TECNICAS DE OBSERVACIN
MICROSCOPICA
TIPO DE OBSERVACIONES
MICROSCPICAS
Lunes
1. Observacin en fresco
Son preferibles en las situaciones siguientes:
La morfologa de las bacterias se altera cuando se desecan y tien.
Cuando las bacterias se observan para determinar movilidad
Para observar los cambios citolgicos que ocurren durante la
divisin celular
Por este mtodo se observan fcilmente algunas inclusiones
celulares como vacuolas y materias grasa.
2. Observacin con tinciones
Para observar las caractersticas morfolgicas de las bacterias
Identificacin y diferenciacin de microbios entre especie y
dentro de la misma especie (tincin diferencial o selectiva).
TIPO DE OBSERVACIONES
MICROSCPICAS
Lunes
1. Observacin en fresco
preparacin en fresco simple
preparacin en gota pendiente
2. Observacin con tinciones
Tincin simple: un solo colorante.
Tincin diferencial: ms de un colorante
Tincin especial
Tincin negativa: colorea el medio que
rodea a la bacteria permaneciendo sta
sin teir.
Procedimiento para un preparado en
fresco
("entre porta y cubre")
1. Colocar una gota
2.- Tomar la muestra
de SSF o agua en un
porta
con el asa de siembra o
un gotero
Muestra
Porta objeto
Observacin microscpica
1. Observacin en fresco
Bacterias: Leptospiras,
treponemas (M. campo oscuro)
Observacin microscpica
1. Observacin en fresco : (SSF)
Parsitos : Trofozoitos, larvas.
Observacin microscpica
1. Observacin en fresco
Hongos: Levaduras
Observacin microscpica
1. Observacin en fresco con
modificaciones
Hongos
NaOH 10% (hifas)
Procedimiento para un preparado en
fresco
en gota pendiente
2. TINCIONES O COLORACIONES
COLORANTE: DEFINICIN
Son compuestos orgnicos que
tienen alguna afinidad especfica
por algn componente.
Los colorantes son compuestos
qumicos utilizados para
aumentar el contraste
COLORANTES: Tipos
a) Sales colorantes: ms comnmente usados
bsicos: Consisten en un catin coloreado unido a un
anin incoloro. Tien la clula bacteriana uniformemente
(cidos nucleicos y los polisacridos cidos )
(cromatina nuclear de pro y eucariotas)
(ms usados en citologa bacteriana).
Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+). la safranina, la
fucsina bsica, el cristal violeta
cidos: Tienen el catin incoloro unido a un anin
coloreado. No tien la clula bacteriana, pueden usarse
como color de contraste (coloracin negativa). Tien
estructuras citoplasmticas de las clulas eucariotas(Rx
bsicas)
Ej: eosinato (-) de sodio (+),la fucsina cida y el rojo Congo.
COLORANTES: Tipos
b) Colorantes liposolubles
Se combinan con los componentes
lipdicos de la clula, usados para
revelar la localizacin de los
depsitos de grasa. Ej. Negro Sudn.
COLORACIONES : Tipos
Vitales
Son aquellas que se practican sobre clulas que
estn vivas, mediante la introduccin de un
colorante en la circulacin de un organismo vivo.
Ejem: el verde Jano y el azul de metileno.
Supravitales
son aquellas que se realizan sobre clulas o tejidos
vivos, pero que estn aislados del organismo del que
proceden.
No vitales
se realizan sobre clulas muertas.
TCNICAS PARA REALIZAR
UNA PREPARACIN
COLOREADA
a) Frotis o pelcula (extensin)
b) La fijacin
c) Coloracin.
Tincin de clulas para la observacin
microscpica
Extensin de una fina capa
de clulas sobre el porta
Adicin del colorante
lavado y secado
Secado al aire
Fijacin por flameado del porta
Se coloca una gota de aceite
de inmersin sobre el porta y
se observa con el objetivo de
100X
TCNICAS PARA REALIZAR
UNA PREPARACIN
COLOREADA
a) Frotis o pelcula (extensin)
Utilizar portaobjetos limpios y desengrasados
TCNICAS PARA REALIZAR
UNA PREPARACIN
COLOREADA
b) La fijacin:
Los microorganismos queden adheridos al portaobjeto ( coagula
las sustancias proteicas)
TIPOS
CON CALOR (O MTODO DE KOCH)
FIJACIN QUMICA: alcohol metlico, formalina al 5 % (v/v), licor de Hoffman
(partes iguales de etanol absoluto y ter)
Metanol
TCNICAS PARA REALIZAR
UNA PREPARACIN
COLOREADA
c)
Coloracin.
Positiva o negativa
SIMPLE
Tincin simple de azul de metileno.
Frotis y fijacin
1.- Poner una gota de
agua en un porta
2.- Tomar la muestra con
el asa de siembra
3.-Extender sobre el
agua y fijar a la llama
del mechero
Tincin
1.- Cubrir la
preparacin con Azul
de Metileno 5
2.- Lavar con agua,
dejar
secar
y
observar
al
microscopio
Micrococcus luteus
Lunes
Lunes
Tincin negativa.
1.- Colocar una gota de
Nigrosina en un porta
2.- Tomar muestra del
microorganismo con el
asa, flamear el tubo y
tapar
3.- Mezclar con la
Nigrosina
y
extender por todo el
porta. Secar al aire
y observar
cpsulas tanto bacterianas como de levaduras, esporas que se observan como cuerpos
refringentes y espiroquetas
Hongos
Tincin negativa
TCNICAS PARA REALIZAR
UNA PREPARACIN
COLOREADA
c) Coloracin.
Diferencial
o
compuesta
se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos
Etapas :
1. tincin primaria
2. Tincin de contraste o secundaria
-
Ejemplo.: COLORACION GRAM, COLORACION DE
ZIEHL- NEELSEN, ESPORAS
TERMINOS
Los mordientes, aunque no son
colorantes, intensifican la tincin
porque aumentan la afinidad de la
clula por el colorante. Tambin
se pueden utilizar para producir
un engrosamiento de ciertas
estructuras celulares externas,
como los flagelos, que debido a
su delgadez no podran ser
visualizados de otra forma.
Diferencias en la pared
celular
Lunes
Tincin
L-3.2.3.- Tincin de Gram
Frotis y fijacin
1.Poner
una 2.Tomar
la
gota de agua en muestra con el asa
un porta
de siembra
3.- Decolorar con
Alcohol 96 hasta
que no suelte
colorante
3.Extender
sobre el agua y
fijar a la llama del
mechero
4.- Lavar con agua
1.- Cubrir la
preparacin con
Cristal Violeta 2
2.- Aadir Lugol
(mordiente)
durante 1
5.- Teir con Safranina 16.- Lavar con agua,
dejar
secar
y
observar
al
microscopio
Tincin de Gram
Tincin del frotis
Paso 1
Paso 2
Previamente fijado al calor,
con cristal violeta
Durante 1 minuto.
Todas las clulas se tien
de color azul-violeta.
Aadir Lugol,
dejar actuar 2 minutos
Todas las clulas siguen
de color azul-violeta.
Gram +
Decolorar con alcohol
Paso 3
Las clulas Gram +
siguen de color azul-violeta.
Las Gram negativas
se decoloran.
Tincin de contraste
Con safranina 2 minutos.
Las clulas G+
se ven azul-violeta.
Paso 4
Las G- rosas o rojas.
Gram -
PROCEDIMIENTO
COLORACION GRAM
Lunes
Tincin de Gram
Cocos Gram -
Bacilos Gram -
COLORACIN DE ZIEHLNEELSEN
fundamento de esta tcnica diferencial se basa en
la propiedad de la pared celular Orden
Actinomycetales. (acidos miclicos)
Resiste la decoloracin con alcohol y un cido
fuerte cuando
VARIANTES
Caliente : Mycobacterium
En fro (o de Kinyoun) : Cryptosporidium,
Cyclospora E
Tincin
Frotis
y fijacin
resistente.
1.-Poner una gota
agua en un porta
de
2.-Calentar con un hisopo
de algodn empapado en
alcohol y prendido con la
llama del mechero hasta
la emisin de vapores.
Mantener
durante
5
minutos.
de
cido-alcoholTincin
2.- Tomar la muestra de
un
cultivo
de
Mycobacterium
3.-Lavar con agua
y decolorar con
alcohol cido
5.-Lavar con agua,
dejar
secar
y
observar
al
microscopio
Miercoles
3.-Extender sobre el
agua y fijar a la llama
del mechero
4.-Teir con Azul
de Metileno 1
1.-Cubrir la
preparacin con
Fuchina fenicada
Tincin de esporas.
Miercoles
Tincin
Frotis y fijacin
1.-Poner una gota
de agua en un
porta
2.-Calentar, con un
hisopo de algodn
empapado
en
alcohol y prendido
con la llama del
mechero, hasta la
emisin
de
vapores. Mantener
caliente durante 5
minutos.
2.-Tomar la muestra
de un cultivo de
Bacillus
3.-Lavar con agua
Espora
s
Bacteria
s
3.-Extender sobre
el agua y fijar a la
llama del mechero
4.-Teir con Safranina 1
1.-Cubrir la
preparacin con
Verde Malaquita
5.-Lavar con agua,
dejar
secar
y
observar
al
microscopio
La tincin de flagelos de
Leifson
1.Se fija qumicamente la suspensin
bacteriana, mediante formol, y se hace la
extensin en un portaobjetos.
2.Se deja secar al aire, sin calentamiento
alguno.
3.Se cubre la preparacin con una mezcla de
cido tnico y el colorante rosanilina, de
preparacin extempornea. El cido tnico
engruesa los flagelos y la rosanilina los tie.
4.Se retira el exceso de colorante con agua.
5. Por ltimo, se deja secar al aire, antes de su
observacin al microscopio.
Figura 3.11Tinciones especficas. (a) La tincin de Wirtz-Conklin se utiliza
para observar endosporas. Bacilius cereus (b) La tincin de Leifson revela
que este microorganismo posee flagelos, lo cual contribuye a su
identificacin como Spirillum volutans..(c) La tincin negativa con tinta
china permite observar que esta bacteria posee cpsula, lo que facilita su
identiticacin como Klebsiella pneumoniae, agente causal de la neumona.
Tcnicas de tincin para bacterias
Tincin
Uso
Tcnicas
Tinciones
simples
Un colorante; proporciona contraste
para observar mejor un organismo
completo
Se tine con un colorante bsico (azul de metileno, cristal
violeta, o fucsina bsica) durante unos 5 minutos. Aclarar
brevemente con agua. Se tien casi todas las bacterias; la
rnayora de los tejidos no se tien.
Tnciones
diferenciales
Tincin de
Dos o ms colorantes; distingue
Gram
entre bacterias Gram positivas y
Gram negativas
Se cubre la preparacin de bacterias fijadas con cristal violeta y
despus con una solucin de iodo (mordiente). Todas las clulas
quedan tenidas de color violeta oscuro. Se decolora con acetona
al 95%.
Las clulas Gram positivas permanecen tenidas, pero las
negativas pierden el colorante. Se tie con safranina
(contraste). El color violeta de las Gram positivas se vuelve ms
oscuro y las Gram negativas se tien de rosa.
Tincin de
cido-alcohol
resistencia
(ZiehlNeelsen)
Dos colorantes; distingue entre las
micobacterias (cido-alcohol
resistentes) y el resto de las
bacterias
Tinciones
especificas
Tincin de
Tie selectivamente las endosporas
esporas de
Wirtz-Cortitlin
Tincin de
flagelos de
Leifson
Permite observar los flagelos
Se tien las clulas con fucsina bsica y se calienta a emisin
de vapores durante 5 minutos. Todas las bacterias se tinen de
rojo. Se decolora brevemente con una mezcla de alcohol-HCl.
Las bacterias resistentes permanecen teidas de rojo; todas las
dems se decoloran. Se trata con el colorante de contraste azul
de metileno. Las bacterias cido-alcohol resistentes continan
tenidas de rojo, las otras se tien de azul.
Se cubre la preparacin con verde de malaquita y se calienta a
emisin de vapores durante 60 segundos. Se lava con agua
durante 30 segundos y se tie con safranina. Las endosporas
retienen el color verde; el resto de la clula toma el color rosa.
A las clulas previamente fijadas, se le aade una mezcla de
cido tnico (mordiente) y del colorante rosanilina. El mordiente
engruesa los flagelos y el colorante los fine.
Imgenes de Paramecium al mismo aumento (1000x), pero con distintos
microscopios. (a) La microscopa de campo claro permite observar la forma y las
estructuras internas de mayor tamao, como el ncleo. (b) La imagen de
contraste de fases muestra mayor detalle interno, y el caracterstico halo. (c) La
microscopa de campo oscuro revela la presencia de cilios. (d) La imagen de
Nomarsky es casi tridimensional.
PARASITOS: Plasmodium
GIEMSA O WRIGHT
COLORACION LEISHMAN
HONGOS
AZUL DE LACTOFENOL
T. MENTAGROPHYTES
COLORACION DE TEJIDOS
HEMTOXILINA /EOSINA
Hay alguna pregunta?
o de lo contrario
seguimos en la
prxima clase !!!
