PCR

LA REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) PCR son las siglas en ingls de Polymerase Chain Reaction o Reaccin en Cadena de la Polimerasa. La idea bsica de la tcnica es sintetizar muchas veces un pedazo o fragmento de ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas, ya que proviene de la bacteria Thermus aquaticus que vive a altas temperaturas (79C a 85C), de ah su nombre comercial ms conocido: taq polimerasa. Cuando hacemos una reaccin de PCR simulamos lo que sucede en una clula cuando se sintetiza el ADN y en el tubo se mezclan todos los ingredientes necesarios para hacerlo: la polimerasa, el ADN del organismo que queremos estudiar donde se encuentra el fragmento que queremos sintetizar , los oligonucletidos (llamados tambin primers, iniciadores, cebadores, oligos) necesarios para que se inicie la transcripcin, dinucletidos (dNTPs), y las condiciones para que la enzima trabaje adecuadamente (cierto pH, determinadas cantidades de magnesio en forma de MgCl2, KCl, y pueden necesitarse otras sales o reactivos, dependiendo de cada polimerasa. Esta tcnica tan ingeniosa tiene muchsimas aplicaciones distintas y se ha convertido en una herramienta muy importante en la biologa molecular; sus aplicaciones van desde la gentica de poblaciones, evolucin molecular y genmica hasta la medicina forense. Pero cmo funciona el PCR? La tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es una amplificacin enzimtica de ADN. Utilizando una enzima llamada ADN polimerasa obtenemos copias de una secuencia especfica de ADN. Las ADN polimerasas son las enzimas que replican el ADN. La enzima que se utiliza en esta tcnica tiene que ser termoestable y es obtenida de la bacteria Thermus aquaticus y se llama Taq polimerasa. Las ADN polimerasas necesitan un molde, cebadores y nucletidos activados. El molde es una molcula de ADN de cadena sencilla. Los cebadores son pequeas molculas de cido nucleico (de 15 a 20 nucletidos) cuya secuencia es conocida y complementaria a los extremos 3 de la secuencia que deseamos amplificar. Los cebadores se unen a sus secuencias complementarias, as flanquean la secuencia del ADN que queremos amplificar. Utilizando como anclaje el cebador apareado, la polimerasa iniciar la extensin de la cadena. Los nucletidos activados son incorporados por la ADN polimerasa a la cadena naciente. Los nucletidos activados son desoxirribonucletidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) La primera etapa de la reaccin es la desnaturalizacin por calor de las molculas de ADN, a continuacin tiene lugar la etapa de alineamiento (consiste en la unin de los

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cebadores con la cadena molde) y por ltimo la etapa de extensin. En cada ciclo se dobla la cantidad de ADN del ciclo anterior, segn la frmula 2n, donde " n" es el nmero de ciclos, permitiendo la obtencin de muchas copias de la secuencia inicial (millones o billones de copias en unas pocas horas). La PCR se realiza en un termociclador programable, que controla el nmero de los ciclos, la exactitud a la que se producen las etapas y la cantidad de tiempo en el que se mantiene la reaccin a las diferentes temperaturas. Veamos con ms detalle este proceso: Supongamos que ya tenemos los tubos listos con todo lo necesario para que la sntesis del fragmento que nos interesa que se lleve a cabo (taq polimerasa, dinucletidos, ADN, agua, buffer con magnesio y otras sales, y oligonucletidos). El siguiente paso es colocar los tubos en una mquina conocida como termociclador, que bsicamente sirve para calentarlos o enfriarlos a temperaturas muy precisas. Cmo es que se amplifica el (o los) fragmento(s) que queremos? Una vez colocados los ingredientes contenidos en un tubo en el

termociclador acontece los siguiente 1): el termociclador calienta o enfra los tubos a tres temperaturas distintas, que se repiten una y otra vez (lo que se llama los ciclos de reaccin), la primera es a 95C (y a este paso se le llama desnaturalizacin) durante la cual las dobles cadenas del ADN se abren o desnaturalizan, quedando en forma de cadenas sencillas; despus el termociclador ajusta la temperatura en un intervalo entre 40 y 60C (llamada de alineamiento), a esta temperatura se forman y se rompen constantemente los puentes de hidrgeno entre los oligonucletidos y el ADN, y aquellas uniones ms estables (las que son complementarias) durarn mayor tiempo, quedando los oligonucletidos alineados formando una pequea regin de doble cadena. La polimerasa se une a este pequeo pedazo de ADN de doble cadena y comienza a copiar en sentido 5 a 3; al agregar unas bases ms, los puentes de hidrgeno que se forman entre las bases estabilizan ms la unin y el oligonucletido permanece en este sitio para el siguiente paso. Despus la temperatura sube a 72C (paso que se conoce como extensin), ya que 72C es la temperatura en la cual la polimerasa alcanza su mxima actividad, y contina la sntesis de los fragmentos de ADN a partir de los oligonucletidos que ya se haban alineado. En el primer ciclo, con estas tres temperaturas, se sintetizarn los primeros fragmentos a partir del ADN genmico. Estos primeros fragmentos no tendrn el tamao esperado, sern un poco ms grandes ya que la taq copiar hasta donde le sea posible, pero como veremos ms adelante, se obtendrn en cantidades tan pequeas que al final no podremos detectarlos. Despus se repiten una vez ms

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las tres temperaturas, pero en este segundo ciclo, los oligonucletidos, adems de unirse al ADN que pusimos al inicio, tambin se unirn a los fragmentos recin sintetizados del primer ciclo, por lo tanto en este segundo paso la polimerasa sintetizar 2 fragmentos largos copiados directamente del ADN y 2 fragmentos del tamao esperado, que es el tamao que hay entre los dos oligonucletidos que hemos usado. De esta forma con cada ciclo aumentar el nmero de fragmentos del tamao que queremos. Cabe mencionar que antes y despus de estos ciclos se programan dos pasos, uno de 95C durante varios minutos para iniciar con desnaturalizacin, y al final de los ciclos, un paso ltimo de extensin a 72C para permitir que la taq termine de sintetizar todos los fragmentos que pueden haber quedado incompletos. Para este tipo de PCR es necesario que uno de los oligonucletidos tenga la misma secuencia que se encuentra en una de las cadenas del ADN, y el otro deber llevar la secuencia complementaria que estar al final del fragmento que se quiere amplificar (por lo cual se les llama forward y reverse) para que uno sea complementario a la cadena que forma el otro; si no es as no podra amplificarse el sitio que se necesita. Como cada pedazo sintetizado sirve como base para sintetizar otros en el siguiente ciclo, el nmero de copias aumentar en forma exponencial. Con una sola molcula de ADN, en el ciclo 1 se producen 2 a la 1= 2 nuevos fragmentos, en el ciclo 2 sern 2 a la 2, esto es, 4 fragmentos recin sintetizados, y as, con 35 ciclos de PCR se producirn nuevos fragmentos, los cuales posteriormente podrn ser utilizados para sus anlisis respectivo segn sea el caso a tratar. TIPOS DE PCR Una variante de esta tcnica, es la reaccin en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa. Se utiliza para la deteccin y amplificacin de ARN, permite estudiar la expresin de determinados genes (su traduccin a protenas). Se extrae el ARN total de las clulas en estudio, a continuacin se separa la fraccin correspondiente al mensajero (ARNm) y por accin de una transcriptasa inversa se transcribe el ARN a ADN complementario (cADN). Por cada molcula de ARNm se sintetiza una molcula de cADN monocatenaria y una ADN polimerasa la convierte en bicatenaria. En una etapa posterior se amplifica el cADN por PCR. Normalmente se utiliza la rTth ADN polimerasa de Thermus thermophilus, que es una enzima recombinante y termoestable que acta como transcriptasa inversa y como ADN polimerasa. Para saber si se ha amplificado la cadena de ADN de inters se suele utilizar la electroforesis en un gel teido con bromuro de etidio. Este compuesto se intercala en las bases del ADN provocando una alta densidad electrnica. Al exponer el gel a luz ultravioleta los

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electrones del bromuro de etidio se estimulan produciendo fluorescencia, pudindose as visualizar el ADN. Las bandas gruesas que observamos en el gel son las secuencias de ADN que hemos amplificado. Conocemos su tamao porque en un pocillo del gel se aade una mezcla de fragmentos de ADN de tamao conocido. Segn la altura a la que haya migrado el ADN amplificado tendr un tamao u otro. Podemos resumirla as:

PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)

1er paso: retrotranscripcin a partir del ARN. 2 paso: aplificacin a partir de la primera hebra de ADNc. 3er paso: PCR estndar.