Introduccin a la Biologa Celular y Molecular
TP5: Cuantificacin de ADN y electroforesis en gel de agarosa
Objetivos
Cuantificar el ADN extrado en el TP N4 Identificar los productos obtenidos e interpretar las bandas resueltas mediante electroforesis en gel de agarosa.
Introduccin
Luego de la extraccin del ADN, son necesarias la cuantificacin y el anlisis de la calidad de las molculas obtenidas. Uno de los mtodos ms utilizados para la cuantificacin del ADN es el anlisis de la absorcin UV, ya que los nucletidos poseen mximos de absorcin alrededor de 260 nm (por ejemplo, dATP: 259 nm; dCTP: 272 nm; dTTP: 247 nm). Este mtodo proporciona una estimacin simple y precisa de la concentracin de una muestra, pero slo si sta se encuentra pura, sin contaminacin significativa de protenas o solventes orgnicos que absorben a longitudes de onda cercanas. Para evaluar la pureza de la muestra debe determinarse la proporcin OD 260nm/OD 280nm. Si la relacin es mayor a 1,6 puede estimarse que la muestra es lo bastante pura para confiar en la cuantificacin espectrofotomtrica. La calidad de las molculas extradas se analiza por electroforesis en gel de agarosa. La agarosa es un polisacrido altamente purificado derivado del agar. Se utiliza para separar macromolculas tales como cidos nucleicos y grandes complejos proteicos. Tienen un menor poder de resolucin que la poliacrilamida pero una gran rango de separacin, tal que pueden ser separadas molculas de ADN desde 200 pb hasta aproximadamente 50.000 pb (variando las concentraciones de agarosa). El tamao del poro del gel puede ser predeterminado ajustando su concentracin en el gel; entonces a mayor concentracin menor tamao de poro. El rango de trabajo es aproximadamente entre 0,7% y 2% p/v. Con un gel 0,7% se obtiene una buena separacin (resolucin) de grandes fragmentos de ADN (510kb) y con uno 2% se resuelven mejor los fragmentos pequeos (0.21kb). Hay que tener en cuenta que los geles de bajo porcentaje son muy frgiles y se pueden romper al intentar levantarlas, y los de alto porcentaje suelen opacarse mucho, disminuyendo la visibilidad de las bandas. En lineas generales, 1% es una concentracin estandar. El ADN esta homogneamente cargada de forma negativa a pH neutro, por lo que la relacin carga:masa es constante. Su velocidad de migracin del ADN en la matriz de agarosa esta determinada por una serie de parmetros: Tamao del ADN Concentracin de agarosa Conformacin del ADN. Las distintas conformaciones de las molculas de ADN circular del mismo peso molecular migran a distinta velocidad: de mayor a menor velocidad, superenrollado circular, lineal y circular relajado. Voltaje aplicado. A bajo voltaje la velocidad de migracin de un fragmento lineal de ADN es proporcional al voltaje aplicado, as el rango efectivo de separacin decrece a medida que el voltaje se incrementa.
Introduccin a la Biologa Celular y Molecular
Presencia de colorante intercalante. El Bromuro de Etidio o Sybr green reduce la movilidad electrofortica del ADN lineal ya que el intercalante se introduce entre las bases, extendiendo la longitud del ADN lineal o nicked hacindolo mas rgido. Para preparar un gel de agarosa, se pesa el polvo de agarosa y se disuelve en el buffer (TBE 0,5X) en un recipiente de vidrio. Para fundir la agarosa se necesita calentar la mezcla, lo que generalmente se realiza con unos segundos en el microondas. Es importante dejar enfriar un poco la preparacin (hasta que podamos mantener el recipiente en la mano sin quemarnos!) antes de verterla en la cuba ya que sta es de plstico, y si el lquido est muy caliente puede romperla. Finalmente se coloca el peine para generar las calles, y se deja enfriar completamente.
Procedimiento
Cuantificacin de cidos nucleicos en solucin 1) Tomar 2 ul de la muestra de cidos nucleicos y agregar 98 ul de agua desionizada. Mezclar y transferir a una cubeta. 2) Medir en el espectrofotmetro la densidad ptica (OD) a 260 nm. 3) Para analizar la pureza de la muestra, tomar una segunda lectura a 280 nm. Determinar la relacin de OD a 260nm / OD a 280 nm. Si sta es aproximadamente 2 (de 1,6 a 2) la absorcin es mayoritariamente debida a cidos nucleicos. Si es menor a 1,6, hay protenas u otras molculas que absorben a la misma longitud de onda en la muestra y es recomendable una re-extraccin con fenol/cloroformo y precipitacin con etanol o isopropanol. UTILIZAR GUANTES PARA LA PREPARACIN Y MANIPULACIN DEL GEL PORQUE PUEDE CONTENER INTERCALANTES DE BASES QUE SON CANCERGENOS 1) Colocar 100 ml de la solucin de agarosa en un bao a 100 C o durante 90 segundos en un microondas hasta fundir la agarosa y observar un aspecto homogneo. La solucin contiene: Agarosa 1% en buffer TBE 0,5X. 2) Cuando la solucin se encuentre fundida y homognea dejarla enfriar hasta que se pueda tocar con la mano (de esta manera se evita que se rompa el soporte donde se monta el gel). Agitar y volcar la solucin en la cuba de electroforesis, que ya debe tener el peine y los separadores ubicados. Se debe evitar la formacin de burbujas. Esperar aproximadamente 15 minutos hasta que se enfre y solidifique. 3) Retirar cuidadosamente el peine. 4) Montar el gel en la cuba y agregar el volumen de TBE adecuado para cubrir el gel. 5) Preparar las muestras con loading buffer y Sybr Green teniendo en cuenta que se deben sembrar 5 g de ADN por muestra, el loading buffer est 5X y el Sybr Green est 10X. Sembrarlas en las distintas calles. Colocar el marcador de peso molecular en la primer o ltima calle. 6) Conectar a la fuente y correr a 70 voltios. 7) Finalizada la corrida, observar los resultados mediante un transiluminador con luz UV y fotografiar el gel.
