PROCEDIMIENTO DETECCION Vibrio
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1.
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OBJETIVO
Detectar la presencia de Vibrio cholerae en alimentos.
2.
CAMPO DE APLICACIN Y ALCANCE
Aplicar este procedimiento a muestras de alimentos (incluidos pescados, marisco y vegetales).
3.
FUNDAMENTO
V. cholerae presenta rpida generacin o desarrollo por lo tanto incubar en un corto perodo de
tiempo en un medio de enriquecimiento selectivo es efectivo para su aislamiento. El agua
peptonada alcalina es recomendable sin embargo, la flora acompaante puede crecer demasiado
por incubaciones prolongadas.
Si el producto ha sido sometido a proceso de calentamiento, congelacin, deshidratado o bien
baja densidad es esperada, una incubacin de 18 a 24 horas es recomendada para resucitar las
clulas daadas.
4.
REFERENCIAS
4.1 Bacteriological Analytical Manual Online, BAM Chapter 9 January 2004.
4.2 Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Food, 4 Ed. 2001.
5.
TERMINOLOGA
No Aplica
6.
MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS
6.1 Equipos e insumos
6.1.1
Bolsas estriles o contenedor estril para el transporte de las muestras.
6.1.2
Incubadora a 35 C 2 C
6.1.3
Asas
6.1.4
Portaobjetos
6.1.5
Licuadora Waring Blender
6.1.6
Bao de agua regulado a 42 0,1 C
6.1.7
Incubadora regulada a 39-40 C (opcional)
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6.2 Medios de cultivos y reactivos
6.2.1
Agua peptonada Alcalina (APA)
6.2.2
Agar TCBS (agar Tiosulfato-Citrato- Sales biliares Sacarosa)
6.2.3
Agar CPC modificado (Agar Celobiosa- Polimixina - Colistina modificado)
6.2.4
Agar CC (agar Celobiosa Colistina)
6.2.5
Agar AGS (agar Arginina- glucosa tentido)
6.2.6
Agar triptona o tripticasa con 1% NaCl (T1N1)
6.2.7
Caldo tripticasa al 0% NaCl (T1N0)
6.2.8
Caldo tripticasa al 3% NaCl (T1N3)
6.2.9
Caldo triptona (triptfano) 0%NaCl
6.2.10 Agar MIO
6.2.11 Agar TSI o KIA
6.2.12 Desoxicolato de sodio al 0,5%
6.2.13 Antisuero polivalente O1
6.2.14 Antisuero Inaba, Ogawa (Optativo)
6.2.15 Antisuero O139 (Optativo)
6.2.16 Agar sangre de cordero (Optativo)
7.
7.1
DESARROLLO
PESAJE Y SIEMBRA DE ALIMENTOS EN GENERAL ( pescados y mariscos)
7.1.1
Pesar 25 gramos de muestra (en jarra capacidad aproximadamente 500 mL).Los
productos como mariscos o vegetales pueden ser homogeneizados en licuadora o bien
cortados con tijera estril en pequeas piezas.
7.1.2
Aadir 225 mL de agua peptonada alcalina a la jarra. Mezclar muy bien la muestra u
homogeneizar en licuadora por 2 minutos a alta velocidad.
7.1.3
Incubar la muestra con el agua peptonada alcalina a 35 C 2 C por 6 a 8 horas.
Reincubar por 18-24 h si la muestra corresponde a un producto procesado.
7.1.4
Para el anlisis de ostras crudas, incluir un segundo frasco con 25 g del producto ms
2475 mL de agua peptonada alcalina. Este frasco debera ser incubado por 18 a 21 h a
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42 0,1 C en bao de agua. La tcnica de enumeracin por nmero ms probable
(NMP) puede ser desarrollada si lo estima necesario.
7.1.5
Preparar placas secas de TCBS. Si cuenta con agares CPC modificado o CC, se pueden
incluir.
7.1.6
Transferir de la pelcula superficial del enriquecido de agua peptonada alcalina (de las 6
y 18 horas) con asa de 3 mm a la superficie del agar TCBS (y mCPC o CC) y sembrar
de tal manera de obtener colonias aisladas.
7.1.7
Incubar las placas de TCBS por 18 a 24 h a 35 2 C. Las placas de mCPC y CC
incubarlas por 18 a 24 h a 39-40 C, si no es posible disponer de una incubadora a esta
temperatura, incubar entre 35 a 37 C. La selectividad est primariamente determinada
por los antibiticos en la formulacin del medio ms que por la alta temperatura.
7.1.8
Las colonias tpicas de Vibrio cholerae sobre agar TCBS son grandes de 2 a 3 mm, lisas
de color amarillo y ligeramente aplanadas con un centro opaco y una zona perifrica
translcida.
7.1.9
Las colonias tpicas sobre agar mCPC o CC son pequeas, lisas, opacas y de un color
verde a prpura, con un fondo prpura en incubaciones prolongadas.
7.1.10 Para la identificacin bioqumica, las colonias deben ser traspasadas a un agar en placa
no selectivo (T1N1, T1N3, o TSA con NaCl al 2%) para obtener colonias puras. Incubar
por 18 a 24 h a 35 2 C y proceder con la identificacin usando una colonia solo
aislada.
7.1.11 Subcultivar 3 o ms colonias tpicas de cada placa de agar T1N1 a tubo en tendido de
agar T1N1 o por picadura en medio para la prueba de movilidad. Incubar por18 a 24 h a
35 2 C.
7.2
SCRENNING Y CONFIRMACIN
7.2.1
Glucosaarginina en tendido (AGS):
7.2.1.1
Incubar colonia sospechosas del tubo de agar T1N1 a agar AGS por siembra en estra
en tendido y por picadora en el fondo.
7.2.1.2
Incubar el agar AGS con la tapa suelta por 18 a 24 h a 35 2 C.
7.2.1.3
Los cultivos de V. cholerae y V. mimicus resultan alcalino (prpura) en tendido y
como la arginina no se hidroliza resulta cido (amarillo) en profundidad o picadura.
No se produce gas y tampoco H2S.
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7.2.2
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Tolerancia a la sal:
7.2.2.1
A partir del agar T1N1 inocular ligeramente un tubo de caldo T1N0 y de caldo T1N3.
7.2.2.2
Incubar por 18 a 24 h a 35 2 C.
7.2.2.3
Los cultivos de V. cholerae y V. mimicus crecen sin NaCl.
7.2.3
String test: es una prueba presuntiva de utilidad para las cepas de V. cholerae las que
resultan positivas al ensayo.
7.2.3.1
A partir del agar T1N1 emulsionar una gran cantidad de cultivo en un apequea gota de
desoxicolato de sodio al 0,5% en agua destilada estril.
7.2.3.2
Dentro de 60 segundos las clulas y las hebras de ADN se lisan (prdida de turbidez)
cuando el asa se levanta ( 2 a 3 cm) del portaobjeto o lmina.
7.2.4
Reaccin de Oxidasa:
7.2.4.1
Transferir con asa de platino o un aplicador de madera (alambre de nicrn no debe ser
usado) del cultivo del agar T1N1 a una cinta de papel filtro saturado con el reactivo de
oxidasa (1% N,N,N`,- tetrametil-p-fenilendiamino 2HCl).
7.2.4.2
La formacin o desarrollo de un color prpura oscuro dentro de 10 segundos indica
resultado positivo.
7.2.4.3
Alternativamente, aadir una gota del reactivo respectivo a un tubo de agar T1N1 o en
placa de agar. V. cholerae y V. mimicus resultan positivo al ensayo.
7.2.5
Agar MIO:
7.2.5.1
A partir del agar T1N1 inocular con asa de aguja en picadura un tubo de agar MIO.
7.2.5.2
Incubar por 24 h a 35C 2 C. V. cholerae es mvil, indol y ornitina positiva.
7.2.5.3
Sembrar en agar TSI o KIA en tendido y profundidad.
7.2.5.4
Incubar a 35 C por 24 h. V. cholerae en tendido puede ser alcalino (K) o cido (A), el
fondo del tubo es cido (A), gas negativo y H2S negativo.
7.2.6
7.2.6.1
Agar TSI o KIA en tendido y profundidad:
A partir del agar T1N1 inocular con asa de aguja
profundidad.
en tendido y en picadura en
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7.2.6.2
Incubar con la tapa ligeramente suelta a 35 C por 24 h.
7.2.6.3
Las cepas de V. cholerae en tendido pueden resultar alcalino (K) o cido (A), el
fondo del tubo es cido (A), gas negativo y H2S negativo.
7.2.7
Agar LIA:
7.2.7.1
A partir del agar T1N1 inocular con asa de aguja en tendido y en profundidad.
7.2.7.2
Vibrio cholerae es lisina decarboxilasa positiva, gas negativo y H2S negativo.
7.2.7.3
Incubar con la tapa ligeramente suelta por 24 h a 35 C.
7.2.8
Indol en caldo triptona al 0% NaCl:
7.2.8.1
A partir del agar T1N1 inocular con asa de 3 mm un tubo con caldo triptona al 0%
NaCl.
7.2.8.2
Incubar a 35 C 2 C por 24 h.
7.2.8.3
V. cholerae presenta desarrollo y resulta positivo al indol al agregar gotas de reactivo
de Kovacs.
7.3
CARACTERIZACIN SEROLGICA
7.3.1
El serotipo de las cepas sospechosas de de V. cholerae string test positivo se realiza
utilizando antgenos somticos O los que otorgan la evidencia de la importancia
epidemiolgica. La mayora de los serotipos del serogrupo O1, Ogawa e Inaba y el
serogrupo O139 son reconocidos patgenos humanos. Los dos serotipos del serogrupo
O1 son observados en ambos biotipos de V. cholerae: Clsico y el Tor.
7.3.2
Para cada cultivo a evaluar:
7.3.2.1
Marcar tres secciones con lpiz (de cera) alrededor de 1 x 2 cm sobre el interior de
una placa de Petri de vidrio o sobre un porta objeto de 2x3 pulgadas.
7.3.2.2
Aadir una gota de solucin salina al 0,85% en la parte inferior de cada seccin
marcada.
7.3.2.3
Con un asa o aguja estril emulsionar del cultivo de agar T1N1 en la solucin salina
para una seccin y repetir para las otras secciones.
7.3.2.4
Verificar si ocurre aglutinacin.
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7.3.3
Aadir una gota del antisuero polivalente V. cholerae O1 a una seccin y emulsionar el
cultivo con un asa o aguja estril.
7.3.4
Aadir una gota del antisuero O139 a una seccin separada (tercera seccin).
7.3.5
Inclinar la mezcla de un lado a otro por un minuto y obsrvela contra un fondo oscuro.
Una reaccin positiva es indicada por una rpida y fuerte aglutinacin en un fondo
claro.
7.3.6
Si resulta positivo para serogrupo O1, probar separadamente con los antisueros Ogawa e
Inaba. El serotipo Hikojima reacciona con ambos antisueros.
7.3.7
Los anticuerpos contra los antgenos Inaba y Ogawa y serogrupo O1 se encuentran
disponibles comercialmente. Lo mismo ocurre con el antisuero O139.
7.3.8
Resultados de cultivos no aglutinables deben ser reportados como V. cholerae no O1 /
O139.
7.4
ENSAYOS BIOQUMICOS.
7.4.1
La tabla del Anexo N 1 presenta el nmero necesario mnimo de caractersticas para
identificar cepas de V. cholerae.
7.4.2
La capacidad de V. cholerae para crecer en triptona al 1% sin NaCl lo diferencia de
otros vibrios sacarosa positiva.
7.4.3
El sistema API 20E ha sido usado con xito para la identificacin y confirmacin de
aislados.
7.4.4
El sistema de placas de microtitulacin para el almacenamiento de aislados sospechosos
puede ser usado.
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DIFERENCIACIN ENTRE LOS BIOTIPOS EL TOR Y CLSICO
7.5.1
El biotipo Clsico es raramente encontrado, los siguientes ensayos opcionales son para
diferenciarlo del biotipo El Tor:
7.5.1.1 Beta- hemlisis:
7.5.1.1.1
el medio ms comn de diferenciar los biotipos del V. cholerae O1 y tal vez la ms
fcil es determinar la capacidad de producir - hemlisis sobre placa de agar sangre
de cordero.
7.5.1.1.2
Las cepas del biotipo El Tor son - hemolticas, mientras que el biotipo Clsico no
produce una hemolisina.
7.5.1.1.3
Sembrar el cultivo a ensayar en cua y superficie en placas de agar sangre de cordero
incubar a 18-24 horas a 35 C 2C. La - hemlisis puede ser determinada por una
zona clara alrededor del cultivo.
7.5.1.2 Sensibilidad a la Polimixina B:
7.5.1.2.1
Sembrar profusamente un cultivo sospechoso en una placa seca de agar T1N1.
7.5.1.2.2
Poner un disco de 50 unidades de polimixina B sobre la superficie.
7.5.1.2.3
Las cepas del biotipo Clsico son sensibles (una zona de >12 mm); las cepas del
biotipo El Tor son resitentes. Si el cultivo sospechoso crece sobre agar mCPC, el
cual contiene polimixina B, se considera que se trata del biotipo El Tor.
7.6
CONFIRMACIN.
7.6.1
Enviar al Centro de Referencia, las cepas que resulten bioqumicamente compatibles
con V. cholerae y aglutinen con el antisuero polivalente.
7.6.2
Enviar la cepa en placa o tubo tendido de agar T1N1 debidamente rotulada, la
encomienda debe ser en triple embalaje cumpliendo la normativa de transporte de
sustancias peligrosas.
7.6.3
Adjuntar formulario de envo de cepas ambientales.
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8. REGISTROS
Registro deteccin Vibrio cholerae en alimentos BAM online
9. ANEXOS
9.1
Anexo N 1: Esquema Caractersticas bioqumicas mnimas para identificar de V.
cholerae y V. parahaemolyticus.
9.2
Anexo N 2 Esquema Caractersticas bioqumicas de Vibriones patgenos comnmente
encontrados em pescados y mariscos.
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ANEXO N 1
Caractersticas Bioqumicas de V. cholerae
Nmero mnimo de caractersticas necesarias para identificar cepas V. cholerae y V.
parahaemolyticus
Bacilo Gram-negativo, no esporulado
Oxidasa
String test
L-lisina decarboxilasa
L-arginina dehidrolasa
L-ornitina decarboxilasa
Desarrollo en caldo triptona al 1%
a
Sin NaCl
V. cholerae (y V. mimicus)
c
V. parahaemolyticus
b
Reaccin positiva
Porcentaje
100
100
100
100
98.9
99.1b/0c
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Anexo N 2
Caractersticas bioqumicas de Vibrios patgenos comunmente encontrados en pescados y mariscos
Biochemical characteristics of human pathogenic Vibrionaceae commonly encountered in seafood*
V. algiV.
nolyticus cholerae
V.
fluvialis
V.
furnissii
V.
hollisae
V.
metschnikovii
V.
mimicus
V.
parahaemolyticus
V.
vulnificus
A.
P.
hydro- shigelphilia** loides**
TCBS agar
NG
mCPC agar
NG
NG
NG
NG
NG
NG
NG
NG
NG
CC agar
NG
NG
NG
NG
NG
NG
NG
NG
NG
AGS
KA
Ka
KK
KK
Ka
KK
KA
KA
KA
KK
nd
Oxidase
Arginine dihydrolase
Ornithine
decarboxylase
Lysine decarboxylase +
0% NaCl
Growth 3% NaCl
in
6% NaCl
(w/v):
8% NaCl
nd
Sucrose
DCellobiose
Lactose
Arabinose
D-Mannose +
D-Mannitol +
ONPG
VogesProskauer
10 g
O/129
nd
150 g
O/129
nd
Gelatinase
Urease
10% NaCl
Growth at 42C
Acid
from:
Sensitivity
to:
* Adapted from Elliot et al.
** Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides
Abbreviations: TCBS, thiosulfate -citrate -bile salts -sucrose; mCPC, modified cellobiose -polymyxin B-colistin; AGS, arginine-glucose slant;
Y = yellow NG = no or poor growth S = susceptible nd = not done
G = green V = variable among strains R = resistant P = purple, V = variable
KK = Slant alkaline / Butt alkaline KA = Slant alkaline /Butt acidic, Ka = Slant alkaline/ Butt slightly acidic
