BIO 368
ANALISIS INSTRUMENTAL
Métodos inmunológicos y “blots”
ELISA
(Inmunoanálisis ligado a enzimas)
Técnica basada en la capacidad de un anticuerpo determinado de
reconocer y unirse a un antígeno que ha sido adsorbido a un pocillo
de una placa de microtitulación.
ETAPAS EN EL ENSAYO DE ELISA
- Se agrega el antígeno a estudiar a los pocillos de la placa el que se
adsorbe a las paredes.
- Se bloquean todos los sitios de la pared del pocillo que no están
unidos a antígeno con una proteína (albúmina de bovino).
- Se agrega el anticuerpo específico para que se una al antígeno.
Habitualmente es de tipo IgG.
- Se agrega el segundo anticuerpo. Este anticuerpo es anti IgG y está
unido a una enzima (fosfatasa alcalina; peroxidasa).
- Se agrega una solución con un sustrato específico para la enzima,
generándose un producto coloreado cuya intensidad es medida con un
espectrofotómetro. La intensidad del color es proporcional a la
cantidad de complejo antígeno-anticuerpo.
Usos: identificación y cuantificación de antígenos proteicos.
Ventaja: posibilidad de analizar simultáneamente muchas muestras.
ELISA
WESTERN BLOT
Muy usado en la detección de una proteína en una mezcla impura.
Proporciona la siguiente información:
Cualitativa: ¿está presente la proteína?
Cuantitativa: ¿qué cantidad de la proteína hay en la muestra?
Estructural: ¿qué tamaño tiene la proteína?
Protocolo:
- Se separa una mezcla de proteínas por electroforesis desnaturante.
- Se transfieren las proteínas a una membrana (nitrocelulosa)
- Se bloquean las áreas de la membrana no ocupadas con una proteína
inespecífica (albúmina de bovino).
- Se aplica a la membrana un anticuerpo primario específico contra la
proteína en estudio.
- Se incuba la membrana con un anticuerpo secundario de gran afinidad
al anticuerpo primario, unido a una enzima (similar a ELISA).
- Usando un sustrato que genera un producto coloreado se detecta la
presencia de la proteína en estudio.
Transferencia manual de proteína o ácido nucleico de un gel a
una membrana.
Electrotransferencia de proteína de un gel a una membrana
Un homogeneizado de músculo
liso fue sometido a una
electroforesis desnaturante.
En A, se tiñó una pista del gel
con Azul de Coomassie.
En B, se transfirió otra pista
a una membrana de nitrocelulosa
para identificar alfa-actina.
Esto se hizo con un anticuerpo
anti IgG marcado con I125 y fue
detectado por autorradiografía.
DOT BLOT
Forma simplificada del “western blot”.
Ventajas: no se realiza una electroforesis previa sino que se carga en la
membrana soporte la muestra a analizar, y se la somete a la reacción
colorimétrica.
Permite una estimación cualitativa y cuantitativa del antígeno.
SOUTHERN BLOT
Todo fragmento de DNA es único en virtud de su secuencia nucleotídica.
¿Cómo detectar un fragmento de DNA en una población de fragmentos?
E. M. Southern inventó una técnica basada en la especificidad de secuencia.
La técnica implica la transferencia de fragmentos de DNA separados
electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa, seguida por su
desnaturación. La membrana es incubada con una sonda de DNA
marcada de simple hebra que se une específicamente a la secuencia
complementaria del DNA blanco. Finalmente se revela la ubicación del
trozo buscado con un método apropiado.
ETAPAS EN EL DESARROLLO DE UN SOUTHERN BLOT
23
9,4
6,5
4,3
2,3
0,96
Southern blot de DNA genómico de Penicillium purpurogenum
digerido con distintas enzimas de restricción e hibridado con una
sonda homóloga. Enzimas utilizadas: lane 1, BamH I; lane 2, EcoR I;
lane 3, Hind III; lane 4, Bgl II; lane 5, Bgl II/BamH I; lane 6,
Bgl II/EcoR I; lane 7, Bgl II/ Hind III; lane 8, Bgl II/ Hinc II; lane 9,
Bgl II/Pst I; lane 10, Bgl II/Xho I.
NORTHERN BLOT
Proceso similar al Southern blot destinado a la identificación
de RNA. Se realiza una electroforesis de RNA (en agarosa), se
transfiere a una membrana y se detecta el RNA blanco utilizando una
sonda marcada de DNA (o RNA).
Uso importante en estudios de la regulación de la expresión
génica: Identificación y cuantificación de un mRNA transcrito de un
gen particular y el efecto de cambios que pueden influir en la
expresión.
