encuentran, presentan vacuola central. Sin embargo el nucleolo generativo responde ms a una estructura en anillo en contacto con el NOR.

b- Clula generativa (CG) de forma lenticular, adosada a la pared del polen. La pared de la clula generativa (asteriscos) se funde con la intina (In). El citoplasma presenta pocos orgnulos y pocas cisternas de retculo (RE) y su densidad ribosmica es similar a la del citoplasma. El ncleo ocupa la mayor parte del volumen celular. Los ribosomas se encuentran agrupados en polisomas.

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Lmina 18

LMINAS

LAMINA 19

POLEN BICELULAR JOVEN

a, b- Regin apertural. El oncus de la exina (OE), cubierto por la ectexina, mantiene su forma lenticular presentando una protuberancia hacia el exterior. El oncus de la intina (OI), tambin lenticular, presenta tubulaciones (estrellas blancas) inmersas en una matriz fibrilar. Las tubulaciones proceden del citoplasma por invaginaciones del plasmalema (cabezas de flecha).

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Lmina 19

LMINAS

LAMINA 20

POLEN BICELULAR JOVEN

a- Ncleo generativo con masas de cromatina (Cr) de tamao considerable adosadas a la cubierta nuclear (CN). Este ncleo presenta un centro fibrilar grande (CF) unido al NOR y rodeado por sus componentes fibrilar y algo de granular.

b- Ncleo vegetativo con la cromatina descondensada. Gran nucleolo con una estructura completamente diferente: numerosos centros fibrilar (CF) homogneos y pequeos dentro del componente fibrilar denso (F). Mayor cantidad de componente granular con un cierto grado de segregacin en la periferia (G).

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LMINAS

LAMINA 21

POLEN BICELULAR MEDIO

a- Grano bicelular medio. Citoplasma muy rico en orgnulos con gran cantidad de material de reserva: almidn (A) y cuerpos osmifilos (L).

b- Amiloplastos (A) rodeados por cisternas de retculo (RE).

c- Mitocondria (M) con crestas largas, dictiosomas (D) pequeos con cuatro o cinco cisternas y vesculas diminutas en sus extremos. Material fijado slo con glutaraldhido.

d- Grano de polen con la clula generativa rodeada por su pared e inmersa en el citoplasma vegetativo, el cual muestra gran cantidad de almidn.

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LAMINA 22

POLEN BICELULAR MEDIO

a- Detalle de la exina. La ectexina (Ec) formada por un tectum (T) grueso y continuo, slo interrumpido por microcanales (flechas). Las columelas (Ba) son cortas y macizas apoyndose directamante en la endexina.

- Exina en la que se puede apreciar como el material de la ectexina no es homogneo sino que presenta un ligero punteado.

b- Ncleo vegetativo con cromatina descondensada. Nucleoplasma con gran cantidad de fibras y grnulos (flechas), tambin localizados en el nucleolo. Nucleolo con centros fibrilar es pequeos y homogneos (CF). Componente granular parcialmente segregado.

c- Nucleolo vegetativo con una vacuola central, centros fibrilares pequeos (CF).

d- Clula generativa inmersa dentro del citoplasma vegetativo y rodeada por grupos de cisternas de RE rugoso. El ncleo ocupa la mayor parte del volumen celular, con la cromatina parcialmente condensada.

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LAMINA 23

POLEN BICELULAR MADURO

a- Polen bicelular maduro. Citoplasma lleno de vesculas y otros orgnulos.

b, d- Fijacin solamente con glutaraldhido por lo que las estructuras osmiofilas, como membranas y cuerpos lipdicos, no estn teidos destacndose muy bien dentro de un citoplasma que presenta un alto grado de densidad electrnica. Mitocondrias (M) de crestas largas y bien patentes, con zonas de degradacin en su matriz (asterisco). Plastos sin almidn (P). Cuerpos lipdicos (L) rodeados por una cisterna de RE rugoso.

c- Clula generativa con una pared altamente lobulada (flechas gruesas) y rodeada por cisternas de RE rugoso. El ncleo tiene la cromatina muy condensada.

e- Cuerpos lipdicos (L), rodeados por ms de una cisterna de retculo endoplsmico rugoso (RE).

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LAMINA 24

POLEN BICELULAR MADURO

a- Citoplasma del grano maduro muy rico en orgnulos con los dos ncleos vegetativo (NV) y generativo (NG). El ncleo vegetativo ha perdido la forma esfrica siendo ahora lobulado. El ncleo generativo tiene la misma forma alargada que la clula generativa (CG). Ambos presentan cromatina muy condensada y ausencia de nucleolo.

b- Agrupacin de cisternas de RE rugoso paralelas entre s y muy dilatadas. Se aprecia fragmentacin y vesiculacin de esta cisternas (tringulos). Las vesculas primarias no pierden los ribosomas los cuales muestran un elevado contraste (flechas).

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LAMINA 25

POLEN BICELULAR MADURO

a- Pared del polen maduro completa con exina (Ex) e intina (In), esta ltima constituida por un material fibrilar. Continua la presencia de microcanales en el tectum (cabeza de flecha). En el citoplasma las cisternas de retculo endoplsmico rugoso (RE) estn llenas de material denso a los electrones, muchas de ellas se disponen justo debajo del plasmalema de forma paralela (flechas).

b- Detalle del citoplasma rico en organelas: Dictiosomas (D), mitocondrias (M), plastos (P). Material fijado slo con glutaraldehido.

c- Citoplasma altamente vesiculado con el ncleo vegetativo (NV) representado por dos compartimentos aparentemente independientes que corresponden a dos lbulos del mismo.

d- Clula generativa con pared muy ondulada (flechas). El ncleo generativo presenta grandes masas de cromatina condensada (Cr) en un nucleoplasma de matriz griscea.

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LAMINA 26

POLEN BICELULAR MADURO

a- Regin apertural con la exina (Ex) interrumpida permitiendo que el abultado oncus de la intina (OI) salga hacia fuera. En la matriz del oncus las tubulaciones dilatadas y llenas de un material denso se encuentran separadas del plasmalema por una capa homognea de intina (In). En el citoplasma prximo a la apertura se acumulan mitocondrias (M).

b- Detalle del oncus de la intina muy desarrollado con numerosas tubulaciones densas (cabezas de flecha) inmersas en una matriz fibrilar griscea.

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LAMINA 27

TINCIN PREFERENCIAL PARA RIBONUCLEOPROTEINAS (EDTA)

a- Control, tincin uranilo-plomo. Ncleo vegetativo (NV) y generativo de un polen bicelular joven. Obsrvese como la cromatina, nucleolo y material ribonucleoproteico presentan el mismos grado de tincin.

b, c- Tincin de EDTA. b- Ncleo generativo; c- ncleo vegetativo. Nucleolo y material fibrilo-granular del nucleoplasma se tie, mientras que las masas de cromatina aparecen blanqueadas.

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LAMINA 28

TINCIN PREFERENCIAL PARA RIBONUCLEOPROTEINAS (EDTA)

a, b- Polen bicelular medio. a- EDTA, b- control. Obsrvese la gran cantidad de granos ribonucleoproteicos en el nucleoplasma vegetativo (recuadro).

c, d- Clula generativa del grano bicelular maduro. c- EDTA; d- Control.

e, f- Ncleo vegetativa del grano bicelular maduro. e- EDTA; f- Control.

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LAMINA 29

TINCIN ESPECIAL PARA POLISACRIDOS: PTA

a, b- Microspora. En la pared se tie la endexina (En), material fibrilar de las arcadas (flechas gruesas), as como los grnulos supratectales de la exina y material globular del lculo de la antera (flechas largas).

c- Microspora vacuolada. Se tie el material fibrilar incluido dentro de la vacuola.

d- Grano bicelular joven. La pared de la clula generativa (asteriscos) y la intina (In) del grano se tien por igual.

e- Grano de polen maduro. La intina da positiva al igual que las vesculas localizadas en el citoplasma cercanas o fundiendo con la intina (asteriscos).

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LAMINA 30

TINCIN ESPECIAL PARA POLISACRIDOS: PTA, THIERY

a, b- Grano bicelular. PTA. Intina (cabezas de flecha) y pared de la clula generativa (flechas) se tien intensamente, as como las pequeas vesculas en el citoplasma.

c, d, e- Grano bicelular. Test de Thiery. La intina (In), la pared de la clula generativa (flechas) y la matriz del oncus de la intina (OI) dan positivas a esta reaccin.

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LAMINA 31

DETECCIN DE CATIONES INORGNICOS EN LA PARED DEL POLEN

Tcnica del Piroantimoniato potsico. Polen Bicelular.

a- La exina presenta en la superficie externa y en las arcadas dos tipos de precipitado de diferente tamao, grueso (flecha delgada) y fino (flechas gruesas).

b- Regin apertural con precipitado en la matriz de oncus de la exina.

c- Citoplasma en el que aparece precipitado a nivel de vesculas principalmente en sus membranas (flechas).

d-Clula vegetativa y generativa mostrando reaccin positiva en sus nucleolos (flechas)

e- Los cuerpos lpidicos dan reaccin positiva observndose gran cantidad de precipitado fino en ellos. Vesculas (cabeza de flecha) que muestran precipitado grueso.

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LAMINA 32

EL LANTANO COMO ELEMENTO TRAZA

Polen bicelular medio. a,b- Pared del grano de polen en la que la intina se encuentra totalmente "negra" por el precipitado, as como los microcanales (doble flecha) y arcadas (A) de la exina. Se aprecia un fino precipitado en el material que constituye el tectum y las columelas (recuadro). La reaccin tambin es positiva en vesculas del citoplasma que se encuentran cercanas o unidas a la intina (flechas).

c,d- Regin apertural. Obsrvese el precipitado localizado en los tbulos del oncus del oncus de la intina (OI).

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LAMINA 33

EL LANTANO COMO ELEMENTO TRAZA

Grano de polen maduro. a- El precipitado se localiza en la intina (In), arcadas y en la superficie del grano (flechas). El grado de precipitado es menor que el que se observa en el interior de la intina del polen bicelular medio.

b- Dentro de las vesculas (Vs) del citoplasma se observa precipitado grueso.

c- Intina y arcadas presentan una distribucin desigual de precipitado (flechas)

d- La regin apertural aparece libre de precipitado en el oncus de la intina (tanto las tubulaciones como la matriz) aunque este se encuentra en su superficie externa (flechas gruesas). El precipitado (flechas delgadas) se acumula principalmente en la intina contigua al oncus de la intina (OI).

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LAMINA 34

EL LANTANO COMO ELEMENTO TRAZA

Polen maduro cultivado en un medio que contiene nitrato de lantano. a-El precipitado est localizado en el exterior de la apertura (flechas gruesas), arcadas e intina no apertural (flechas pequeas). Las tubulaciones del oncus de la intina (OI) estn libres de precipitado.

b- En las zonas interaperturales se observan depsitos de lantano a nivel de las arcadas e intina (flechas). La superficie del grano aparece totalmente cubierta por precipitado (flechas gruesas).

c- Control, polen cultivado en medio sin lantano. Ausencia total de precipitado

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LAMINA 35

GRANO DE POLEN MADURO, MICROCUERPOS: PEROXIDASAS, CATALASAS Y OXIDASA

Tcnica de la DAB: a, b, c, e, f a, b, c- Incubacin DAB ms H2O2. a- Material teido. b, c- material sin teir. Obsrvese la presencia de precipitado tanto en el interior de los cuerpos osmifilos (L) como en citoplasma adyacente (cabeza de flecha). c- Las crestas de mitocondrias (M) tambin son positivas a la reaccin.

e, f- Controles e- Incubacin en DAB con H2O2 y AT. El precipitado (cabezas de flecha) slo se da en el interior de los cuerpos osmifilos (L). Tambin se encuentra en la pared generativa.

f- Incubacin en DAB sin H2O2. En este caso, el precipitado (cabezas de flecha) aparece en el citoplasma que rodea los cuerpos osmifilos (L).

d- Tcnica del cerio para detectar Xantina oxidasa. Material teido. El precipitado presenta la misma localizacin que en la reaccin de la DAB (cabezas de flecha) tanto en la periferia, como en el interior de los cuerpos lipdicos.

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LAMINA 36

POLEN MADURO: INMUNOLOCALIZACIN DE PEROXIDASA

a,b- El marcado de oro (cabezas de flecha) se localiza principalmente a nivel de vesculas o pequeas vacuolas (Vs). Espordicamente las mitocondrias (M) y retculo (RE) pueden presentar algn grano de oro.

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LAMINA 37

POLEN MADURO: INMUNOLOCALIZACIN DE PEROXIDASA.

a- Los granos de oro se localizan en vesculas que contienen restos de material grisceo en su interior (cabezas de flecha). Cisternas de retculo endoplsmico rugoso y ncleo (N) aparecen libres de marcado.

b- Los cuerpos lipdicos (L) estn libres de marcado mientras las mitocondrias (M) con signos de degradacin si presentan partculas de oro (cabeza de flecha).

c- Control. Citoplasma completamente limpio de granos de oro.

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LAMINA 38

MICROSPORA VACUOLADA: INMUNOLOCALIZACIN DE PEROXIDASA.

a- El marcado (cabezas de flecha) est localizado preferencialmente sobre el material fibrilar de la vacuola (V).

b- Control. No se observa marcado sobre el material fibrilo-granular de la vacuola (flechas).

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DISCUSIN

Captulo 5: Discusin

5.1- CULTIVO in vitro DE ANTERAS DE TOMATE

Las tcnicas de cultivo in vitro van orientadas a la obtencin de individuos haploides, los cuales tienen un gran nmero de ventajas frente a los individuos diploides (como ya se ha indicado en el captulo introduccin) por lo que son muy tiles en programas de mejora vegetal y de ingeniera gentica. Son numerosas las posibles vas de andrognesis que han sido descritas como se indica en el esquema II (pgina ). Nosotros hasta ahora slo hemos conseguido la formacin de callos a partir del cultivo de anteras. De los dos medios utilizados, los resultados parecen ser que han sido mejores con el medio MS obteniendo

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DISCUSIN callos que se desarrollan ms y en mayor nmero; estos resultados son similares a los de otros autores (Zagorska y col. 1982); (Ziv y col. 1982). La concentracin ptima de hormonas en nuestro caso es de 2mg/l NAA y 5 1mg/l kinetina lo que coincide con los datos sealados por Gulshan y col. (1981). Parece ser que las hormonas y su concentracin son factores decisivos en los cambios que se originan en el cultivo. Tambin es importante el genotipo de la planta donadora y su interaccin con los componentes del medio (Levenko y col. 1977). La formacin del embrioide es un fenmeno ms complejo y especfico que la formacin de callos, por lo que resulta ms difcil encontrar las condiciones ambientales, as como la composicin ptima del medio. Son varias las especies en las que a partir del cultivo de anteras se han obtenido directamente embrioides que llegan a se desarrollarse dando una planta completa, como es el en caso de Datura (Guha y Maheshwari 1964) y Nicotiana (Sunderland y Wicks 1971) y Oenothera (Martnez y Noher de Halac 1992). Sin embargo no se tiene certeza si las plantas obtenidas son haploides o diploides, al no poder determinar si la nueva planta se desarrolla a partir del grano de polen o de las paredes de la antera, por lo que la utilizacin de las anteras para la obtencin de haploides tiene sus inconvenientes. En realidad la mejor forma de asegurarnos el origen haploide de callos y embrioides, seria realizando el cultivo del polen aislado (Sharp y Raskin 1972). Para ello es de mxima utilidad conseguir la maduracin in vitro del polen. Esto lo ha logrado el grupo de Heberle-Bors en Viena, utilizando como material microsporas de Nicotiana (Benito-Moreno y col. 1988; Kyo y Harada 1988). Si embargo, hasta la fecha esta es la nica especie en la que se ha llevado a cabo con

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DISCUSIN xito la maduracin in vitro del polen. Nuestro propsito fue poner este sistema a punto en el tomate, ya que al tratarse de un gnero que pertenece a la misma familia que el tabaco (Solanceas), pensamos que podra ser un material idneo. Pero los resultados preliminares obtenidos no parecen confirmar esta hiptesis, ya que tanto la induccin de la andrognesis como la maduracin del polen no parecen ser fciles de llevar a cabo, ya que despus de un ao de experiencias slo conseguimos la formacin de callos. En el Esquema V, se muestran las tres posibles vas de formacin del callo o del embrioide a partir de la microspora: A) Divisin asimtrica de la microspora para dar lugar al grano de polen. B) El ncleo de la microspora se divide de forma simtrica dando dos ncleos iguales, los cuales se dividen de manera sucesiva dando como resultado la formacin de callos o de embriones (Gulshan y col. 1981). C, D). En otros casos, inicialmente la divisin del ncleo de la microspora se realiza de forma asimtrica dando dos ncleos diferentes entre s uno vegetativo y otro generativo para posteriormente ser (C) bien el ncleo generativo el que se divide sucesivamente degenerando la clula vegetativa, o (D) ser el ncleo vegetativo el que se divide desapareciendo la clula generativa (D) (Reinert y col. 1981). Segn lo indicado, un aspecto importante a tener en cuenta es el estadio en el que se encuentran las anteras que ponemos en cultivo. Nosotros hemos cultivado anteras desde el estadio de CMP hasta que contenan polen bicelular. El estadio en el que nosotros hemos conseguido inducir la formacin de callos ha sido el de microspora, coincidiendo con los resultados de otros autores (Sopory y Mahesh-

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DISCUSIN

ESQUEMA V: Diferentes orgenes de granos de polen pluricelulares wari 1976; Dunwel Y Sunderland 1973; Gulshan y col. 1981; Sunderland 1984; Heberle-Bors 1985; Prakash y Giles 1987; Benito Moreno 1988). Algunos autores (Sangwan y Sangwan-Norreel 1987) indican que la relacin almidn/estadio de desarrollo posiblemente sea determinante para que la planta se pueda considerar andrognica, de manera que especies en las que el almidn aparece en estadios jvenes generalmente son recalcitrantes. Se ha sugerido que el paso de proplastidios hasta amiloplastos marca un estado de desarrollo tal en el que es difcil de inducir una actividad meristemtica. Segn este criterio Lycopersicum esculentum podra ser considerada una especie recalcitrante puesto que el almidn comienza a aparecer en un estadio relativamente temprano como es la microspora vacuolada.

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DISCUSIN Sin embargo si se ha conseguido inducir la andrognesis en esta especie (Gresshoff y Doy 1972; Zagorska y col. 1982; Ziv y col. 1982) por lo que se tratara de una excepcin (Sangwan y Sangwan-Norreel 1987). Una posible explicacin de los resultados obtenidos por nosotros podra ser que el estadio de desarrollo de la microspora es tan determinante que limita enormemente la posibilidad de inducir la andrognesis, por lo que posiblemente nunca hayamos partido del estadio adecuado. Un seguimiento a nivel celular de los cambios que se producen durante la microsporognesis en Lycopersicum nos dar informacin a cerca de la diferenciacin que tiene lugar en cada etapa del desarrollo del polen y nos ayudar en nuestra tarea de inducir la embriognesis in vitro a partir de la antera y/o microsporas.

5.2- CAMBIOS SUFRIDOS POR EL GRANO DE POLEN DURANTE EL DESARROLLO Y MADURACIN.

5.2.1 CITOPLASMA

El grano de polen de tomate, al igual que ocurre en otras especies sufre cambios en su organizacin y estructuras, orientados a conseguir un grano capaz de llevar a cabo las funciones propias de la fase gametoftica, como son la formacin de las clulas gamticas y germinacin del tubo polnico. De aqu la atencin que

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DISCUSIN diferentes autores han prestado al estudio del desarrollo del polen (Gorska-Brylass et al 1984; Cresti y col. 1984; Fernndez 1986; Weber 1989b; Rodrguez-Garca y Fernndez 1990).

El incremento de la poblacin ribosmica que nosotros observamos durante el desarrollo de la microspora del tomate, parece ser un fenmeno general relacionado con la expresin del genoma haploide de las microsporas (Dickinson y Heslop-Harrison 1977). Despus de la meiosis la microspora presenta un citoplasma pobre en ribosomas, los cuales progresivamente aumentan en nmero hasta llegar a polen maduro con un citoplasma muy rico en ribosomas. La repoblacin ribosmica postmeitica ha sido relacionada con la presencia en el citoplasma de jvenes microsporas de cuerpos semejantes al nucleolo y que son conocidos en la literatura como nucleoloides (Dickinson y Heslop-Harrison 1970). Estos cuerpos han sido encontrados en diferentes especies como son Lathyrus odoratus (Latter 1926); Fritillaria (Frankel 1937); Sambucus nigra, Bellevalia romana (Gavaudan 1948; Gavaudan y col. 1936); Lilium longiflorum (Dickinson y Heslop-Harrison 1970); Allium cepa (Rodrguez-Garca 1970); Olea europaea (Rodrguez-Garca y Fernndez 1989). Sin embargo la microspora del tomate no presenta en ningn momento cuerpos citoplsmicos semejantes al nucleolo. Pero si se han observado localizados en el citoplasma cercano a la cubierta nuclear y en estrecha relacin con ella, pequeas masas de material denso similares en sus caractersticas a material nuclear. Las imgenes nos sugieren una aparente salida de este material a travs de los poros nucleares, por lo que estas masas podran

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DISCUSIN tener una funcin similar a los nucleoloides de otras especies. Actualmente se conoce bien la naturaleza ribonucleoproteica de los nucleoloides y su analoga con los nucleolos (Alch 1991; Sato y col. 1991). Es necesario identificar la naturaleza de estas masas densas del tomate para poder establecer su similitud y su posible funcin en el mecanismo que presenta la microspora para restaurar la poblacin ribosmica.

El sistema de membranas de una clula est representado mayoritariamente por el retculo endoplsmico. En nuestro material objeto de estudio el RE prcticamente no existe o es muy escaso hasta bien avanzada la microspora. Es a lo largo de la maduracin del polen cuando el RE experimenta un espectacular cambio en cuanto al nmero y tamao de sus cisternas. Una diferenciacin del RE semejante a la que nosotros observamos en el polen de tomate ha sido descrita en otras especies: Nicotiana (Cresti y col. 1985); Lycopersicum peruvianum (Cresti y col. 1977); Euphorbia (Murgia y col. 1986); Olea (Rodrguez-Garca y Fernndez 1990); Apium (Weber 1989). El hecho de que las membranas del retculo siempre estn asociadas a ribosomas, tratndose de retculo endoplsmico rugoso, as como la dilatacin que experimentan sus cisternas durante el desarrollo indican una elevada sntesis y almacenamiento de protenas, lo cual tambin ha sido sugerido por otros autores (Fisher y col. 1968; Jensen 1968; Cresti y col. 1975; Cresti y col. 1977). Recientemente ha sido probada la presencia de protenas dentro de cisternas del RE en el polen maduro del olivo mediante tcnicas inmmunocitoqumicas (Rodrguez-Garca y col. 1992).

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DISCUSIN La disposicin de las cisternas de RE paralelas al plasmalema en el grano de polen maduro, sugieren una funcin de transporte hacia la pared del grano (Chripeels 1976, 1980; Rodrguez-Garca y Fernndez 1990). Por otra parte la fragmentacin que sufren estas cisternas dando lugar a vesculas, indican otra posible va de reutilizacin de las protenas almacenadas en este RE.

Las mitocondrias experimentan un incremento en tamao y nmero durante el desarrollo y maduracin del polen. En el tomate hay que destacar que es justo inmediatamente antes y despus de la divisin mittica asimtrica, cuando observamos formas alargadas y muy grandes e incluso estranguladas, lo que induce a pensar que las mitocondrias se dividen. Adems durante la maduracin del grano de polen se aprecia un mayor nmero de mitocondrias acompaadas de un descenso en su tamao, lo que parece ser una consecuencia lgica de la divisin mitocondrial. Otros indicios de que hay una renovacin de la mitocondrias es la degradacin que se observa en la matriz de algunas de ellas, as como la presencia de vesculas del mismo tamao y que tienen en su interior restos de matriz, crestas e incluso, a veces, se puede distinguir una doble membrana externa. Es en el material incluido en estas vesculas donde se ha localizado la peroxidasa, lo que sugiere procesos degradativos en los que tiene un papel importante la actividad peroxidsica.

Los plastos de la microspora son poco diferenciados, presentando una estructura propia de leucoplastos, siendo hacia el final de este perodo cuando se observan

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DISCUSIN los primeros indicios de almidn. Pero no es hasta el polen bicelular avanzado cuando el almidn alcanza su mxima representacin. Cabe preguntarse de donde proceden los precursores utilizados en la sntesis del almidn, ya que los plastos sin diferenciar no tienen capacidad de sntesis. Se ha postulado la hiptesis de que los restos glucdicos procedentes de la degradacin de la pared de calosa sean reutilizados por la microspora para este fin (Rodrguez-Garca, Garca 1978). Aunque en el tomate los primeros depsitos no aparecen inmediatamente despus de la degradacin de la calosa, esto no es obstculo para que los restos de glucosa pueden almacenarse en el lculo y/o dentro de la gran vacuola citoplsmica que se forma en el estadio de microspora vacuolada. Ello explicara el que la formacin del almidn se produzca en tiempos diferentes de la microsporognesis segn las especies (Paccini y Franchi 1988; Sangwan y Sangwan Norreel 1987). Por otra parte la ntima relacin observada entre los plastos y el RE rugoso sugiere la idea de que el RE en estos momentos sea una va de transporte hacia los plastos de precursores del almidn (Larson 1965). Esta asociacin entre plastos y RE ha sido descrita en varias especies (Larson 1965; Cammefort 1970; Dumas 1974; Abreu y Santos 1977; Paccini y Cresti 1976; Rodrguez-Garca y Sievers 1977) lo que indica que no es esta una peculiaridad del polen de tomate, sino ms bien responde a un mecanismo utilizado por la clula cuando las circunstancias lo requieren. A partir de polen bicelular medio se observa una disminucin del almidn y un incremento de los cuerpos osmifilos, probablemente de naturaleza lipdica. Este hecho tambin ocurre en otros plenes (Miki-Hiroshige y Nakamura 1983; Fernndez 1986; Pas y Feijoo 1986, 1987; Charzynska y col. 1989). Todo parece

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DISCUSIN indicar que se produce una metabolizacin del almidn hasta lpidos igual que ha sido descrito en Lilium longiflorum (Miki-Hiroshige y Nakamura 1983; Bird y col. 1983); Olea europaea (Fernndez 1986). Al final de la maduracin los cuerpos osmifilos tambin desaparecen probablemente para ser metabolizados hasta azucares. En el caso de semillas oloeaginosas tambin tiene lugar una metabolizacin de lpidos a azcares (Beevers 1980). La estrecha relacin que existe entre cuerpos osmifilos y cisternas de RE nos sugiere un papel del RE en la metabolizacin de los lpidos de una manera anloga a la indicada en cotiledones de sandia sobre la ontogenia de glioxisomas (Wanner y col. 1982).

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DISCUSIN 5.2.2 NCLEO

Los complejos procesos de diferenciacin que tienen lugar durante el desarrollo del polen vienen estrictamente regulados y controlados por el ncleo, de aqu la importancia de este compartimento. Cualquier cambio de la actividad nuclear queda reflejada en su estructura. La microspora sintetiza durante su desarrollo una gran cantidad de RNA ribosmico y de transferencia. Esta actividad disminuye bruscamente en el polen bicelular (Steffensen 1966; Mascarenhas y Bell 1970; Mascarenhas 1975). Durante la maduracin del polen tiene lugar una intensa transcripcin y sntesis de RNA mensajero y de protenas (Mascarenhas 1989). La presencia de determinados enzimas en el polen es consecuencia de la expresin del genoma haploide y no est influido por el genotipo diploide de la planta (Mascarenhas 1989). Son escasos los estudios sobre la replicacin en el grano de polen (Swiff 1950; Moses y Taylor 1955; Jalouzot 1969; Tanaka y col. 1979; Chwirot y GorskaBrylass 1981; Risueo y col. 1985; Testillano 1991). Estos trabajos muestran que la dinmica del perodo S de la interfase postmeitica varia mucho segn la especie. La sntesis de DNA tiene lugar bien en un nico incremento en fases cercanas a la primera mitosis, o bien en dos incrementos de DNA, uno al principio de la interfase y otro al final de la misma (Jalouzot 1969; Tanaka y col. 1979; Arquiaga 1985; Testillano 1991). En el tomate se he determinado la evolucin de la ultraestructura nuclear a lo largo de la interfase postmeitica de la tetrada y de los ncleos vegetativo y

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DISCUSIN generativo durante la maduracin del grano de polen. Durante la interfase de la microspora, la cromatina en general se encuentra ms bien dispersa. Sin, embargo se puede apreciar cierto grado de condensacin en el perodo de tetrada y en la microspora media. El mximo grado de descondensacin de la cromatina se detecta en la joven microspora y a lo largo de la vacuolacin de la microspora. En este tiempo tambin se observa una elevada cantidad de grnulos en el nucleoplasma. Finalmente, previo a la mitosis asimtrica, tiene lugar una rpida condensacin de la cromatina. Al no contar con resultados de experimentos autorradiogrficos, mediante la incorporacin de elementos radiactivos (uridina tritiada), no nos ha sido posible determinar las fases G1, S1 y S2 de la interfase y relacionarlas con las diferentes estadios de la microspora, as como con los grados de condensacin de la cromatina. Sin embargo estas fases si han sido determinadas en otras especies como es el caso de Scilla peruviana (Testillano 1991). Aunque slo sea indirectamente, y teniendo en cuenta las diferencias propias de cada especie, podemos decir que la mxima descondensacin de la cromatina tiene lugar durante el perodo S (segn los resultados de Testillano 1991), lo cual implicara que este perodo, en el tomate, abarca desde la joven microspora libre hasta la fase vacuolada ya avanzada. En el polen bicelular el comportamiento de ambos ncleos es completamente distinto. El ncleo generativo sufre una condensacin progresiva de su cromatina hasta llegar a la mxima condensacin en el grano de polen maduro. El ncleo vegetativo presenta un alto grado de descondensacin de su cromatina durante toda la maduracin. Slo en el estadio final, cuando el ncleo pierde su forma esfrica,

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DISCUSIN es posible observar condensacin de su cromatina, pero con un patrn diferente al que muestra el ncleo generativo. En clulas vegetales la cromatina se estructura segn diferentes patrones, dependiendo de la cantidad de DNA total y repetitivo de la especie (Jordan y col. 1980). La cromatina condensada o heterocromatina se ha descrito transcripcionalmente inactiva ya que no se marca en experimentos autorradiogrficos con incorporacin de uridina tritiada con pulsos cortos (Granboulan y Granbouland 1965; Karasaki y col. 1965; Fakan y Puvion 1980). La inactivacin de la cromatina condensada se ha relacionado con el alto grado de compactacin de la cromatina. Por tanto las diferencias estructurales de la cromatina en ambos ncleos responde a sus diferencias fisiolgicas: mientras el ncleo generativo pasa del perodo S a G2 muy pronto, encontrndose ya en polen bicelular medio en fase G2, el ncleo vegetativo se detiene en la fase G1 y nunca entra en el perodo S de replicacin (Zarsky y col. 1992). Slo al final de la maduracin del polen, el ncleo vegetativo presenta signos de entrar en va terminal de degeneracin: lobulacin de la cubierta nuclear posiblemente por prdida del citoesqueleto nuclear, condensacin de la cromatina en forma de grumos y diferenciacin de la matriz nuclear hacindose ms griscea y homognea.

La evolucin del nucleolo a lo largo de la microspora y del polen bicelular refleja los cambios de actividad relacionados con la biognesis de ribosomas y su transporte (Warner 1990). Las diferentes etapas de esta biognesis corresponden a dominios nucleolares, los cuales pueden ser identificados por su morfologa. Los

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DISCUSIN tres dominios nucleolares bsicos son: los centros fibrilares (CF), considerados como lugar de almacenamiento de genes ribosomales no transcritos; el componente fibrilar denso (CFD), lugar de transcripcin de esto genes y el componente granular (CG), lugar de maduracin y almacn de las subunidades ribosomales (Goenssens 1984; Hernandez-Verdun 1986). Sin embargo, actualmente no hay unanimidad sobre cual es el verdadero lugar de transcripcin. Algunos autores creen que esta tiene lugar en los CF (Scheer y Benavente 1990); para otros ocurre en el lmite entre los CF y el CFD (Derenzini y col. 1990; Thiry y col. 1991) y otros consideran solamente al CFD como responsable de la transcripcin (Hartung y col. 1990; Wachtler y col. 1989). La morfologa nucleolar varia drsticamente con los cambios de su actividad. Es bien conocido que las variaciones en la sntesis y/o procesamiento del RNA ribosmico provocan inmediatamente una redistribucin de los componentes nucleolares tanto en condiciones experimentales como naturales (Goessens 1984; Hadjiolov 1985; Risueo y Medina 1986; Olmedilla y col. 1987). Ello ha permitido relacionar tpicas morfologas nucleolares con diferentes niveles de actividad transcripcional. De nuestras observaciones durante la interfase de la microspora se desprende que el nucleolo sufre una paulatina activacin durante la interfase, al igual que ocurre en la microspora de Scilla (Testillano 1991). Una vez que el nucleolo ya est completamente reorganizado en la joven tetrada, esta presenta un aspecto muy compacto y se observa formado solamente por un gran CF en conexin con el NOR y exclusivamente constituido por CFD. Tambin hay que sealar la posible

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DISCUSIN presencia de una gran vacuola central que le confiere al nucleolo puede tener forma de anillo. La ausencia de CG as como la aparicin de grandes CF se ha descrito como una morfologa tpica de ncleos inactivos en transcripcin (Risueo y Medina 1986). Sin embargo, la gran vacuola central hasta ahora ha sido relacionada con nucleolos que presentan una elevada actividad transcripcional (Moreno Daz de la Espina y col. 1980; Risueo y Medina 1986; Testillano 1991). Tambin se ha sugerido que estas vacuolas podran estar implicadas en la translocacin y almacenamiento de material nucleolar (Moreno Daz de la Espina y col. 1980). Sin embargo, realmente no se conoce el papel concreto desempeado por este tipo de vacuolas (Fakan y Hernandez-Verdun 1986). En la joven microspora aumenta ligeramente el nmero de CF asociados a vacuolas perifricas, mientras desaparece la gran vacuola central. El CFD sigue siendo mayoritario. Las vacuolas se diferencian fcilmente de los CF por tener un contenido menos denso que los CF y de aspecto similar al del nucleoplasma (Jordan 1984; Risueo y Medina 1986), mientras los CF tienen un aspecto ms denso y son argirfilos (Risueo y col. 1988). En clulas vegetales estas vacuolas se han denominado "vacuolas de reactivacin" formadas a partir del gran CF inicial que contiene el NOR, para luego disminuir de tamao y llegar a desaparecer al mismo tiempo que aumenta la actividad transcripcional del nucleolo (Risueo et al. 1982; Fakan y Hernndez-Verdun 1986; Testillano 1991). En la microspora media estas vacuolas se van haciendo ms pequeas, se incrementa el nmero de pequeos CF homogneos y aumenta el CG, todo ello indica una mayor actividad nucleolar. En las ltimas etapas del estadio de microspora (Microspora vacuolada) el CG es

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DISCUSIN abundante y aparece entremezclado con el CFD. Ya no existen vacuolas y los numerosos CF son homogneos y pequeos. Se han descrito estos CF homogneos como ms activos por tener DNA en estado descondensado lo cual est relacionado a una mayor actividad transcripcional del nucleolo (Risueo y Medina 1986). Esta morfologa es tpica de un nucleolo con gran actividad (Risueo y col. 1982). Todos estos cambios son evidencia de un incremento en la sntesis de RNAr durante la interfase de la microspora, durante gran parte de la cual el nucleolo se ha ido activando lentamente hasta llegar al perodo de microspora vacuolada, en la que segn todos los indicios la actividad de transcripcin es mxima. Tras la mitosis asimtrica es posible observar, como desde el principio, los nucleolos de las clulas recin formadas presentan diferente comportamiento. La nica morfologa observada en el ncleo generativo, responde a una baja actividad nucleolar: un slo CF unido al NOR, rodeado por una masa compacta de CFD y muy poco CG segregado en la periferia. Esta estructura solamente se encuentra en el polen bicelular joven para desaparecer paulatinamente en las siguientes etapas del polen. Esto significa que el nucleolo no llega a activarse y pasa directamente de la reorganizacin a su extincin. Este hecho es muy significativo y responde a la baja o nula sntesis de RNA de la clula generativa. En cambio en la clula vegetativa es conocida por una elevada sntesis de RNA mensajero y de protenas (Mascarenhas 1989). En el ncleo vegetativo encontramos un nucleolo con la estructura de un nucleolo activo. Paulatinamente esta actividad parece decrecer como se refleja en la segregacin que presentan el CFD y CG (Risueo y Medina 1986). Finalmente en el polen maduro, cuando ya cesa

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DISCUSIN la sntesis de RNA y protenas el nucleolo tambin desaparece. Observamos una transformacin progresiva de la estructura nucleolar conforme la sntesis de RNA va decayendo (Risueo 1990). Nos encontramos ante un claro ejemplo de la estrecha relacin que existe entre estructura-funcin.

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EVOLUCIN DEL NUCLEOLO Y DE LA CROMATINA DURANTE EL DESARROLLO DE LA MICROSPORA DE POLEN DE TOMATE

NUCLEOLO

DESCOMPENSACIN DE LA CROMATINA

TETRADAS

MICROSPORA LIBRE

MICROSPORA MEDIA

MICROSPORA VACUOLADA

EVOLUCIN DEL NUCLEOLO Y DE LA CROMATINA DURANTE EL DESARROLLO Y MADURACIN DEL GRANO DE POLEN DE TOMATE

P. JOVEN NUCLEOLO VEGETATIVO

P. MEDIO

P. MADURO No se observa

NUCLEOLO GENERATIVO

No se observa

No se observa

CROMATINA N VEGETATIVO

- grado de descondensacin: +++

- grado de descondensacin: +++

- grado de descondensacin: +

CROMATINA N GENERATIVO

- grado de condensacin: +

- grado de condensacin: ++

- grado de condensacin: +++

DISCUSIN 5.3_ ONTOGENIA Y DESARROLLO DE LA PARED DEL GRANO

Una estructura tan compleja como es la pared del grano de polen, despierta inters desde el punto de vista biolgico en relacin con su ontogenia y diferenciacin. Son numerosos los estudios realizados sobre el desarrollo de la pared del polen de diferentes especies vegetales: Parkinsonia aculeata (Larson y Lewis 1962); Poa (Rowley 1962); Lilium (Heslop-Harrison 1968); Endymium non-scriptus (Angol 1967); Lilium longiflorum (Dickinson 1970); Lilium (Rodrguez-Garca y col. 1983); Olea europaea (Fernndez y Rodrguez-Garca 1988, 1989); Tragopogon porrifolius (Blackmore y Barnes 1987), entre otros. Nuestros estudios se inician en el estadio de tetradas, donde las microsporas se encuentran rodeadas por una pared de calosa hasta que el grano de polen est maduro y listo para germinar. Este perodo abarca la formacin y desarrollo de la pared del polen.

Durante el perodo de tetradas se inicia la formacin de la pared del polen. Lo primero que se forma es la primexina en tetradas muy jvenes, estando situada entre el plasmalema y la calosa (Heslop-Harrison 1963a). Esta pared inicial tambin se le ha atribuido una semejanza con el "glicocalix" de las clulas animales (Rowley y Skvarla, 1975). Se trata de una matriz de naturaleza celulsica (Heslop-Harrison 1968 a,c) en donde se disponen los primeros elementos de la exina: probculas y protectum. En la formacin de la primexina de algunas especies parecen intervenir vesculas originadas por el aparato de Golgi (Dickinson 1970; Rodrguez-Garca y col. 1983). En el tomate no se han observado vesculas

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DISCUSIN de Golgi en relacin con la primexina. Esto puede ser debido a que la formacin de la primexina tenga lugar en un tiempo muy corto y la probabilidad de encontrara ese estadio es muy pequea. Pero por otro lado tambin hay que tener en cuenta que los dictiosomas observados en la joven tetrada del tomate presentan poca actividad, por lo que tambin puede ser que sea otro tipo de mecanismo el que tiene la clula para formar esta pared. Actualmente se desconoce de donde proviene la informacin que determina el "patrn" o "plantilla" de la estructura de la exina, aunque parece haber pruebas a favor de un origen esporoftico (Dickinson y Sheldom 1986). El ncleo diploide es el que contiene esta informacin como lo demuestra la existencia de microsporas sin ncleo en el caso de meiosis aberrantes, y que sin embargo presentan una exina perfectamente estructurada (Heslop-Harrison 1968a,b). Son varias las hiptesis propuestas en cuanto a como se determina la estructura de la exina. Por un lado se ha propuesto a la pared de calosa como un molde negativo que lleva impresa la "plantilla" de la exina (Waterkeyn, y Bienfait 1970). Por otro lado se le ha atribuido un posible papel a cisternas de retculo endoplsmico orientadas perpendicularmente al plasmalema y que se encuentran en relacin con el lugar donde se desarrollarn las bculas (Godwin 1968a, b; Vasil 1973 ; Majeswka y col. 1992). Tambin se ha encontrado acumulacin de ribosomas debajo del plasmalema en los sitios de las bculas (Fernndez 1986; Alch 1991). En el caso del tomate, es esta acumulacin ribosmica la que hemos observado.

El desarrollo de la exina durante el perodo de tetrada ha sido ampliamente

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DISCUSIN estudiado (Skvarla y Larson 1966; Heslop-Harrison 1968c; Sheldom y Dickinson 1983, Fernndez y Rodrguez-Garca 1988a). La cuestin en la que aun no se ponen de acuerdo los autores es si la pared de calosa es una barrera impermeable que impide el paso de material del tapetum hacia la pared (Heslop-Harrison y Mackenzie 1967; Sheldom y Dickinson 1983), o por el contrario, el paso de sustancias a travs de la calosa es posible (Southworth 1973; Mascarenhas 1975, Rodrguez-Garca y Majewska 1992), y por tanto no hay impedimento para que el tapetum contribuya a la formacin de la pared en este estadio. En el tomate, la presencia de material denso dentro de la calosa de aspecto similar al que constituye las bculas y el tectum, est a favor de esta segunda posibilidad. Una vez que las microsporas son liberadas de la pared de calosa, el engrosamiento y desarrollo de la pared se debe claramente a la deposicin de materiales procedentes del tapetum (Risueo y col 1969; Blackmore y Barnes 1990). En el tomate y mediante el uso de la tcnica del PTA (Stockert y col. 1989) observamos en estadios jvenes de desarrollo (microspora recin liberada y media), como se deposita material de aspecto globular en la superficie externa de la pared, el cual se tie de igual forma que otras estructuras similares contenidas en el tapetum. Todo esto sugiere un traspaso de sustancias desde el tapetum hacia la exina. La exina del tomate al igual que otros plenes muestra dos capas claramente diferenciadas: ectexina y endexina. Una caracterstica a destacar en el caso del tomate es la ausencia de capa basal en la ectexina. En estudios sobre la pared del polen del tomate, se describe a la capa basal como discontinua (Fernndez y col. 1992). Sin embargo ms que una capa discontinua, en nuestra opinin, se trata de

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DISCUSIN un ensanchamiento de las bculas o columelas en su parte basal. La falta de esta capa basal junto con la existencia de un tectum atravesado por microcanales, dota al polen de un alto grado de flexibilidad en su pared, facilitando los movimientos de adaptacin de la ectexina sobre la endexina. Por otro lado, la presencia de gran cantidad de estructuras lamelares o "white line" en la endexina, tambin aumenta la elasticidad (Rowley 1964). Todas estas caractersticas aqu expuestas hacen que las zonas interaperturales de la pared jueguen un papel muy importante en los cambios de volumen del grano.

La intina es la pared del polen que presenta caractersticas y naturaleza propias de una pared celular. El inicio de su formacin varia desde microspora (Mattson 1979; Owens y Dickinson 1983) hasta polen bicelular (Rowley 1976) segn las especies. El tomate comienza la formacin de la intina como en la mayora de las especies en el estadio de microspora vacuolada. Mediante el uso de tcnicas citoqumicas, como son la tcnica de Thiery (Bernhard 1969) y la tincin con PTA (Stocker y col. 1989) es posible comprobar la naturaleza polisacardica y glicoproteica de esta capa de la pared, as como la implicacin en su formacin de vesculas citoplsmicas portadoras de precursores polisacardicos.

Las aperturas del polen (Erdtman 1947) son consideradas como una regin especializada del esporodermo, ms delgada que el resto y que difiere en estructura y/o en su ornamentacin. Sin embargo esta definicin responde a

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DISCUSIN estudios morfolgicos orientados hacia la taxonoma. La visin que hoy en da se tiene de las aperturas del grano es mucho ms dinmica. Gracias a estudios ontognicos y de desarrollo se sabe que las aperturas son estructuras que sufren grandes cambios a lo largo de la maduracin del polen (Fernndez y RodrguezGarca 1988b). No se puede hablar de apertura sin tener en cuenta la diferenciacin que presenta la intina en esta regin en forma de lente u oncus, con tubulaciones dentro de una matriz fibrilar. Este oncus juega un papel fundamental en la funcin principal de las aperturas como es la germinacin. La presencia de protenas en estas tubulaciones ha sido postulada y demostrada por algunos autores (Knox y Heslop-Harrison 1969). Estas protenas estn relacionadas con fenmenos de reconocimiento y compatibilidad e incompatibilidad polen-estigma (Knox y Heslop-Harrison 1969; Kress 1986; Blackmore y Barnes 1990). Otra de las funciones de las aperturas de los granos de polen es la de facilitar los cambios de volumen que estos pueden sufrir. Esta funcin en el caso del tomate, puede estar limitada a la zona del colpo donde la exina es ms delgada y la endexina ms gruesa, ya que en la zona ecuatorial del colpo donde se encuentra el puente de ectexina, no seria posible un plegamiento de la pared hacindola ms rgida en esta zona. Sin embargo esto no evita que la apertura acte como un sistema harmomgata (Blackmore y Barnes 1986). Previo a la germinacin del tubo polnico en el estigma es necesario la polinizacin. Esta puede variar segn sea el agente transportador: anemfilo (aire), zofilo (animales) entomfilo (insectos), hidrfila (agua). En los plenes entomfilos se ha descrito que la exina tiene una cubierta de material lipdico procedente del

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DISCUSIN tapetum, que le confiere a los plenes la capacidad de adherirse a los insectos. Este material es conocido en la literatura como "pollenkitt" (Knoll 1930; HeslopHarrison 1968a,b; Hesse 1977; Paccini y Juniper 1979). El polen de tomate es entomfilo y sin embargo hay que sealar que nosotros no hemos encontrado "pollenkitt" ni cualquier otro material o restos de tapetum que rodeen o cubran la pared del polen. Por lo que se trata de un dato interesante que habr que tener en cuenta cuando se hable de la funcin del "pollenkitt" en relacin con la polinizacin.

La presencia de elementos inorgnicos en la pared del polen, al igual que en el tomate, tambin ha sido indicada en otras especies (Cercenau-Larrival y Derouet 1988). No es de extraar que existan elementos que actan como cofactores dada la elevada actividad que tiene lugar en la superficie del polen: tanto durante la germinacin, como en las reacciones de compatibilidad e incompatibilidad. Incluso se ha sugerido una posible relacin entre la presencia de determinados elementos inorgnicos, como es el caso del potasio y los caracteres alergnicos que presentan ciertos plenes (Cercenau-Larrival y Derouet 1988). Sin embargo el potasio es uno de los elementos detectados en la pared del polen de tomate, especie de la que no se conoce hasta ahora ningn tipo de reaccin alergnica.

El paso de material a travs de la pared del grano de polen ha sido demostrado en diferentes especies utilizando diversas sustancias marcadoras: lantano (Rowley 1976; Fernndez y Rodrguez-Garca 1990); hierro coloidal, (Rowley y Dunbar

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DISCUSIN 1970); peroxidasa exgena y ferritina (Rowley 1975). Como resultado de estos estudios se han descrito varias vas de penetracin de material hacia el interior del grano: microcanales, apertura y/o directamente a travs de los material de la exina (Rowley y Flynn 1971; Rowley 1975; Fernndez y Rodrguez-Garca 1990). Nuestros resultados con el polen de tomate son muy similares a los previamente obtenidos en el polen del olivo (Fernndez y Rodrguez-Garca 1990). La va de entrada de este material varia segn sea el estadio de desarrollo del grano. Las diferencias se hacen ms patentes en el polen maduro por la no utilizacin de la aperturas como vas de paso, as como por la disminucin generalizada de entrada de lantano a travs del resto de la pared. Posiblemente el grano de polen maduro, ya no necesita que el tapetum o el lculo de la antera le suministren material y ello coincide con que las estructuras implicadas en este paso, las tubulaciones del oncus de la intina, ya estn preparadas para otra funcin como puede ser el transporte de protenas necesarias para la germinacin. Adems el hecho de que la apertura no presente ninguna seal de lantano, tambin corrobora el que en estadios prximos a la germinacin la direccin del flujo de material se haya invertido, siendo ahora dirigida desde el citoplasma hacia el exterior del grano (Fernndez y Garca 1990). Como es sabido el lantano no tiene capacidad para atravesar las membranas (Revel y Karnovsky 1967; Leonard y col. 1975; Taylor y Hall 1978). Ello implica que el paso tiene lugar mediante un mecanismo de pinocitosis. La presencia de precipitado de lantano en el interior de pequeas vesculas dispersas por el citoRowley y col. 1987; Abadie 1988;

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DISCUSIN plasma del grano de polen de tomate, apoyan esta hiptesis. La endocitosis es uno de los mecanismos de los que se vale el grano para tomar material del exterior una vez que este ha pasado a travs de la pared, siempre y cuando este material no pueda atravesar el plasmalema. Las experiencias del lantano en medio de cultivo, previamente a su fijacin, demuestran que los resultados eran repetitivos incluso variando las condiciones. En este caso el paso de lantano se parece ms a lo que ocurre en condiciones fisiolgicas ya que la fijacin es posterior a la incorporacin del lantano al medio. Los resultados nos confirman que el paso de sustancias del exterior a travs de la pared del grano es una realidad.

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DISCUSIN 5.4- MICROCUERPOS: ACTIVIDAD CATALASA, PEROXIDASA Y OXIDASA

El grano de polen maduro contiene una elevada cantidad de sustancias de reserva las cuales son utilizadas durante la germinacin como fuente de energa. Es un hecho bien conocido que la conversin de lpidos hasta azcares depende de la cooperacin entre glioxisomas (microcuerpos), cuerpos lipdicos, mitocondrias y citoplasma, segn ha sido estudiado en semillas oleaginosas (Beevers 1980; Wiskichad y Dry 1985). Sin embargo son escasas las referencias en cuanto a la presencia de microcuerpos en el grano de polen (Clarke y Steer 1983; Pais y Fejioo 1986, 1987; Charzynska 1989). Actividad peroxidsica ha sido citoqumicamente detectada en el polen de algunas gimnospermas (Wrobel y Gorska-Brylass 1988). Ms recientemente ha sido estudiada mediante la utilizacin de mtodos bioqumicos la expresin de genes de catalasa en el polen maduro de maz (Acevedo y Scandalios 1990). La falta de evidencias morfolgicas acerca de la existencia de microcuerpos en el grano de polen de tomate, nos ha llevado a la utilizacin de tcnicas citoqumicas para la deteccin de marcadores bioqumicos propios de microcuerpos: catalasas, peroxidasas y oxidasas. La tcnica de la DAB permite la identificacin de estructuras que contienen catalasa y peroxidasa funcionales. Segn nuestras observaciones la reaccin positiva a la DAB se localiza en la superficie de cuerpos osmifilos en estrecho contacto con cisternas de REr que los

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DISCUSIN rodean, as como en el interior de estos cuerpos, lo cual nos sugiere que esta reaccin sea debida a la actividad catalsica y/o a la actividad peroxidasa. Cuando utilizamos como inhibidor al AT la actividad catalsica se ve prcticamente inhibida (Recheigl y Evans 1963; Drumm 1970). Por esta razn la presencia de precipitado fino en la zona central de los cuerpos lipdicos seria producto de actividad peroxidasa. Cuando el control se realiz incubando el material en un medio que slo contena DAB (sin H2O2) las peroxidasa quedan inhibidas al no tener sustrato (H2O2) sobre el que actuar (Vigil 1970), mientras que las catalasas si son activas. En este caso el precipitado que se localiza en la periferia de los cuerpos lipdicos correspondera a la actividad catalasa. Estos resultados muestran que la catalasa no est localizada en ningn compartimento, sino en el citoplasma estrechamente relacionado con cisternas de retculo y cuerpos lipdicos. Esto coincide con las hiptesis de Goldman y Blobel (1978) quienes sugieren que tanto catalasa como otras enzimas peroxisomales son sintetizadas en el citosol a nivel de polisomas. Tambin Sautter (1989) indica la presencia de catalasa a nivel de RE. Los resultados obtenidos con la tcnica de la DAB estn en lnea con los estudios preliminares realizados en el tomate mediante inmunodeteccin de catalasa, los cuales indican una localizacin de esta enzima a nivel de ribosomas asociados a retculo endoplsmico rugoso (resultados no mostrados). En investigaciones realizadas sobre glioxisomas de cotiledones de sanda (Wanner y col. 1982) se muestra una estrecha relacin entre cuerpos lipdicos y RE. Los lpidos comienzan a ser rodeados por cisternas de RE y gradualmente van siendo

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DISCUSIN metabolizados, dando lugar a un compartimento denominado glioxisoma.

El precipitado de los cuerpos osmifilos con la DAB tambin coincide con los resultados obtenidos mediante la tcnica del cerio para detectar xantina oxidasa (Angermller y col. 1987). Algunas clulas transforman mucho del O2 que ellas consumen en in superxido (O2), el cual puede iniciar la peroxidacin de lpidos (Ibrahim y Stoward 1978). Existen evidencias claras de que la xantina oxidasa es la principal enzima que cataliza la formacin del in superxido, siendo por tanto, un buen marcador de la peroxidacin de los lpidos (Mead 1976). Los resultados obtenidos en nuestro material indican su presencia en el interior de los lpidos posiblemente para ayudar a su metabolizacin.

En resumen, en el grano maduro de polen de tomate no hemos observado estructuras que respondan a las caractersticas morfolgicas de microcuerpos. Sin embargo se detecta claramente la existencia de actividad enzimtica de naturaleza peroxidasa, catalasa y oxidasa relacionada ntimamente con cuerpos lipdicos. La semejanza de nuestras observaciones con los resultados obtenidos por Wanner y col. (1982) sobre la ontogenia de glioxisomas de cotiledones de sandia, en los que se muestra una implicacin directa del RE y cuerpos lipdicos en la ontogenia de estos microcuerpos, nos hace pensar en la posibilidad de que hayamos estudiado una fase previa en la formacin de estas organelas.

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CONCLUSIONES

Conclusiones:
De los estudios realizados sobre el desarrollo del polen de tomate hemos sacado las siguientes conclusiones: 1- El citoplasma sufre una repoblacin gradual durante el desarrollo del grano. El retculo endoplsmico presenta una gran proliferacin pasando de estar ausente en la joven microspora, a estar constituido por numerosas cisternas de una gran longitud en el polen maduro.

2- El nucleolo, maquinaria celular de la biognesis de ribosomas, tambin experimenta cambios estructurales que estn de acuerdo con la informacin bioqumica disponible sobre la sntesis de RNA. Durante la interfase de la microspora la estructura nucleolar muestra una activacin gradual, alcanzando su mxima actividad en la microspora vacuolada. En el grano de polen el nucleolo vegetativo, tambin muestra una estructura activa pero ligeramente menor que la microspora vacuolada. Esta estructura se mantiene hasta el grano de polen maduro en el que llega a desaparecer. En cambio el nucleolo generativo pasa de un estado muy poco activo a su desaparicin en fases tempranas del grano de polen, como corresponde una clula en la que la sntesis de RNA es mnima.

3- Las mitocondrias experimentan un aumento de tamao a lo largo del perodo de microspora para disminuir a partir del polen bicelular joven. Al mismo tiempo se aprecia un mayor nmero de las mismas, lo cual indica que las mitocondrias tienen al menos un ciclo de divisin. Tambin se observa una degeneracin de las mitocondrias, mientras que la poblacin mitocondrial se mantiene lo cual implica la divisin de estas organelas.

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CONCLUSIONES

4- El inicio de sustancias de reserva, almidn y cuerpos lipdicos, se visualiza hacia el final de la microspora vacuolada y alcanza su mxima representacin en el grano bicelular medio-maduro. En el polen ya maduro se observa una desaparicin del almidn y se inicia la metabolizacin de los cuerpos lipdicos.

5- No se han encontrado orgnulos con caractersticas morfolgicas propias de microcuerpos que pudieran estar implicados en la metabolizacin de sustancias de reserva. Sin embargo, si se ha detectado citoqumicamente, actividad catalasa, peroxidasa y oxidasa a nivel de cuerpos lipdicos y del citoplasma que los rodea. Esto unido a la estrecha relacin que presentan las cisternas de retculo endoplsmico rugoso con los cuerpos lipdicos, nos sugiere que ambas estructuras pueden estar envueltas en la ontogenia de microcuerpos (de manera anloga a como ha sido propuesto en cotiledones de sanda (Wanner, 1982).

6- La pared del polen del tomate presenta unas caractersticas peculiares: columelas muy cortas y macizas, tctum ancho y casi continuo atravesado por microcanales y ausencia de capa basal, por lo que las columelas se insertan directamente en la endexina, la cual contiene gran cantidad de estructuras lamelares. Todos estos rasgos dotan a la pared de una gran flexibilidad, permitindola controlar los cambios de volumen producidos por los efectos de la desecacin-hidratacin del grano como consecuencia de las oscilaciones de temperatura a las que puede estar sometida esta especie. 7- Se ha demostrado que la pared del polen no es una barrera que impide el paso de materiales a travs de ella. Las vas de paso varan y dependen del estadio de desarrollo del grano. En estadios ms jvenes, estas vas son microcanales de la exina y aperturas, mientras que en el estadio de polen maduro el paso slo se realiza a travs de la exina ya que las aperturas estn preparadas para otra funcin: la germinacin

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