MEDIOS DE CULTIVO: SU IMPORTANCIA, USO Y PREPARACION

INTRODUCCIN:

Para determinar la clase de germen que en un momento dado afecta el organismo humano, animal, o una contaminacin alimentaria; existen sistemas de aislamiento utilizando sustancias naturales o artificiales para su nutricin y desarrollo llamado medios de cultivo. No solo sirven para el diagnostico de un microorganismo, sino tambin en investigacin, transporte y conservacin de los grmenes. Un medio de cultivo es un material alimenticio que se usa en el laboratorio para el desarrollo de los microorganismos. Una vez que ha sido preparado, un medio de cultivo puede ser inoculado (es decir, se le aaden organismos) y a continuacin incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano. El crecimiento de los microorganismos es el cultivo. Un cultivo axnico o puro contiene un nico tipo de microorganismos. Los medios de cultivo deben contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y deben estar exentos de cualquier microorganismo contaminante. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuado, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. Los medios de cultivo contienen como mnimo: carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras. El Agar es el principal agente solidificante utilizado en medios bacteriolgicos. Se disuelve completamente a 100C y se solidifica al enfriarse a 40C.

MARCO TERICO: CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: Los medios de cultivo pueden clasificarse segn diferentes criterios, pero los ms importantes son aquellos que se basan en: a) Su consistencia b) Su utilizacin c) Su composicin d) Su origen

SEGN SU ESTADO FSICO (CONSISTENCIA). 1) Medios lquidos: Son los que se presentan en este estado, denominndose por esta razn caldos. El medio lquido ms utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtencin de una suspensin bacteriana de una determinada concentracin. 2) Medios slidos: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregndoles un agente gelificante. Los ms utilizados son la gelatina y el Agar. Gelatina: Es una protena animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y adems su uso est muy limitado porque su punto de fusin es bajo (lica a temperatura ambiente) razn por la que no puede utilizarse para cultivos a 37C, que es la tempera ptima de crecimiento para muchos microorganismos. Agar-agar: Es un polmero de azcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molcula insoluble enagua pero soluble en agua caliente; una solucin al 1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39C y no se funde por debajo de 85C. Funde a 90C y solidifica una vez fundido alrededor de los 45C. Tiene el inconveniente de que introduce compuestos orgnicos indefinidos que pueden falsear los resultados de las necesidades nutritivas de un microorganismo. Aunque el Agar es una mezcla de polisacridos, Araki, en 1937, los dividi en dos grupos:- agarosa, con poco sulfato, libre de cido pirvico, yagaropectina, con mucho sulfato y gran cantidad de cenizas. La proporcin de agarosa a agaropectina en el Agar vara segn el alga de origen. El Agar puede utilizarse para diferentes fines, aunque los ms importantes son: Agar comercial para la industria alimenticia, Agar bacteriolgico, agares purificados y agarosa, utilizada para

electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el Agar que se produce, se utiliza en trabajo microbiolgico, por lo que es importante la ausencia de metales txicos. 3) Medios semislidos: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregando a stos un agente solidificante en una proporcin menor que para preparar medios slidos. Uno de sus usos es la investigacin de la movilidad de las bacterias

SEGN SU UTILIZACIN. 1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mnimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio ms conocido de este grupo es el Agar nutritivo o Agar comn, que resulta de la adicin de Agar al caldo nutritivo. Otros representantes de este grupo son el Agar tripticase de soja, el Agar Columbia, etc. 2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, adems de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adicin de sangre u otros productos biolgicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible aadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc.) El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cistena para su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de cultivo (Agar chocolate). 3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una poblacin poli microbiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una poblacin microbiana especfica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias. 4) Medios inhibidores: Cuando las sustancias aadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una poblacin microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores podran considerarse como una variante ms restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por adicin de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una poblacin determinada. Un medio inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los grmenes Gram negativos e impide el crecimiento de los Gram positivos.

5) Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia caractersticas bioqumicas que ayuden a diferenciar gneros o especies. La adicin de un azcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los grmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. Tambin lo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el Agar sangre (tipo de hemlisis), el SS (que es doblemente diferencial), etc. 6) Medios de identificacin: Son los destinados a comprobar alguna cualidad especfica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato especfico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El Agar Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya aadido un elemento diferencial de un microorganismo, son medios utilizados en identificacin. Actualmente estn apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios especficos de identificacin para ciertos microorganismos, con lo cual se consigue simultneamente abaratar el costo y reducir el tiempo de identificacin. Son ejemplos de esto ltimo los medios CPS ID3 o Uriline ID (Biomerieux), utilizados para identificar los grmenes urinarios ms importantes a partir de la placa de cultivo gracias a la utilizacin de sustratos cromognicos especficos. 7) Medios de multiplicacin: Sirven para obtener una gran cantidad de clulas a partir de un microorganismo ya aislado. Seemplean en la obtencin de vacunas, en la investigacin y en la industria. Los medios ms adecuados para la multiplicacin suelen ser lquidos. El caldo-infusin cerebro-corazn (BHI), es un ejemplo tpico de estos medios. 8) Medios de conservacin: Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y reactivos utilizados en el Laboratorio de Microbiologa. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas: a) haciendo pases peridicos de placa a placa, b) mediante liofilizacin de una suspensin bacteriana, y c) congelando las cepas en leche descremada estril al 0,1%. 9) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clnicas que no pueden sembrarse inmediatamente. Su utilizacin debe hacerse introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior del medio (generalmente en un tubo). Son ejemplos tpicos de este grupo los medios de Stuart-Amies, Cary-Blair, etc.

ATENDIENDO A SU COMPOSICIN. Segn las sustancias que entren a formar parte en su composicin, los medios de cultivo pueden ser clasificados en: 1) Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los ms empleados se preparan a partir de tejidos animales, y ms raramente de vegetales. Su composicin no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podr ser exacta. En la prctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los ms empleados. 2) Medios sintticos: Son aquellos que contienen en su composicin exclusivamente sustancias qumicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composicin perfectamente definida. 3) Medios semisintticos: El gran nmero de factores de crecimiento exigidos para ciertos grmenes hace que la fabricacin de un medio sinttico para estos grmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgnico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos grmenes no crecen en ningn medio por muy enriquecido que est ste, hacindolo exclusivamente en clulas vivas con unas caractersticas determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc.

Segn su origen:

a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composicin qumica no se conoce exactamente. b) SINTTICOS: son los medios que contienen una composicin qumica definida cualitativa y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles. c) SEMISINTTICOS son los sintticos a los que se les aaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgnico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.

PROPIEDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: y y Humedad: Los medios generalmente preparados despus de 1-2 semanas, pierden la caracterstica de humedad, indispensable en el desarrollo bacteriano. Fertilidad: No todos los microorganismos exigen los mismos nutrientes en su desarrollo. Por lo tanto cada medio de cultivos debe de llevar incorporados los elementos esenciales que garanticen el desarrollo del germen que se busca. pH: Un microorganismo puede alterarse o alterar el pH del medio de cultivo como resultado de las sustancias producidas por el propio microorganismo. Estos cambios pueden llegar a inhibir el crecimiento del microorganismo. Estos cambios se pueden prevenir controlando el pH mediante sistemas tampn, el ms utilizado en microbiologa es la combinacin de KH2PO4 y K2HPO4. Transparencia: Indica la calidad excelente que el medio a utilizar debe presentar, es sinnimo de esterilidad. Esterilidad: Los medios de cultivo antes de utilizarse deben haber sido sometidos a control de esterilidad de 1-2 das en la incubadora a 37C. La presencia de algn germen en un medio determinado, es causa de eliminacin inmediata.

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PREPARACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: y Seguir exactamente las recomendaciones que exige la casa comercial respectiva. Estas instrucciones van adheridas en el exterior del frasco que contienen el medio. Usar en la hidratacin del medio de cultivo, solamente agua destilada estril. Adicionar solamente los componentes determinados por la casa comercial. En la hidratacin del medio, usar solamente recipientes de vidrio totalmente limpios. Pesar exactamente las cantidades indicadas para cada medio en particular. Vaciar la cantidad de medio de cultivo pesado previamente en un baln o matraz, y agregar la cantidad necesaria de agua, agitando manualmente y procurando que no queden restos del medio en las paredes del recipiente. Esta mezcla homognea se llevara a la estufa elctrica hasta la ebullicin y que el medio quede totalmente transparente. En general, los medios se esterilizan en el autoclave a 15 lbs. de presin, a 121C (240F) por 15 minutos. Otros medios no se esterilizan como caldo tetrationato, caldo rea. Para envasar los medios de cultivo en los tubos de ensayo o en cajas de petri estriles, se har lo ms cerca posible a la llama, sin hablar, toser en el momento de la operacin.

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Los medios se dejarn solidificar o endurecer. Luego se realizar control de esterilidad en la incubadora por 24 horas a 37C. Los medios de cultivo que no se utilicen inmediatamente se llevaran a la nevera. Para los medios de cultivo inclinados en tubo, como Agar TSI, Agar citrato de Simons y Agar nutritivo, inicialmente cuando el medio sea liquido y estril se coloca en posicin inclinada sobre una compresa hasta que se endurezcan y se llevaran a la refrigeracin para su conservacin.

CONSERVACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: Los medios deshidratados se conservarn en lugares secos y frescos sin exposicin a la luz. Cuando los medios de cultivo son deshidratados, deben protegerse del medio ambiente, ya que son altamente higroscpicos, inclusive con el tiempo adquieren consistencia ptrea, los cuales son inservibles para su uso posterior. No se deben usar esptulas hmedas y en lo posible se utilizar una esptula por medio. Los medio de cultivo debidamente preparados debern guardarse previo control de esterilidad en nevera a 4C, hasta el momento del uso. Antes de ser usados debern sacarse de la nevera y esperar para siembra que est a temperatura ambiente.

MEDIOS DE TRANSPORTE: En ciertos casos las muestras deben enviarse a ciertas distancias para su anlisis, siendo necesaria la utilizacin de medios de cultivo llamados medios de transporte, donde aseguran la viabilidad del microorganismo. Ejemplo: Stuart, Thayer Martn. OBJETIVOS: y Permitir al estudiante tener un conocimiento adecuado acerca de la preparacin y esterilizacin de diversos medios de cultivo para el crecimiento de hongos y bacterias. Conocer los diversos medios de cultivo.

MATERIALES: Autoclave, balanzas, esptulas, tubos tapa rosca, cinta de enmascarar o lpiz de cera, cajas de petri estriles, matraces, fiolas o balones de distinta capacidad, estufa elctrica, nevera, refrigerador, agua destilada, gradillas, incubadoras, medios de cultivo. METODOLOGIA: Cada grupo de estudiantes trabajara en la preparacin de un medio de cultivo liquido y solido. Para el efecto se seguirn las instrucciones estrictas de la casa comercial productora. Las instrucciones generalmente vienen en ingles. OBSERVACIONES Y RESULTADOS: -Realice un esquema del procedimiento utilizado para preparar un medio de cultivo.
Solicita el material que utilizaras

Lava y seca el material

Prepara las soluciones que se te indican, para poder llevar a cabo los medios de cultivos y etiqutalas

Envuelve el material y etiqutalo (no de equipo, grado, grupo, fecha)

Introduce material y soluciones preparadas al autoclave. Saca material y sustancias del autoclave.

Tiempo 40 min T=120c

GRAFICAS Y TABLAS: -Una caja de petri corriente contiene 20 ml de Agar. Calcule segn la frmula siguiente, la cantidad necesaria para prepara 75 cajas. Prepare 5% en exceso. MEDIO Tripticasa Fitona NaCl K2H2PO4 Glucosa Agar CONSULTAS: 1. Cules son los medios sintticos? R// Son los medios preparados comercialmente formados de sustancias especiales. Se obtienen en el comercio en forma granular y polvo. 2. Describa los medios naturales. R// Son medios utilizados para el crecimiento de agentes microbianos, son fundamentalmente: leche, pan, jugos, vegetales, tierra. Ej.: Agar v8. 3. Cules son las propiedades de los medios de cultivo? R// Son la humedad, fertilidad, el PH, transparencia y su esterilidad. CANTIDAD POR LITRO 17 g 3g 5g 2.5 g 2.5 g 15 g CANTIDAD REQUERIDA

BIBLIOGRAFIA: http://www.ecologia.unam.mx/laboratorios/evolucionmolecular/images/file/ClaseProc ariontes/Alejandra/Pr%C3%A1ctica%204%20%20Medios%20de%20cultivo.pdf http://perso.wanadoo.es/sergioram1/medios_de_cultivo.htm