ARTCULO DE INVESTIGACIN

Evaluacin de la transferencia de oxgeno en cultivos con lactococcus lactis empleando un sistema de fermentacin con aireacin externa
Evaluating oxygen transfer in a Lactococcus lactis cultures using an external aeration fermentation system (EAFS)
Andrea Soler1, Gustavo Buitrago H2

Resumen En fermentaciones aerobias el oxgeno, como aceptor terminal de electrones en el proceso de respiracin, comnmente se constituye en limitante debido entre otros factores al diseo del biorreactor (factores geomtricos), a las condiciones de operacin de los fermentadores (condiciones ambientales requeridas en el cultivo, potencia transferida al cultivo por el sistema de agitacin, propiedades del medio lquido), demanda de oxgeno por parte del microorganismo, sistema de aireacin (concentracin de oxgeno en el gas, solubilidad del oxgeno). La limitacin de oxgeno se refleja en la fermentacin con Lactococcus lactis cepa IBUN 34.1, en que presenta una baja disponibilidad de oxgeno desde muy temprano en la fase exponencial del cultivo. Para superar estas limitaciones se dise y desarroll un sistema de suministro de oxgeno de alta tasa de transferencia, consistente en un sistema de fermentacin con aireacin externa (SFAE), el cual es comparado en este trabajo con el sistema tradicional de fermentador agitado dotado con dos turbinas tipo Rushton y aireacin por difusor interno. En este trabajo se evala la operacin del SFAE, se seleccionan y estudian algunas variables operacionales y su efecto sobre la transferencia de oxgeno gas-lquido. Los resultados indican que las variables que tienen efecto significativo sobre el coeficiente volumtrico global de transferencia de masa kLa son la agitacin y el flujo de medio de cultivo que circula por el aireador externo denominado flujo de recirculacin. Los valores de kLa obtenidos indican que con el fermentador convencional con aireacin interna el mayor valor de kLa alcanzado fue de 40,68 (h-1), en tanto que con el SFAE se alcanzaron valores de 63,18 (h-1). Palabras clave: biorreactores, kLa, transferencia de oxgeno, fermentaciones aerbicas, transferencia de masa gas-lquido.

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Ingeniera qumica Msc., Instituto de Biotecnologa, Universidad Nacional de Colombia. apsolerg@[Link] Ingeniero qumico Msc., Instituto de Biotecnologa, Universidad Nacional de Colombia. gbuitragoh@[Link]

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Abstract Oxygen as final electron acceptor in respiration in aerobic fermentations is commonly a limiting factor due to its low solubility in aqueous solutions, bioreactors geometric factors and operating characteristics, liquid media properties, oxygen concentration in gas supply, microorganisms characteristics, environmental culture conditions, power supply by agitation system, etc. Oxygen limitation is present in cultures using the IBUN 34.1 Lactococcus lactis strain where oxygen availability is low some minutes after the exponential phase starts. A high transfer rate oxygen supply system was thus designed to overcome such limitations; it consisted of an external aeration fermentation system (EAFS) which was compared in this work with a conventional agitated tank fermenter equipped with two Rushton turbines and internal diffuser aeration flute mechanism. This paper evaluates the EAFS; some operational variables were selected and studied as well as their effect on oxygen transfer. Our results showed that agitation and culture medium flow through the aerator (called external recirculation flow) were the variables having the main effect on overall volumetric mass transfer coefficient (kLa). The highest kLa value in the conventional bioreactor having internal aeration was 40.68 kLa (h-1), while EAFS reached 90 (h-1). Key words: Bioreactor, kLa, oxygen transfer, aerobic fermentation, gasliquid mass transfer.

Recibido: marzo 8 de 2010

Aprobado: noviembre 3 de 2010

Introduccin
En cultivos con Lactococcus lactis cepa IBUN 34.1 se presenta limitacin de oxgeno (Vanegas, 2006; Galaction et al., 2004) a las condiciones de operacin que proveen fermentadores convencionales. En estos biorreactores el coeficiente volumtrico global de transferencia de masa (kLa) es el parmetro de mayor relevancia en el diseo y la operacin, dependiendo de una gran cantidad de factores, por ejemplo, de la velocidad de agitacin que modifica el rgimen de turbulencia y disminuye el tamao de burbuja. Sin embargo, el consumo de energa es proporcional a la velocidad a la tercera potencia y al dimetro del agitador a la quinta potencia (Calderbank y Moo-Young, 1961; Bandaiphet y Prasertsan, 2006; Rushton et al., 1950), incidiendo en el costo de operacin. Adicionalmente, debe tenerse en cuenta que altas velocidades de agitacin tienen una influencia negativa en la productividad de complejos enzimticos, debido al efecto de los esfuerzos de corte sobre el cultivo (Bandaiphet y Prasertsan, 2006; Kwon et al., 1996). Otros factores que afectan la transferencia de oxge-

no son las caractersticas geomtricas y operacionales de los recipientes de fermentacin, la composicin del medio de cultivo, la viscosidad, la tensin superficial, la concentracin de oxgeno en la corriente de gas, la morfologa del microorganismo y el rea superficial que proveen las burbujas. Es por esto que el kLa es un parmetro que determina tanto el escalado de las fermentaciones aerobias como la estructura de costos en fermentadores convencionales (Gaddis, 1999). En estos biorreactores, el kLa se puede calcular por un gran nmero de ecuaciones empricas y por ecuaciones tericas (Galaction et al., 2004; Kawase et al., 1992), unas y otras muestran que la viscosidad incide drsticamente sobre los valores de kLa. La eficiencia en la aireacin de un sistema fermentativo depende de la solubilidad del oxgeno, la velocidad de difusin en los medios de cultivo, la demanda de oxgeno del cultivo y la capacidad del biorreactor de satisfacer dicha demanda en la poblacin microbiana. La concentracin de oxgeno disuelto en los medios de cultivo depende de la velocidad de consumo (oxygen uptake rate, OUR) de las clulas y de la 125

Evaluacin de la transferencia de oxgeno en cultivos con lactococcus lactis

velocidad de transferencia del mismo (oxygen transfer rate, OTR). La OTR depende del coeficiente de transferencia de oxgeno kLa y del gradiente entre la concentracin de equilibrio y la concentracin actual en el lquido, e incide sobre los ndices de productividad y los rendimientos (Zhang y Thomas, 1996; Kawase et al., 1992; Garca y Gmez, 2005).

Metodologa Microorganismo
El microorganismo empleado en este estudio es el Lactoccoccus lactis, bacteria gram positiva, mesfila, perteneciente a la familia Streptococaceae, aislado y catalogado como cepa IBUN 34.1, depositada en el banco de germoplasma del Instituto de Biotecnologia de la Universidad Nacional de Colombia (IBUN).

Fermentador convencional. Se emple un fermentador Biolab con un recipiente de vidrio de 1,6 L de volumen de operacin y dimetro 117 mm, equipado con dos turbinas Rushton de 56 mm de dimetro separadas 56 mm entre s y del fondo del recipiente a la primera turbina; cuenta con un difusor de gas del tipo flauta en L con 5 orificios al que se suministra aire a presin y filtrado (tabla 1). El biorreactor est equipado con medidores de pH, oxgeno disuelto (electrodo polarogrfico InPro6800/12/220, Mettler, Toledo), controlador de temperatura y controlador de la velocidad de agitacin. El fermentador se inocula con 50 mL de inculo, el cultivo se mantiene a 30 C y el pH inicial se ajusta en 7,0. El pH y el oxgeno disuelto (OD) no se controlan durante el cultivo. La agitacin y aireacin se fijan segn el rgimen por experimentar.
Tabla 1. Caractersticas del biorreactor y el impulsor Dimensiones
Dimetro impeler Da Dimetro del tanque Dt Altura del impeler E Ancho hoja del impeler L Alto hoja del impeler W Sin bafles J Altura lquido H

Medio de fermentacin e inculo

El medio de cultivo utilizado en los ensayos (Vanegas, 2006) contiene sacarosa 30 g/L, extracto de levadura 20 g/L, K2HPO4 20 g/L, CaCl2.H2O 0,066 g/L, MgSO4.H2O 0,023 g/L, MnSO4.H2O 0,011 g/L y agua destilada c.s.p 1 litro. Para la caracterizacin hidrodinmica tanto de la configuracin tradicional del reactor, como para el sistema con el aireador externo, se emple agua como medio. El inculo se prepar en 50 mL de medio de cultivo contenidos en un Erlenmeyer de 250 mL al cual se adicionan 40 L de la cepa suministrada. El inculo se mantuvo a 30 C y 200 rpm por 12 h, al cabo de las cuales se verific un crecimiento microbiano que corresponda a una densidad ptica mayor a 0,6, medida a 600 nm (Vanegas, 2006).

Valor (mm)
56 117 56 19 16,5 0 88 (1 litro); 110 (1,2 litros)

Sistema de fermentacin con aireador externo. Se emple el fermentador convencional Biolab, con las siguientes adaptaciones (figura 1): Se elimina el difusor interno.

Biorreactor
En este trabajo se comparan los valores de kLa obtenidos en un fermentador convencional con aquellos obtenidos en el SFAE propuesto. 126

Se adaptan puertas de entrada y salida de medio, desde el fermentador hacia el aireador externo y el retorno al fermentador.

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Figura 1. Configuracin del sistema de fermentacin con aireador externo.

El medio es impulsado por una bomba peristltica. El aireador externo (figura 2) consta de un difusor de micro burbujeo de 17 cm de largo y 1 cm de dimetro fabricado en acero sinterizado, en este dispositivo se pone en contacto la fase lquida con la corriente de aire, en circulacin paralela, y retorna al fermentador agitado. El uso de microburbujeadores en tanques agitados se recomienda para microorganismos sensibles al estrs mecnico, debido a que incrementa el rea entre las fases gas-lquido, reflejndose en posibles reducciones en el flujo de aire y en las velocidades de agitacin (Cockx et al., 1995). Se seleccion este tipo de difusor en el sistema de fermentacin con aireador externo (SFAE) por proveer tamaos de burbuja reducidos y grandes reas superficiales de contacto con la fase lquida, caractersticas que pueden ejercer un efecto favorable. El diseo del (SFAE) tiene como propsito aumentar la transferencia de oxgeno, descrita y analizada por medio del coeficiente volumtrico global de transferencia de masa (kLa). El

SFAE diseado (figura 1) incorpora un aireador externo que emplea un microburbujeador de acero sinterizado que provee una amplia rea interfacial gas-lquido, el cual se instala en una unidad de contacto a la que llega una lnea de flujo de recirculacin y la lnea de suministro de aire. En el aireador externo se puede incrementar la presin por encima de la presin atmosfrica, de esta manera se incrementa la concentracin de equilibrio del oxgeno en el medio lquido. El incremento de presin est limitado por la capacidad del microorganismo de soportar estas presiones.

El SFAE evaluado es un sistema de fermentacin con una alta velocidad de transferencia de oxgeno que no presenta limitacin del mismo en la fermentacin con el Lactococcus lactis IBUN 34.1, diferencindose sustancialmente de los sistemas de fermentacin convencionales, agitados y con difusor de aire del tipo burbujeador. Por las caractersticas del SFAE, presenta ventajas que lo hacen promisorio para ser utilizado en fermentaciones extractivas, en cultivos altamente sensibles a esfuerzos de corte, en cultivos con clulas inmovilizadas, entre otras aplicaciones potenciales. 127

Evaluacin de la transferencia de oxgeno en cultivos con lactococcus lactis

condiciones de operacin con el fin de alcanzar una mayor transferencia de oxgeno: 1. Empleo de SFAE bajo condiciones controladas de flujo y presin (Soler, 2009). 2. Incrementos de la presin en el aireador externo para modificar la solubilidad del oxgeno en el medio de cultivo (Pinheiro y Mota, 2000), la so-

SFAE, en este trabajo se plantea estudiar tres

Teniendo en cuenta las caractersticas del

lubilidad y la difusividad son funcin directa de la presin en el sistema. La determinacin de las condiciones de operacin en el aireador externo propuesto estn afectadas por la capacidad de las clulas de soportar estrs oxidativo o mecnico (Kwon et al., 1996), factor que se evaluar experimentalmente. 3. Variacin del tiempo de contacto entre el aire y el medio de cultivo (Soler, 2009).

Figura 2. Aireador externo, despiece y ensamble.

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Evaluacin de los cultivos

El seguimiento de la fermentacin se realiza determinando biomasa por densidad ptica a 600 nm, tomando lecturas de pH y de OD como porcentaje de saturacin (Vanegas, 2006; Soler, 2009). Determinacin del kLa cuando se emplea agua como medio. En esta caracterizacin del SFAE se emple el mtodo esttico en la estimacin de los valores de kLa (Gaddis, 1999; Galaction et al., 2004). Este mtodo presenta como ventaja que puede aplicarse para diferentes medios de cultivo y los resultados corresponden a condiciones en que no hay consumo de oxgeno. El mtodo esttico consiste en medir la velocidad de incremento de la concentracin de oxgeno disuelto en el medio; previamente se reduce esta concentracin hasta valores cercanos a cero, haciendo pasar nitrgeno gaseoso por el sistema durante al menos 20 min. Se suspende el flujo de nitrgeno y se inicia la aireacin a las condiciones de operacin establecidas (velocidad de agitacin y velocidad de aireacin). El oxgeno disuelto se midi empleando un electrodo polarogrfico con cartucho de membrana reemplazable InPro6800/12/220 (Mettler, Toledo). Las curvas obtenidas por este mtodo se ajustan a la ecuacin (1), de velocidad de trans-

ferencia, y se determina el coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno kLa para cada condicin experimental.

C * C = exp(k L a * t ) C * C t = o

(1)

Determinacin del kLa en cultivos empleando la tcnica dinmica (Kawase et al., 1992; Zhang y Thomas, 1996; Montes et al., 1998). Cuando el cultivo se encuentra en fase exponencial de crecimiento, se suspende el suministro de aire permitiendo que se reduzca la concentracin de oxgeno disuelto hasta un valor cercano a la concentracin crtica, en este momento se permite la reaireacin bajo las condiciones de operacin evaluadas, obteniendo curvas como la descrita en la figura 3. Las curvas obtenidas fueron modeladas en la zona I para la determinacin de la demanda de oxgeno OURx, y en la zona II, integrando la expresin para la zona de reaireacin para calcular el kL a en una ecuacin de la forma:
CL= A+B exp(t) = %OD (2)

En esta ecuacin A y B son constantes, es una constante que corresponde a - kLa. El ajuste de los datos experimentales a la ecuacin se realiz con ayuda del programa Data Fit 9 (Oakdale Engineering, versin libre, 2002).

Figura 3. Curva caracterstica para la determinacin del valor de k La por el mtodo dinmico para cada condicin de fermentacin evaluada.
Evaluacin de la transferencia de oxgeno en cultivos con lactococcus lactis

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Esta tcnica presenta algunas restricciones tales como la dependencia del tiempo de respuesta del electrodo de oxgeno disuelto, el cual debe ser menor a 1/kLa, en el presente trabajo se verifica que el electrodo cumpla esta condicin.

Diseo experimental
Para el desarrollo de la evaluacin hidrodinmica del sistema de aireacin externo se plante el modelo factorial no balanceado de efectos fijos (Montgomery, 1997) correlacionando las variables que afectan las condiciones de trasferencia de oxgeno con el kLa. Se

seleccionaron dos factores, el flujo de recirculacin del lquido (FR) y flujo de aire (FA), y tres covariables, la presin manomtrica en el difusor (PA), la agitacin (A) y la temperatura (T). Para emplear este modelo se establecen las combinaciones totales posibles de los niveles en los factores FA y FR. Para la evaluacin de las covariables (PA, A y T) se tiene en cuenta que desarrollar el modelo completo implicara un total de 128 ensayos, por lo que se opta por sesgar, partiendo de algunas combinaciones iniciales de FR y FA y haciendo la variacin de los parmetros de las covariables una a la vez. La tabla 2 corresponde las condiciones evaluadas en los experimentos realizados de acuerdo con la metodologa de diseo experimental.

Tabla 2. Diseo experimental para evaluar el SFAE: factores (FR y FA) y covariables (agitacin, presin manomtrica en el difusor y la temperatura)
Corrida 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 FR (CPM) 1,73 1,30 0,87 0,45 1,73 1,30 0,87 0,45 0,45 0,87 0,45 0,45 0,45 0,45 0,45 FA (vvm) 0,65 0,65 0,65 0,65 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 0,65 0,65 0,65 0,65 0,65 Agitacin (CPM) 154 154 154 154 154 154 154 154 283 283 154 154 154 154 154 Presin (psi) 3 2 0 0 4 3 0 0 0 0 10 15 20 0 10 Temperatura (C) 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 30 30

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Resultados y anlisis Determinacin del kLa en el fermentador convencional empleando agua

En la tabla 3 se presentan valores obtenidos para el kLa, empleando el fermentador convencional y agua como medio. Los resultados indican que el valor de kLa presenta una alta dependencia con las condiciones de aireacin y agitacin. El valor mximo alcanzando corresponde a las condiciones extremas de 1 volumen de aire/volumen de mediominuto (vvm) y 300 rpm, con un coeficiente de transferencia de 40,68 (h-1). Se determin el tiempo muerto (0,419 s) y el tiempo de respuesta del electrodo de medicin de oxgeno disuelto con el fin de evaluar el criterio de aceptabilidad. Se escogieron las condiciones extremas entre un tiempo de respuesta de 75 (s) y un kLa de 1,13*10-2 s-1(40,68 h-1). La respuesta se considera adecuada si: ( < 1/ kLa), condicin que se cumple por ser = 75 (s) y 1/ kLa = 82 (s).
Tabla 3. Valores de kLa obtenidos para el fermentador convencional al emplear agua y la tcnica de desgasificacin con nitrgeno
Ensayo 0,5 vvm - 200 rpm 1 vvm - 200 rpm 0,5 vvm - 300 rpm 1 vvm - 300 rpm kLa (h-1) 20.16 32.4 28.44 40.68

mentaciones y el comportamiento del pH. En la figura 4 se presentan los resultados para estas condiciones, estos indican que las condiciones de estandarizacin del inculo resultaron adecuadas al obtener una concentracin inicial de biomasa similar en los cultivos. Los resultados muestran que la biomasa final es dependiente de los parmetros evaluados (velocidades de agitacin y aireacin), en los ensayos realizados el mayor valor que se alcanz corresponde a una velocidad de aireacin de 1,75 vvm (volumen de aire por volumen de medio por minuto) y una velocidad de agitacin de 250 rpm (figura 4). El comportamiento del pH en el transcurso de las fermentaciones no se ve afectado para los niveles de aireacin y agitacin evaluados, manteniendo un comportamiento similar en todos los ensayos (figura 4). En todos los cultivos con Lactococcus lactis IBUN 34.1 realizados en la fermentacin convencional, la limitacin de oxgeno persiste an bajo las condiciones extremas, como se observa en la figura 5, donde el porcentaje de oxgeno disuelto llega a cero en la tercera hora de fermentacin, que corresponde a la etapa inicial de la fase exponencial del cultivo. Bajo las condiciones de experimentacin evaluadas para el fermentador convencional, no se logra satisfacer la demanda de oxgeno en el cultivo. Los resultados indican que hay mayor incidencia en la transferencia de oxgeno por cambios en la agitacin al compararlos con cambios en la aireacin. El aumento de la concentracin de biomasa debido al incremento en los niveles de aireacin, indica que efectivamente al mejorar las condiciones de oxigenacin se incrementa la productividad del cultivo.

Determinacin del kLa en cultivos con Lactococcus lactis IBUN 34.1 realizados en el fermentador convencional
Para determinar el efecto de la aireacin y la agitacin en el fermentador convencional de tanque agitado y difusor interno, se evalu la cintica de produccin de biomasa en estas fer-

Evaluacin del sistema de fermentacin con aireador externo (SFAE)

Diseo del aireador externo. En la figura 2 se presenta el aireador externo en despiece y ensamblado y en la figura 1 el diagrama 131

Evaluacin de la transferencia de oxgeno en cultivos con lactococcus lactis

Figura 4. Cinticas de crecimiento y variacin de pH en cultivos con Lactococcus lactis IBUN 34.1 para diferentes niveles de oxigenacin en el fermentador convencional.

Figura 5. Variacin del porcentaje de saturacin de oxgeno disuelto en cultivos con Lactococcus lactis IBUN 34.1 realizados en fermentador convencional.

del SFAE. Los factores que se tomaron para caracterizar este sistema fueron: Flujo de gas (FA) medido en vvm. Flujo de lquido recirculado (FR) medido como nmero de veces que circula el medio contenido en el fermentador por el aireador externo por minuto (CPM). Las covariables seleccionadas fueron: 132 Agitacin (rpm). Presin en el aireador externo (psi). Temperatura (C).

Las variables respuesta fueron: pH Oxgeno disuelto. Biomasa. Coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno kLa. El volumen de medio se mantuvo constante durante los ensayos y la variable independiente fue el tiempo. Caracterizacin hidrodinmica. Esta etapa del trabajo se realiz empleando agua como medio en el fermentador. El error exRev. Colomb. Biotecnol. Vol. XII No. 2 Diciembre 2010 124-138

perimental se determina al realizar la tcnica de medicin del kLa por triplicado en el punto central, correspondiendo a FR (Re/m) 0,87; FA (vvm) 0,65; agitacin (rpm) 176 y temperatura (C) 18, con lo cual se obtuvo un porcentaje de error relativo de 0,6%, suficientemente bajo para asegurar la estabilidad del sistema, en par-

ticular durante la etapa de desgasificacin (zona 1 en la figura 3). La figura 6 muestra la variacin del kLa con el flujo de recirculacin (FR) y con el flujo de aire (FA), y la figura 7 muestra el efecto de la velocidad de agitacin sobre el coeficiente de trasferencia de oxgeno.

Figura 6. Variacin del k La con el flujo de recirculacin y la velocidad de aireacin.

Figura 7. Variacin del k La con la agitacin cuando el flujo de aire es de 1 vvm.

Evaluacin de la transferencia de oxgeno en cultivos con lactococcus lactis

133

Figura 8. Variacin del k La con cambios de presin en el aireador externo para un flujo de recirculacin de 0,45 CPM y un flujo de aire de 0,65 vvm.

En la figura 8 se muestra el efecto del cambio en la presin manomtrica sobre el kLa, se observa una tendencia a incrementar el coeficiente hasta obtener un mximo a una presin manomtrica de 15 psi. Cuando el sistema opera a una presin manomtrica de 20 psi se presenta una disminucin en el kLa que puede explicarse por inestabilidad del sistema, originada en la relacin entre el flujo de recirculacin y el flujo de aire, ya que este ltimo se incrementa con la presin afectando la interfase gas-lquido, indicando que el flujo del lquido es insuficiente para el flujo de aire disponible. La figura 7 muestra el efecto significativo que tiene la agitacin sobre el kLa, indicando la importancia de este factor en el SFAE. Lo observado indica que la disponibilidad de oxgeno en el cultivo depende de la capacidad del fermentador de homogeneizar en la masa contenida el flujo de recirculado que retorna del aireador externo. La tendencia de los resultados en las figuras 6 y 7 indican que el efecto de la agitacin es independiente del flujo de recirculacin. Teniendo en cuenta que en los ensayos con el SFAE se emple un nuevo medidor de oxgeno disuelto, se evala nuevamente el cri134

terio de aceptabilidad por tiempo de respuesta en las condiciones extremas, entre un tiempo de respuesta = 25,9 (s) y el mayor kLa obtenido bajo las condiciones de FR (CPM) 1,73; FA (vvm) 1; agitacin (rpm) 154 y temperatura (C) 18, fue de 0,0251 s-1 que corresponde a un valor de 1/ kLa = 39,84 s; el tiempo muerto medido experimentalmente para el electrodo fue de 1,8 s. La respuesta se considera adecuada si: ( < 1/ kLa), condicin que se cumple.

Evaluacin del sistema de fermentacin con aireador externo en el cultivo con el Lactococcus lactis IBUN 34.1
Anlisis estadstico La tabla 4 presenta el anlisis de varianza que permite determinar los efectos que son estadsticamente significativos. Esta tabla muestra la fuente de variabilidad, los grados de libertad asociados (DF), las sumas de cuadrados del error (Seq SS) ajustadas (Adj SS), y el error cuadrado medio ajustado (Adj MS). Una variable tiene efecto estadsticamente significativo, al 10% de significancia, si su valor p es menor
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a 0,1. Bajo las condiciones de experimentacin se encontr que los dos factores, agitacin (FA) y flujo de recirculacin (FR), afectan significativamente el valor de kLa.

Comportamiento de los cultivos en el SFAE

Las fermentaciones en el SFAE, realizadas de acuerdo con el diseo experimental, presentan curvas de crecimiento caractersticas para el cultivo y niveles de biomasa final similares a los alcanzados en cultivos realizados en el fermentador convencional. En la tabla 5 se presentan los resultados obtenidos para los cultivos, as como los valores obtenidos para la demanda de oxgeno y el kLa. La demanda de oxgeno aumenta a medida que se incrementa la concentracin de biomasa. Los experimentos se realizaron en dos cultivos, los ensayos 1 al 6 en el primero, y en el segundo la rplica del ensayo 6 y los ensayos 7 y 8. La disminucin en la deman-

da de oxgeno que se presenta en los ensayos 4 y 5, puede obedecer a la muerte de parte de la biomasa debida a las sucesivas disminuciones en la concentracin de oxgeno y/o a los cambios en las condiciones de operacin a que se someti el cultivo. El ensayo 6 corresponde a la mayor concentracin de biomasa alcanzada en este primer cultivo, en un valor ubicado en el extremo superior de la fase exponencial. Esta carga acumulativa no afecta la determinacin de cada coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno, puesto que en el modelamiento puntual de la zona de reaireacin la demanda de oxgeno y el kLa son respuestas dependientes de la eficiencia en la transferencia de oxgeno del SFAE. Con el fin de verificar la reproducibilidad entre los ensayos de un lote y el siguiente, se realiza una rplica del ensayo 6 para una concentracin de biomasa que corresponde a la etapa inicial de la fase exponencial, obtenindose un error del 1,6% en la determinacin del kLa, lo que indica que el modelo experimental presenta aceptable reproducibilidad.

Tabla 4. Anlisis de varianza para kLa (h-1), usando el ajuste de las sumas de cuadrados del error SS para los ensayos
DF Fuente de variabilidad Agitacin (rpm) Presin (psi) Temperatura (C) FR (CPM) FA (vvm) Error Total 1 1 1 3 1 7 14 220,73 152,04 416,81 4369,60 90,28 478,51 5727,97 325,96 129,26 29,62 4110,31 90,28 478,51 325,96 129,26 29,62 1370,10 90,28 68,36 4,77 1,89 0,43 20,04 1,32 0,065 0,211 0,531 0,001 0,288 Seq SS Adj SS Adj MS F p

Evaluacin de la transferencia de oxgeno en cultivos con lactococcus lactis

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Tabla 5. Demanda de oxgeno y kLa determinados por la tcnica dinmica en el SFAE

Condiciones de operacin Ensayo FR (CPM) 0,45 Zona I Biomasa (mg/ml) OURx (%OD/s) 0,2428 R2 0,9958 A Zona II

FA
(vvm) 0,65

Presin (psi) 1

B -52,15 -77,08 -60,18 -53,55 -65,54 -64,89 -48,99 -63,53 -56,79

kLa (h-1)

0,8

59,9 87,88 70,47 61,77 74,43 68,33 68,42 81,75 75,15

28,54 46,88 48,84 36,53 45,97 48,10 49,75 63,18 52,92

2 3 4 5 6 6 7 8

0,87 1,30 0,87 1,30 0,87 0,87 1,30 0,87

0,65 0,65 1,00 1,00 0,65 0,65 0,65 0,65

1 3 3 3 10 10 10 14

1,25
1,9

0,4892
0,5527

0,9958
0,9986

2,3
2,8

0,3294
0,3968

0,999
0,9993

3,25
0,75

0,5424
0,4458

0,995
0,996

2,2 3,46

0,4373 0,5315

0,998 0,997

Los valores de kLa obtenidos por el mtodo dinmico concuerdan con los resultados de la etapa anterior, las variables que tienen mayor incidencia sobre este coeficiente son el flujo de recirculacin FR y la presin. Con el propsito de validar este resultado se realiza una fermentacin con el SFAE, seleccionando como condiciones de operacin un nivel medio que aporte un valor de kLa mayor a los obtenidos en el fermentador convencional. De esta manera, se seleccionaron las condiciones que corresponden al ensayo 6 y se desarroll la fermentacin. Adicionalmente, se desarroll una fermentacin con los niveles ms bajos en las variables estudiadas (FR y FA). Como se observa en la figura 9, los resultados obtenidos para estos ensayos presentan curvas de crecimiento similares a las obtenidas con el sistema convencional, y no presentan diferencias significativas para las condiciones 136

evaluadas. Con los niveles de las variables en el menor valor, en el cultivo se presenta limitacin de oxgeno a partir de la hora dos, mientras que con la condicin propuesta se logra mantener el oxgeno disuelto en concentraciones cercanas al 60% de saturacin durante toda la fermentacin, eliminando la limitacin de oxgeno durante el cultivo.

Conclusiones
Para las condiciones evaluadas en los ensayos realizados con el fermentador convencional, de tanque agitado y difusor interno, se present en todos los ensayos limitacin de oxgeno en los cultivos. Sin embargo, se comprob que cuando se incrementa la transferencia de oxgeno se presentan incrementos en los parmetros de evaluacin del cultivo. Asimismo, se corrobor que se presentan mayores
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Figura 9. Cinticas de crecimiento microbiano y variacin del porcentaje de saturacin de oxgeno en el SFAE con FA de 0,65 vvm; FR de 0,45 CPM y 0,87 CPM; presin de 10 psi; agitacin de 154 rpm y temperatura de 30 C.

incrementos en el kLa por aumento en la agitacin en comparacin con los obtenidos con incrementos en la velocidad de aireacin. En la caracterizacin hidrodinmica del sistema de fermentador con aireacin externa (SFAE) las variables determinantes en la transferencia de oxgeno son el flujo de recirculacin (FR) y la velocidad de agitacin en el reactor, aumentando el kLa de un mximo obtenido en el fermentador convencional de 40,68 (h-1) hasta valores de 63,18 (h-1) con el SFAE. El SFAE es un modelo de fermentador de alta tasa de transferencia de oxgeno si se compara con el sistema convencional, logrando mayores valores de kLa. En la fermentacin con el SFAE operando con un flujo de recirculacin de 0,87 (CPM), una aireacin de 0,65 vvm y una presin de 10 psi, se logra una condicin de operacin que elimina la limitacin de oxgeno en los cultivos con el Lactococcus lactis IBUN 34.1.

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