Tincin de Gram
Bacteria Escherichia coli vista al microscopio tras ser teidas con la tincin de Gram
La tincin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la
visualizacin de bacterias, sobretodo en muestras clnicas. Debe su nombre al
bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1844. Se utiliza tanto
para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una
primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram
positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las
que se visualizan de color rosa.
Protocolo
Recoger muestra estril
Hacer el extendido en espiral
Dejar secar a temperatura ambiente
Fijar la muestra al calor (flamenado 3 veces aprox.)
Agregar azul violeta (cristal violeta) y esperar 1 minuto. Este tinte dejar de
color morado las bacterias Gram positivas.
Enjuagar con agua.
Agregar lugol y esperar 1 minuto.
Enjuagar con agua.
Agregar alcohol y acetona y esperar 15 segundos.
Enjuagar con agua.
Agregar safranina y esperar 30 segundos. Este tinte dejar de color rosado las
bacterias Gram negativas.
Enjuagar con agua.
- Para observar al microscopio ptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de
inmersin
Explicacin
El primer paso en cualquier tincin debe ser siempre la fijacin con calor.
Posteriormente el cristal violeta penetra en todas las clulas bacterianas (tanto Gram
positivas como Gram negativas).
El lugol est formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual est
presente para solubilizar el iodo. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble
en solucin acuosa con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que
en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no
se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen.
Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de
contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina
bsica. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas,
mientras que las Gram positivas permanecen azules.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una
tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al trmino del
protocolo, las Gram positivas se vern azl-violceas y las Gram negativas, se vern
rosas (si no se hizo la tincin de contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina)
Esta importante coloracin diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en
1884. En este mtodo de tincin, la extensin bacteriana se cubre con solucin de uno
de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado.
Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se aade luego una solucin de yodo,
que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; despus se lava el portaobjetos con
alcohol hasta que ste no arrastre ms colorante. Sigue a tal tratamiento una coloracin
de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o
hasta inclusive verde de malaquita.
Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, an despus de tratarlos con un
decolorante, y el color no se modifica al aadir ste; otros pierden con facilidad el
primer tinte, y toman el segundo.
Los que fijan el violeta, se califican de grampositivos, y los que pierden la primera
coloracin y retienen la segunda, de gramnegativos. Basndonos pues, en la reaccin
Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos.
Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloracin
Gram. Los representantes ms usados de este grupo son violeta de metilo y violeta
cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto
tetrametil-p-rosanilina.
El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el nmero de grupos
metilo en la molcula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono ms oscuro es la
hexametil-p-rosanilina (violeta cristal), y el tinte ms ligero, la tetrametil-p-rosanilina
(violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren
al nmero de grupos metilo contenidos. La letra R indica matices rojos, y la letra B,
tonos azules. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo, y se considera como el
colorante primario mejor para teir por el mtodo de Gram.
La facultad de las clulas para tomar la coloracin Gram no es propia de toda sustancia
viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. As vemos que las
clulas de plantas y animales superiores no conservan la primera coloracin; los mohos
se tien con cierta irregularidad; los grnulos de micelios propenden retener el
colorante. La reaccin de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo
del cultivo y el pH del medio, y quiz por otras causas.
FUNDAMENTO: TEORAS
Un microorganismo grampositivo debe presentar una pared celular sana. El mismo
microorganismo, si sufre dao de la pared por una u otra causa, se vuelve gramnegativo.
Esto indica la importancia de la pared para la retencin o el escape del colorante. Una
posible teora del mecanismo de tincin es la siguiente:
El colorante bsico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca
insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes
de los microorganismos grampositivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que
la laca no puede atravesar. En las clulas gramnegativas, los lpidos de la pared (ms
abundantes que en las clulas grampositivas) se disuelven por este tratamiento, lo que
permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. Algunos autores objetan esta
teora, pero es indudable la importancia general de la pared celular.
Varias son las teoras emitidas para explicar el mecanismo de la tincin de Gram. Stearn
y Stearn (1923) basan la suya en una combinacin qumica entre el colorante y las
protenas de las bacterias, Las protenas y aminocidos son cuerpos anfteros, esto es,
tienen la facultad de reaccionar con cidos y con bases, gracias a sus grupos amino y
carboxilo; en soluciones cidas, reaccionan con los cidos, y en soluciones alcalinas lo
hacen con las bases.
Stearn y Stearn comprobaron que la reaccin de tincin de las bacterias obedece en gran
parte a su contenido protenico; estos microorganismos se conducen como cuerpos
anfteros, al combinarse con colorantes cidos en soluciones cidas y con los bsicos en
medio alcalino. La combinacin con ambos tipos de colorante no se produce en el
punto isoelctrico. Como los microbios contienen ms de una protena, ese punto no
tiene un valor preciso y definido, sino que constituye ms bien una gama o escala que
comprende dos o tres unidades de pH. Segn Stern y Stearn, los grmenes
grampositivos tienen una escala isoelctrica de pH inferior a la de los grmenes
gramnegativos; y, a base de sus datos experimentales, deducen las siguientes
conclusiones:
1. Los microorganismos grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la
acidez.
2. Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la
alcalinidad.
3. Los microbios de reaccin positiva a los colorantes cidos pueden hacerse
gramnegativos por aumentar la alcalinidad.
4. Los microbios de reaccin positiva a los colorantes bsicos pueden hacerse
gramnegativos por aumentar la acidez.
5. En la zona isoelctrica caracterstica de cada especie es muy escasa la tendencia a
retener cualquier colorante.
6. Parece estar bien demostrado que las protenas de las bacterias no son simples, sino
ms bien una dbil combinacin de sustancias protenicas con otras lipoideas o grasas.
7. La materia grasa extrada de los microorganismos grampositivos difiere de la
obtenida de los microbios gramnegativos, en que la primera contiene una proporcin
mucho mayor de cidos no saturados que muestren gran afinidad por los agentes
oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloracin Gram son
oxidantes; su efecto, en general, consiste en dar a la sustancia oxidada un carcter ms
cido. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los colorantes bsicos.
8. El cambio de respuesta a la coloracin de Gram con el tiempo es propio, sobre todo,
de los microorganismos dbilmente grampositivos cultivados en los medios que
contengan sustancias capaces de fermentar, y cuya reaccin se vuelve cida en el curso
del desarrollo.
Gianni (1952) comprob que los microorganismos grampositivos Bacillus subtilis y B.
anthracis tomaban negativamente el Gram cuando los cultivos databan de dos a tres
horas. Luego se desarrollaba la sustancia grampositiva debajo de la pared celular, para
invertir la reaccin.
Otra explicacin de la reaccin de Gram puede ser la posible existencia de una capa
exterior alrededor de un ncleo gramnegativo.
Libenson y Mcllroy, han comunicado que si la reaccin grampositiva depende de que se
forme una combinacin compleja entre los componentes de la coloracin de Gram y las
protenas de la pared celular, sera de esperar que las bacterias desintegradas por medios
fsicos retuviesen este tinte, ya que ese tratamiento no podra cambiar el carcter
qumico de los materiales de dicha pared. Por el contrario, los grmenes grampositivos
desintegrados pierden su capacidad de retener el colorante primario y toman
negativamente el Gram.
La pared celular de las bacterias grampositivas y gramnegativas es permeable al violeta
cristal. Sin embargo, la de las primeras no lo es al complejo de yodo y colorante
formado en el interior de la clula. Los resultados experimentales obtenidos con una
difusin celular exenta de protenas, y la escasa solubilidad del complejo de yodo y
violeta cristal en alcohol y acetona, parecen sustentar la opinin de que la reaccin
grampositiva consiste esencialmente en la formacin, dentro de la clula, de una
cantidad apreciable de complejo de yodo y colorante difcil de eliminar con el
disolvente. La pared celular de las bacterias grampositivas, a diferencia de la de las
gramnegativas, sera prcticamente impermeable al violeta cristal. Los microorganismos
aparecern teidos despus de tratarlos con violeta cristal, por ser absorbido el colorante
en la superficie externa de la pared celular, y el disolvente eliminar sin dificultad el
complejo formado despus del tratamiento con yodo.
Ni los grupos sulfhidrilo ni las protenas bsicas han influido especficamente en el
mecanismo del colorante de Gram.
Libenson y Mcllroy han sostenido que la permeabilidad de la pared celular al violeta
cristal, la escasa solubilidad del complejo de yodo y colorante en alcohol y acetona, y el
libre acceso del disolvente al complejo constituido, son los principales factores que
intervienen en el mecanismo de esa coloracin.
TECNICA DE LA COLORACION GRAM
1. El primer paso es preparar y fijar un frotis de la siguiente manera:
- Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica y esperar que enfre un
poco. - Tomar el asa (previamente flameada) y con sta coger un poco de muestra. - Una
vez obtenida una pequea cantidad de la muestra (con el asa), hacer que sta tenga
contacto con una lmina portaobjetos, la cual servir para depositar la muestra
contenida en el asa.
- Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lmina portaobjetos, proceder a realizar
la extensin de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar
vueltas con el asa) sobre la lmina, de tal forma que al terminar la extensin, tengamos
como producto un espiral en la parte media la lmina.
- Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la
muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (slo se pasa por la llama),
puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfologa celular de las bacterias a
observar. El calor deseable es aquel en el que el portaobjetos sea apenas demasiado
caliente pare ser colocado sobre el dorso de la mano.
2. Una vez obtenido el frotis con la muestra, se procede a teir la misma con violeta
cristal o violeta de genciana, utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre
la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1
minuto. Esta tincin de 1 minuto est dada para trabajar a una temperatura ambiente de
25 grados.
3. Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lmina conteniendo la muestra con agua
corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe
caer directamente sobre la muestra, sta debe caer sobre la parte superior de la lmina
que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de
medio a un centmetro de espesor. Tambin el enjuague se debe realizar poniendo la
lmina en posicin inclinada hacia abajo.
4. Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante 1
minuto ms.
El mordiente es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con colorantes y
determine su fijacin a las bacterias
5. Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75
%, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra ms lquido azul.
Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van aadiendo cantidades
suficientes del decolorante, hasta lograr que ste salga totalmente transparente, es decir,
hasta que ya no escurra ms lquido azul.
6. Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lmina
al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente
descrita.
7. Una vez que la lmina ya sec, procedemos a teir nuevamente, pero esta vez se va a
utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1
minuto.
8. Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lmina con agua, se
escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita.
De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observacin
microscpica.
Bacterias resistentes a la tincin Gram:
Mycobacterias Mycoplasmas Formas L Protoplasmas y esferoplastos
Utilidades
En el anlisis de muestras clnicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias
funciones:
Identificacin preliminar de la bacteria causal de la infeccin.
Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos
bacterianos identificados en la tincin de Gram se deben de corresponder con
aislamientos bacterianos realizados en los cultivos. Si se observan mayor
nmero de formas bacterianas que las aisladas hay que reconsiderar los medios
de cultivos empleados as como la atmsfera de incubacin.
A partir de la tincin de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los
cocos son de forma esfrica. Pueden aparecer aislados despus de la divisin celular
(Micrococos), aparecer por pares (Diplococos), formar cadenas (Estreptococos), o
agruparse de manera irregular (Estafilococos).
Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena
(Estreptobacilos) o en empalizada.
Tambin pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos si son de forma
rgida o espiroquetas si son blandas y onduladas. Si por el contrario, poseen forma de
"coma", o curvados, entonces se los designa vibriones.
Fundamentos
Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de
las bacterias Gram positivas y Gram negativas
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de
peptidoglucano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara interna de
la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra el cido lipoteicoico, y
ms en la superficie, el cido teicoico que est anclado solamente en el peptidoglucano
(tambin conocido como murena)
Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se
encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin distinta a
la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida
a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de
protena, fosfolpido y lipopolisacrido.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas
direrencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material
que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en
mucha mayor proporcin que las Gram negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la
membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por
ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es
demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se
form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin
azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular ms
resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin
del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que
impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la
coloracin azul-violcea.
