2. Mtodos de anlisis de aminocidos en alimentos. Mtodos oficiales. Determinacin de prolina en miel.

Reaccin de la prolina con ninhidrina en medio cido y posterior determinacin a 517 nm de la absorbancia del compuesto formado. Preparacin de la muestra: Suponiendo que la miel ya ha sido separada del panel por escurrimiento a travs de un filtro de luz de malla, optaremos por realizar el siguiente paso, la homogeneizacin. Reblandecer la muestra calentando entre 25-30C agitndola al mismo tiempo. Una vez homogeneizada se calienta a 50C al bao Mara hasta que se consiga la fusin y se deja enfriar rpidamente. Determinacin de hidroxiprolina en carnes. Previa hidrlisis en medio cido de las protenas y oxidacin de la hidroxiprolina. El derivado formado con el pdimetilaminobenzaldehido se valora colorimtricamente a 560 nm.. Preparacin de la muestra: Primero, se quitan las diferentes capas protectoras del producto para poder tomar una muestra representativa. Se parten trozos de 0,5 - 1 cm y se cortan dichos trozos en pequeos cubos. Despus se pasan por una trituradora varias veces hasta conseguir una mezcla homognea. Se guarda en frascos limpios y secos para prevenir la prdida de humedad. Se conserva enrefrigeracin de forma que evite su deterioro y cualquier cambio en su composicin. Mtodos estndares. Determinacin de prolina en miel. Determinacin de hidroxiprolina en carnes. Determinacin de aminocidos en preparados vitamnicos. Determinacin de lisina en suplementos nutricionales. Los grupos amino de las protenas reaccionan con DNFB dando lugar a los derivados lisina-DNFB. Posteriormente se produce una hidrlisis cida y la determinacin en un analizador de aminocidos de la lisina. Determinacin de triptfano en alimentos. La muestra es hidrolizada en medio bsico, seguidamente se realiza un ajuste de pH. El triptfano es separado por cromatografa lquida de intercambio inico y determinado por un detector UV a 280 nm. Determinacin de aminocidos sulfurados en alimentos (metionina y cistena). En primer lugar las protenas son oxidadas con cido perfrmico para conseguir cido cisteico y metionina sulfonada, luego se realiza una hidrlisis cida con HCl. Realizamos una cromatografa de intercambio inico aplicndole un detector que sea capaz de medir a 570 nm. Mtodos recomendados. Anlisis de aminocidos por HPLC seguido del mtodo del fenilisotiocianato. (Lab. Enzymology and Physical Chemistry of Proteins). A continuacin, incluimos un protocolo tpico del anlisis de aminocidos en harinas: - Dejar a reflujo la muestra con HCl 6N durante 24 horas. Evaporar a sequedad en evaporador rotatorio. - Aadir agua y evaporar a sequedad. - Realizar el examen cromatogrfico de una solucin problema al 10% de la muestra tratada en solucin acuosa de isopropanol a 10%. - El sistema solvente: n-butanol/Hac/H2O en proporcin [Link]. - Soporte papel Whatman n1. - Longitud del papel 50 cm. - Mtodo cromatogrfico descendente. - Duracin: 12 horas. - Solucin reveladora: solucin acetnica de ninhidrina al 0.25%. - Condiciones de revelado: 20 min a 105C. - Comparacin frente a muestras puras de clorhidratos de aminocidos. 3. Tcnicas de separacin de aminocidos. A menudo es necesario identificar y cuantificar los aminocidos individuales de una mezcla, tanto en estudios metablicos como en las investigaciones de la estructura de las protenas. El uso de la cromatografa en capa fina o de la electroforesis son adecuados para averiguar el nmero y la

cantidad relativa de los diferentes aminocidos presentes en una muestra (anlisis cualitativo), aunque para los anlisis cuantitativos es necesaria la cromatografa de gases o un analizador de aminocidos. Cromatografa en capa fina Una importante aplicacin de la cromatografa en capa fina es la de servir como gua para el desarrollo de las condiciones ptimas para realizar separaciones por cromatografa de lquidos en columna. Proporciona una idea rpida de los aminocidos mayoritarios existentes en la muestra. Las ventajas de este procedimiento son la rapidez y el bajo coste de los ensayos experimentales. De hecho, algunas cromatografistas son de la opinin de que los ensayos en capa fina deberan preceder siempre al uso de la columna. En la cromatografa de papel se pueden aplicar grandes volmenes de muestra, lo que permite la elucin posterior de un aminocido en particular para su posterior purificacin y anlisis, factor que tiene gran importancia en la identificacin de un constituyente desconocido de la muestra. Antes de la realizar la cromatografa, es necesario eliminar las sustancias que interfieren, tales como protenas, carbohidratos y sales, lo que puede hacerse con una resina de intercambio inico. Los aminocidos retenidos pueden eluirse a continuacin aadiendo a la columna un pequeo volumen de amoniaco y lavando despus con agua destilada. La separacin de los aminocidos se basa en que stos se reparten de modo diferencial entre la fase mvil y la fase estacionaria. Generalmente se realizan por el procedimiento ascendente: introduciendo el borde inferior de la placa cromatogrfica en el eluyente que ser succionado por accin de las fuerzas capilares del recubrimiento de la superficie de la placa. La identificacin de un aminocido se realiza comparando los valores de Rf (factor de retraso: cociente entre la distancia recorrida por el compuesto desde el origen y la distancia recorrida por el solvente desde el origen), con otros tomados como referencia, debindose utilizar al menos tres sistemas de disolventes distintos para establecer su identidad con un cierto grado de seguridad. La naturaleza de los aminocidos es un factor importante a la hora de elegir un disolvente, ya que los diferentes solventes pueden permitir una mejor resolucin de los componentes cidos, bsicos o neutros. En general, aumentando la proporcin de agua en el disolvente se incrementan todos los valores de Rf e introduciendo pequeas cantidades de amoniaco aumentan los valores del factor de retraso de los aminocidos bsicos. Algunos disolventes contienen compuestos nocivos, por ejemplo el fenol, lo que restringe su uso rutinario. La composicin qumica del disolvente puede tambin limitar el rango de reactivos de localizacin que pueden aplicarse satisfactoriamente. Por ejemplo, el cido sulfanlico no puede utilizarse con disolventes fenlicos. El poder de resolucin de la cromatografa de capa fina puede aumentarse empleando tcnicas bidimensionales, o sea, utilizando dos disolventes distintos. Se aplica una cantidad de muestra mayor que la utilizada generalmente para la separacin cromatogrfica de una dimensin (aproximadamente el triple) en una esquina del papel o placa y se hace correr en una dimensin. Entonces el cromatograma se seca completamente al aire, se gira un ngulo de 90 y se desarrolla con el segundo solvente. Tras un nuevo secado, se sumerge en el reactivo de localizacin elegido. En la cromatografa de dos dimensiones, la composicin de los dos disolventes es la que determina el orden en que debe utilizarse. Las separaciones bidimensionales permiten la resolucin de un gran nmero de aminocidos presentes en una muestra, ya que los que tienen una movilidad similar en la primera dimensin se separan en la segunda. sto es muy til en la deteccin de los componentes que estn en muy baja concentracin y pueden quedar enmascarados por otros compuestos que tengan una concentracin alta cuando se utiliza la cromatografa en una dimensin. Electroforesis. La electroforesis es un proceso en el cual las especies cargadas (iones o partculas coloidales) se separan en funcin de su distinta velocidad de migracin en un campo elctrico. Desde los aos cincuenta, las separaciones electroforticas fueron la piedra angular de gran parte de la investigacin de qumicos y bilogos moleculares relacionada con la separacin y anlisis de protenas, polinucletidos y otros biopolmeros. Estas separaciones han sido (y continan siendo) muy eficientes y de una extensa aplicacin, pero por desgracia, son unas tcnicas muy lentas y laboriosas que tienen tendencia a ser poco reproducibles. A mediados de los ochenta, esta situacin cambi espectacularmente con la aparicin de aparatos comerciales para realizar electroforesis analticas a microescala en columnas capilares (electroforesis capilar). El hecho de que los distintos aminocidos transporten diferentes cargas netas a un pH particular, permite separarlos de una mezcla mediante la electroforesis de alto o bajo voltaje. Los medios utilizados ms

frecuentes como soporte son el papel o las placas de capa fina (celulosa o gel de slice), pudindose utilizar para visualizar las manchas, los reactivos de localizacin que describiremos ms adelante. Las separaciones se pueden realizar ms fcilmente con alto que con bajo voltaje, siendo una de las principales ventajas de la primera, el que las sales y otras sustancias presentes en la muestra afectan en menor extensin la calidad del electroforetograma. A pesar de que se pueden conseguir separaciones electroforticas con tmpones a distintos pH, en la prctica los valores de pH escogidos estn entre 2 y 53. A pH 2 todos los aminocidos tienen carga positiva y los de tipo bsico que tienen la mayor carga positiva migran ms rpidamente hacia el ctodo, mientras, que a pH 5 los aminocidos se dirigen hacia ambos electrodos, dependiendo de la carga transportada. Las separaciones a pH 53 se utilizan para determinar la naturaleza cida o bsica de un aminoci do desconocido. Cromatografa de gases. Se han hecho muchos ensayos para aprovechar la velocidad y sensibilidad que ofrece la cromatografa de gases, pero aunque se han realizado considerables progresos en el desarrollo de tales mtodos, an no se utiliza de forma rutinaria para el anlisis de aminocidos en muestras biolgicas. La razn de sto radica en el hecho de que los aminocidos, aunque similares, son compuestos qumicamente heterogneos y adems no son suficientemente voltiles a menos que se conviertan en algn derivado apropiado. Aparecen dificultades no slo a la hora de elegir el mtodo de obtencin de tales derivados, sino tambin en la seleccin de una fase estacionaria que sea capaz de resolver los derivados de todos los elementos de un grupo tan diverso de compuestos. A lo hora de elegir el detector aparecen tambin problemas similares. Analizador automtico de aminocidos - HPLC. Existen dos tcnicas para la determinacin de aminocidos a travs de cromatografa lquida: cromatografa de reparto en fase reversa y cromatografa de intercambio inico. La cromatografa de lquidos de alta resolucin es la tcnica de separacin ms ampliamente utilizada. Las razones ms importantes son su sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial inters en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen los aminocidos, protenas, cidos nucleicos y otros. Cromatografa de reparto en fase reversa. La cromatografa en fase reversa consiste en un disolvente fundamentalmente polar como fase mvil y una cadena hidrocarbonada ligada como fase estacionaria. Algunas de las ventajas ms sustanciales de esta alternativa son su gran reproducibilidad, tiempos de retencin cortos, velocidad de muestreo alta, sistema cromatogrfico simple y amplio campo de aplicacin. Por todo ello, las aplicaciones son cada vez ms numerosas. La selectividad se basa en las interacciones especficas entre el soluto y la fase mvil, ya sea de tipo polar, de formacin de puentes de hidrgeno o mediante equilibrios secundarios provocados al variar la composicin de la fase mvil (cido-base, formacin de complejos o pares inicos, adicin de complejos metal-ligando o reactivos quirales para separar los ismeros pticos, etc.). Cromatografa de intercambio inico. La cromatografa inica est relacionada con los mtodos modernos y eficaces para la determinacin de iones que se basan en el uso de resinas de intercambio inico. Existen mtodos automatizados para la separacin y deteccin de aminocidos y otras especies inicas en mezclas complejas. El desarrollo de la HPLC moderna empez a finales de los aos sesenta, pero su aplicacin a la separacin por intercambio inico se retraso debido a la inexistencia de un mtodo general y sensible para la deteccin de especies como los cationes alcalinos y alcalinotrreos, y aniones como los haluros, acetato y nitrato. Esta situacin se remedi en 1975 al desarrollarse por tcnicos de Dow Chemical Company la tcnica de supresin del efluente, la cual hace posible la deteccin conductimtrica de los iones eludos. El analizador de aminocidos, con el que se lleva a cabo la cuantizacin de los aminocidos se basa en esta tcnica. Analizador automtico de aminocidos. La separacin de aminocidos fue el primer proceso cromatogrfico automatizado con derivatizacin post-columna. La separacin fue llevada a cabo por Moore, Spackman y

Stein (1958), mediante un intercambio inico, seguido de su cuantizacin de cada componente eluido de la columna por reaccin con ninhidrina y posterior deteccin en el visible. Este mtodo se ha realizado durante ms de treinta aos, en cualquier laboratorio de protenas. El equipo usado actualmente se basa en el original pero introduciendo algunas modificaciones para conseguir un mejor grado de eficacia. Consiste en bombear tampones de pH o de fuerza inica variables, a travs de una columna termostatizada. Entre las novedades est la fabricacin de resinas de alta calidad, desarrollo del HPLC, sistemas de automatizacin sofisticados y un aumento en la sensibilidad de los mtodos de deteccin. La separacin tiene lugar en una columna de resina de poliestireno sulfonado. Inicialmente el pH de la fase mvil es bajo, por lo que los aminocidos cargados positivamente se vern atraidos por los grupos sulfurosos ( SO3- ). Conforme se va aumentando el pH del tmpon los aminocidos se eluyen diferencialmente al disminuir su carga positiva y ser menos atraidos por el anin. A pH 3.5 los aminocidos con un grupo cido extra, de su cadena tendrn muy poca afinidad por la resina y sern los primeros en salir de la columna, mientras que los que tengan un grupo extra ionizable capaz de transportar una carga positiva (e.g. lisina, histidina) sern retenidos fuertemente por la resina y se eluirn slo cuando el pH haya aumentado sustancialmente y se haya reducido su carga neta positiva. Adems del pH tambin hay que considerar la concentracin del tampn eluyente, pues influye en la elucin de tal modo que cuando la concentracin de ion aumenta en mismo, los aminocidos se eluyen ms rpidamente. Las interacciones no inicas entre los aminocidos y la resina tambin influyen en la secuencia de elucin, permitiendo que algunos aminocidos que tienen un comportamiento similar se eluyan de forma separada. La resolucin cuantitativa de mezclas de aminocidos se consigue variando la composicin del tmpon, bien incrementando del pH y manteniendo constante la concentracin, o viceversa, o incluso variando ambos. Hay otros factores menos significativos en la calidad de la separacin como son la temperatura, la velocidad de flujo del tampn o el tipo de catin utilizado. Aspectos prcticos del analizador: Columna: en los analizadores tipo se usan dos columnas, una para separar los aminocidos cidos y neutros y otra para los bsicos. Las de vidrio o acero inoxidable dan picos estrechos y altos, mejorando la separacin de aminocido similares. Solucin tampn: suele ser citrato sdico o de litio, al que se le aade un detergente, un antioxidante y un conservante. Actualmente se utilizan dos disoluciones tampn, una cida y otra bsica. Se mezclan en proporciones variables para conseguir un aumento de pH. De esta forma se mejora la separacin disminuyendo el tiempo de anlisis y se eliminan las fluctuaciones bruscas de la linea base debidas a cambios repentinos en el tampn, como sucedia con anteriores tcnicas. Temperatura: puede ser constante para evitar cambios en el pH y en la ionizacin de los aminocidos, o bien puede utilizarse un programa de temperaturas que implica un cambio de sta en diversos momentos del proceso. Flujo de la columna: se requiere un flujo de tampn constante para permitir la reproducibilidad. Se consigue por uso de bombas de presin o de desplazamiento constante. Deteccin: es necesaria una segunda bomba para el reactivo derivatizante (generalmente ninhidrina) que se ha de mezclar con el eluyente de la columna. Cuando la reaccin ha tenido lugar, la corriente se controla en una clula de flujo de un colormetro o un fluormetro. Se mide la absorbancia continuamente a 570 y 440 nm. para detectar los amino e iminocidos respectivamente. El anlisis aminoacdico es un buen ejemplo del hecho de que raramente hay un nico sistema de separacin para problemas analticos, sino que de la eleccin del sistema apropiado depende el problema analtico. Por ejemplo, de la matriz en la cual los aminocidos van a ser determinados, de la sensibilidad deseada y en la velocidad requerida para el anlisis. Los actuales mtodos de deteccin para aminocidos dependen de la reaccin del grupo amino primario del aminocido para formar un derivado coloreado o fluorescente, esta derivatizacin tiene lugar tanto

antes como despus de que la separacin de los aminocidos haya sido efectuada. La menor variedad de tipos de aminocidos en comparacin con las estructuras de los pptidos hace que los modos de HPLC disponibles para el investigador sean la cromatografa de intercambio catinico (CEC), y la cromatografa de fase reversa (RPC). La cromatografa en fase reversa es ms apropiada para la separacin de derivados aminoacdicos que para aminocidos libres. La eleccin de HPLC est limitada por la eleccin del agente de derivatizacin y/o la decisin de usar tanto pre- como post-columna de derivatizacin, de hecho, algunos de los ms interesantes descubrimientos llevados a cabo en la separacin de aminocidos por HPLC reside en el desarrollo y optimizacin de nuevos agentes de derivatizacin. Reacciones muy rpidas como la derivatizacin con fluorescamina y ortoftaldehido (OPA) estn siendo empleadas en aumento con el clsico mtodo de la ninhidrina. Leer ms: [Link] 4. Reactivos de derivatizacin. El problema de la derivatizacin de aminocidos est concentrado en la deteccin selectiva y sensible de los mismos. Las cantidades de muestra disponibles son muy pequeas, ya sean protenas cuya estructura vaya a ser determinada o muestras de investigaciones en el campo de la ciencia alimenticia, de modo que la reaccin de derivatizacin debera permitir la deteccin en el rango del pmol. La derivatizacin puede ser llevada a cabo antes de la separacin. Debera ocurrir cuantitativamente para producir productos sencillos para cada aminocido, el reactivo no debera interferir. Es probable que la derivatizacin genere productos que son ms parecidos el uno al otro, de cualquier modo, la alta selectividad de separacin de los sistemas cromatogrficos implica que raramente hayaproblemas. La derivatizacin precolumna puede ser llevada a cabo automticamente inmediatamente antes de la separacin. La derivatizacin tras la separacin requiere, en general, una complejidad instrumental mayor. Los instrumentos comerciales a menudo necesitan ser optimizados para alcanzar sensibilidad de deteccin ms alta. Ninhidrina. La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con los aminocidos en medio cido (pH entre 3 y 4) y en caliente produciendo amoniaco, dixido de carbono y un complejo de color prpura azulado. Todos los aminocidos primarios forman el mismo complejo tras su reaccin con ninhidrina, haciendo este agente inapropiado para la precolumna de derivatizacin. La mayora de columnas de HPLC de intercambio catinico utilizadas para el anlisis de aminocidos con postcolumna basada en la ninhidrina todava emplean resinas de sulfonato de poliestireno/divinilbenceno. Los primeros sistemas automticos para el anlisis de aminocidos descritos en 1958 basados en la separacin de aminocidos por cromatografa de intercambio catinico y posterior reaccin con ninhidrina, permanecen hoy da como la metodologa ms fiable para el anlisis de aminocidos en pptidos y protenas. Analizadores comerciales basados en esa metodologa estn disponibles en compaas como Beckman y Pharmacia. A altas temperaturas ( 100C), todos los aminocidos primarios reaccionan con dos molculas de ninhidrina para formar un cromforo (prpura de Ruthermann) con mxima absorcin a 570 nm. En la cuantificacin de los aminocidos individuales puede utilizarse el coeficiente de absorcin molar del compuesto coloreado, aunque su valor vara de un aminocido a otro y debe determinarse para las condiciones particulares del anlisis. Sin embargo, se debe escoger un valor de referencia para utilizarlo en la cuantificacin de los aminocidos totales de una mezcla. La reaccin coloreada de la ninhidrina se utiliza en trabajos analticos, as como en la visualizacin de las bandas de los aminocidos despus de su separacin por electroforesis o por cromatografa. El reactivo que se utiliza en estas circunstancias se prepara generalmente disuelto en etanol; cuando se aade 2,4-6colidina, las diferencias de color entre cada mancha ayudan a la identificacin de los distintos aminocidos. OFtaldehido (OPA). El OPA fue originalmente introducido como un reactivo alternativo a la ninhidrina en la postcolumna de derivatizacin y suministr un significante incremento en la sensibilidad. Los aminocidos reaccionan con el OPA en presencia de un reductor fuerte, en condiciones alcalinas (pH 9-11), dando un compuesto

fluorescente. La separacin en fase reversa seguida de deteccin fluorescente constituye un mtodode deteccin rpido, sensible y selectivo para todos los aminocidos con grupos amino primario. Los pptidos son menos reactivos que los -aminocidos y las aminas secundarias no reaccionan. Aunque el OPA fue originalmente aplicado solamente para postcolumnas de derivatizacin ahora est ampliamente usado como un agente para precolumnas. Mientras que la separacin de aminocidos siguiente a una precolumna de derivatizacin est llevada a cabo por cromatografa de fase reversa, ambas, cromatografa de fase reversa y cromatografa de intercambio catinico pueden ser utilizadas cuando el OPA es el agente de derivatizacin en la postcolumna. Una desventaja del OPA reside en la relativa inestabilidad de sus derivados, quizs aadida a los problemas de cuantizacin, aunque sto no es de gran dificultad en la tcnica de derivatizacin en postcolumna. Sin embargo, en precolumna y desde el punto ms bajo de pH 72 hasta un pH tpico de reaccin de 95, los productos deben ser inmediatamente aplicados a un sistema cromatogrfico. Bajando estos dos pH se amortigua la reaccin y sirve para estabilizar ligeramente los productos de reaccin. La mayor desventaja del OPA es que no reacciona con aminas secundarias (prolina e hidroxiprolina) aunque sto puede ser solventado con su oxidacin por cloramina-T o hipoclorito. Una estratgica combinacin del uso de OPA con FMOC (9fluorenilmetil cloroformato) ha sido recientemente introducida para solucionar esta deficiencia. El mtodo con OPA se utiliza especficamente con precolumna de derivatizacin para el anlisis de aminocidos porque es ms sensible y tarda menos tiempo que otros mtodos HPLC. Fluorescamina. La fluorescamina fue tambin introducida como una posible alternativa a la ninhidrina en postcolumnas de derivatizacin. Todas las aminas primarias reaccionan con la fluorescamina en medio bsico (pH 9-11) dando un producto fluorescente con un incremento en sensibilidad de deteccin mayor que la ninhidrina, aunque la fluorescamina por si misma no tiene fluorescencia. El producto fluorescente es inestable en disolucin acuosa y el reactivo debe prepararse en acetona. Las aminas secundarias no reaccionan, a menos que se conviertan previamente en aminas primarias, lo que puede hacerse con N-clorosuccinimida, hipoclorito o cloramina-T. Aunque el reactivo tiene inters por su rpida velocidad de reaccin con los aminocidos a temperatura ambiente, la reaccin no es tan sensible como la de la ninhidrina. Isotiocianato de fenilo (PITC). El PITC, tambin conocido como reactivo de Edman, ha sido largamente usado para la secuenciacin de polipptidos y protenas y fue introducido para el anlisis de aminocidos al principio de los aos ochenta. Es actualmente, el agente ms usado para precolumnas de derivatizacin, seguido de cromatografa en fase reversa, en anlisis de aminocidos, siendo empleado para mezclas de aminocidos de una gran variedad de fuentes. En lugar de ser analizados como derivados de PTH (feniltiohidantoin), como ocurre durante la secuenciacin de pptido o protenas, los aminocidos son analizados como derivados de PTC (feniltiocarbamol). As, a pH alcalino, los aminocidos primarios y secundarios producen derivados de PTC, que pueden ser registrados por absorbancia UV (240-255 nm) con un lmite de deteccin en el rango de 5 a 50 pmol. Todos los aminocidos forman derivados mono-PTC, excepto lisina y cistena, que producen dobles formas PTC. Los productos son relativamente estables, aunque alguna conversin al derivado PTH puede ocurrir si el pH no se controla adecuadamente. Aunque la metodologa PITC puede ser considerada superior al resto de las tcnicas en un gran nmero de aspectos, tiene una mayor desventaja en que algunos derivados PTC de aminocidos son fuertemente afectados por la presencia de algunas sales, cationes divalentes, metales e iones tampon. As, mientras el acetato amnico, el cloruro sdico y el borato sdico se ha encontrado que no tienen efecto en aminocidos PTC, otras sales, como el fosfato de sodio y el bicarbonato de sodio si que lo tienen. Adems la contaminacin por trazas de iones metlicos se ha encontrado que reduce la formacin de aminocidos PTC. Incluso aadiendo EDTA se han conseguido mejores rendimientos para la derivatizacin. Cloruro de dansilo y cloruro de dabsilo. El cloruro de dansilo (cloruro de 1-dimetilaminonaftaleno-5-sulfonilo) fue inicialmente introducido para el anlisis del nitrgeno terminal de los aminocidos en pptidos y protenas, un propsito para el cual todava es empleado. Reacciona con aminas primarias y secundarias para producir derivados fluorescentes. Su aplicacin adolece de la presencia de numerosos productos laterales y de la formacin de mltiples derivados

de ciertos aminocidos. Adems de sto est el requerimiento de un largo tiempo de reaccin. As, aunque el cloruro de dansilo es frecuentemente empleado por lo investigadores para la derivatizacin en precolumna seguida de cromatografa en fase reversa, este mtodo nunca ha sido ampliamente aceptado para el anlisis automtico de aminocidos. El cloruro de dabsilo (cloruro de dimetilaminoazobencenosulfonilo) es un agente muy relacionado con el cloruro de dansilo. Fue introducido y desarrolla por Chang y sus colaboradores, para la deteccin de aminocidos en el rango del visible y en el nivel del pmol. Reacciona con aminocidos primarios y secundarios para producir derivados que tienen una gran absorbancia en el rango del visible. La reaccin se realiza a unos 70C y un pH de 8 a 85, produciendo derivados altamente estables en 10 o 12 m inutos. Se forman mono y bis-derivados de lisina, tirosina e histidina. A pesar de las ventajas sobre el cloruro de dansilo como agente de derivatizacin, la tcnica del cloruro de dabsilo tiene una tolerancia limitada a la presencia de sales, y aun no est clara cmo se vera afectada la deteccin a altos niveles de sensibilidad (rango del 10 al 20 pmol) por la presencia de metales, sales y otros contaminantes. Aunque no se usa ampliamente en anlisis automticos de aminocidos como la ninhidrina, el OPA y el PITC, una adaptacin comercial del mtodo del cloruro de dabsilo est disponible en Beckman Instruments. Cloruro de 9-Fluoroenilmetil cloroformato (FMOC-Cl). El FMOC-Cl reacciona con grupos amino para formar derivados carbamados altamente fluorescentes y estables. Este agente altamente reactivo, originalmente y todava usado como grupo amino protector en sntesis de pptidos, fue primeramente aplicado como un agente derivatizante en precolumna para anlisis de aminocidos. El FMOC-Cl reacciona con todos los aminocidos a pH alcalino y temperatura ambiente para producir derivados aminoacdicos altamente estables que tienen una fluorescencia comparable a los derivados de OPA. Se pueden formar mono- y bis-derivados con histidina, tirosina y lisina. Las proporciones relativas de estos derivados varan en funcin del pH y de la proporcin de reactivo y aminocido. Durante la reaccin con FMOC-Cl, los productos de hidrlisis del reactivo que se forman tienen fluorescencia parecida a la de los derivados aminoacdicos. Estos productos interfieren en la separacin por cromatografa de fase reversa a menos que sean eliminados por el disolvente orgnico de extraccin, antes de aplicar la muestra a la columna de cromatografa de fase reversa. Una versin automatizada de este procedimiento de derivatizacin ha sido desarrollada y comercializada. Betnr y Foldi solucionaron el problema de las interferencias por la elucin de grandes picos de FMOC-Cl y sus productos de hidrlisis, FMOC-OH, que son eludos en la misma regin cromatogrfica que muchos de los aminocidos FMOC, por derivatizacin del volumen de exceso FMOC-Cl con una amina hidrofbica. El derivado resultante es eludo ms tarde en el cromatograma despus de todos los aminocidos FMOC. Una combinacin entre OPA/FMOC ha sido descrita, la cual usa un analizador comercialmente disponible (Hewlett-Packard Amino Quant). La reaccin de aminocidos primarios es llevada a cabo inicialmente por OPA, seguida por la reaccin de prolina e hidroxiprolina con FMOC. La determinacin de la fluorescencia para los derivados de aminocidos primarios OPA y FMOC-prolina es llevada a cabo entonces a longitudes de onda apropiadas. 7-cloro y 7-fluro-4-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole (NBD-Cl y NBD-F). Reactivos de derivatizacin basados en la estructura del nitrobenzofurazan, NBD-Cl y NBD-F, tienen probada utilidad para aplicaciones especficas en el anlisis de todos los aminocidos. El NBD-Cl fue introducido por Ghosh y por Whitehouse como un agente fluorignico para aminas, incluyendo aminocidos y posteriormente Rot como una til herramienta para el anlisis de aminocidos, particularmente por su realzada reactividad con aminas secundarias. Desde entonces, este reactivo ha tenido empleo ocasionalmente para la deteccin de aminocidos, con particular nfasis en la deteccin de prolina e hidroxiprolina. NBD-Cl ha sido aplicado a la derivatizacin en pre- y post-columna, con un lmite de deteccin en stas ltimas de 1 nmol para prolina e hidroxiprolina y un lmite de deteccin en las primeras algo menor. Aunque NBD-Cl es estable y permite una deteccin sensible de aminocidos, reacciona algo ms despacio con aminas y no ha tenido un uso extendido como agente analtico general para aminocidos. NBD-F es ms reactivo que su anlogo de cloro, permitiendo una derivatizacin ms rpida, acompaada de una gran fluorescencia para prolina e hidroxiprolina. De forma similar al NBD-Cl, el NBD-F ha sido aplicado tanto a derivatizaciones precolumna como postcolumna. Los lmites de deteccin para la precolumna estn definidos en el rango de 5-15 fmol para la mayora de los aminocidos. El NBD-F tampoco ha sido utilizado

ampliamente como mtodo analtico para aminocidos, aunque algunos investigadores emplean este reactivo habitualmente. Otros reactivos derivados del isotiocianato. El 4-N,N-dimetilamino-4-azobencenoisotiocianato (DABITC) ha sido usado satisfactoriamente en la secuenciacin manual y anlisis de nitrgeno terminal de pptidos y protenas. La degradacin tipo Edman de pptidos y protenas efectuada por este agente produce derivados tiohidantoin coloreados (DABTH), que pueden ser separados por cromatografa de fase reversa. El mtodo de degradacin generalmente comprende un doble acoplamiento, primero con DABITC y luego con PITC. La 4-N,N-dimetilnaftilazobenzeno homologa del DABITC (DANABITC) ha sido tambin aplicada con xito, aunque en menor grado que el DABITC. Difenilindenonilisotiocianato (DIITC) ha sido estudiada para ser utilizada cuando la espectrometra de masas por ionizacin qumica es acoplada con identificaciones previas por cromatografa de fase reversa. La deteccin de derivados de tiohidantoin (DITH) se lleva a cabo por determinacin UV (en el rango por debajo del pmol). La deteccin electroqumica es un utensilio alternativo. Otros reactivos isotiocianatos de derivatizacin precolumna son 4-(t-butiloxicarbonilaminometil)fenil isotiocianato (BAMPITC, deteccin fluorescente), trimetilsisil isotiocianato para anlisis de secuencia de carbono terminal (deteccin UV) y p-N,N-dimetilaminofenil isotiocianato (DMAPI) como una instrumento electroqumico para el anlisis de aminocidos. Reactivos mixtos. Otros reactivos estn siendo continuamente desarrollados y utilizados para detecciones de aminocidos. Algunos tienen aplicaciones muy especficas y limitadas, mientras otros son tratados como posibles competidores para amplios usos en sistemas automticos. Tales reactivos incluyen el cido 2,4,6trinitrobencensulfnico (TNBS) y su anlogo 2,4-dinitrobenceno (DNBS), N,N-dietil-2,4-dinitro-5-fluoroanilina, fluoro-2,4-dinitrobenceno, cido 1,1-difenilbrico y 1-fluoro-2,4-dinitrofenil-5-L-alanina amida (reactivo de Marfey). La deteccin fluorescente es posible cuando se emplean reactivos tales como pentano-2,4diona/formaldehido, 9-antrildiazometano, cloruro laril, 2,3-naftaleno-dicarboxialdehido, succinimida naftilcarbamato, 3-benzoil-2quinolina-carboxaldehido, 9-hidroximetilantraceno e isotiocianato fluorescente y 1naftil isocianato. Un reactivo quimioluminiscente, 4-isocianatoftalhidrazida, tambin ha sido investigado. Con excepcin del pentano-2,4-diona/formaldehido, donde el reactivo fue usado en derivatizacin postcolumna seguida de intercambio inico HPLC de aminocidos, todos los dems fueron utilizados para la derivatizacin previa de cromatografa de fase reversa. En la siguiente tabla se pueden comparar las diferentes caractersticas de los reactivos de derivatizacin ms importantes para la determinacin de aminocidos: REACTIVOS DE DERIVATIZACIN Complejos con: 1os OPA Fluorescamina PITC Cloruro de dansilo Cloruro de dabsilo FMOC-Cl 1os 1os 1os y 2os 1os y 2os 1os y 2os 1os y 2os Mtodo de separacin CIC o electroforsis CFR (en postcolumna,CIC) CIC o electroforsis CFR CFR CFR CFR Post- o precolumna PostPre- y postPostPrePrePrePreDeteccin VIS 570 nm Fluorescencia Fluorescencia UV 240-255 nm Fluorescencia VIS Fluorescencia

NBD-Cl NBD-F

1os y 2os 1os y 2os

CFR CFR

Pre- y postPre- y post-

Fluorescencia Fluorescencia

Preparacin de las muestras. La reaccin con los derivatizantes forma el mismo cromforo con las aminas primarias que con las secundarias, por tanto las muestras deben estar libres de sales y lpidos antes de que tengan lugar la hidrlisis y los pasos de derivatizacin. La mayor causa de los bajos rendimientos en las reacciones de derivatizacin es la presencia de contaminantes en la muestra, como son las sales no-voltiles, detergentes y lpidos. Las sales y los tmpones interfieren tanto en la hidrlisis como en la posterior derivatizacin, distorsionan la cromatografa y aaden picos extra al cromatograma. Las sales pueden ser eliminadas de las protenas y de los pptidos usando tmpones voltiles y HPLC de fase reversa, precipitacin, dilisis o columnas de filtracin de gel. 5. Derivatizacin pre-columna frente a post-columna Las opiniones de investigadores sobre los ventajas relativas de la derivatizacin antes o despus del HPLC, de aminocidos sern determinadas por los requerimientos de la aplicacin especfica. Factores como la sensibilidad requerida en la deteccin, cantidad de muestra disponible, tipo de muestra, fuente de muestra, velocidad de anlisis y reproducibilidad e incluso consideraciones econmicas influirn en la eleccin entre la derivatizacin pre- o post-columna de aminocidos. Derivatizacin post-columna. La derivatizacin siguiendo a una cromatografa de intercambio catinico de aminocidos libres tiene distintas ventajas, con tal de que la instrumentacin produzca velocidades y temperaturas de reaccin reproducibles. Adems, para la derivatizacin no es necesario proceder al completo, y los problemas de estabilidad del derivado son insignificantes. Otras ventajas son que laautomatizacin es fcil y que el tiempo consumido y la prdida a causa de la preparacin de la muestra son innecesarias. Tambin pueden ser usados detectores en serie. Una gran cantidad de experiencias han sido adquiridas del tradicional mtodo de intercambio catinico y tincin con ninhidrina, el cual ha resultado ser fiable, preciso y capaz de una separacin excelente de mezclas complejas de aminocidos y sus metabolitos. Una desventaja con un sistema HPLC convencional es que son necesarios instrumentos ms complejos que para el mtodo de pre-columna. La derivatizacin post-columna requiere la adicin de una o ms bombas para los disolventes y reactivos derivatizantes. Tambin se requiere la adicin de un reactor post-columna, el cual llevar a un ensanchamiento de banda adicional, y por esto, un decrecimiento en la sensibilidad de deteccin. La columna de elucin es continuamente diluida por el reactivo derivatizante, provocando un descenso en la sensibilidad de deteccin. As, la mxima sensibilidad alcanzable por derivatizacin post-columna ser menor que en el caso de la precolumna. Derivatizacin pre-columna. sta, acoplada con cromatografa de fase reversa en lugar de con cromatografa de intercambio catinico, fue originalmente introducida como respuesta al incremento en la demanda de mayor sensibilidad y mayor velocidad de anlisis. Las ventajas de la metodologa de la derivatizacin precolumna incluyen simplicidad, velocidad y alta sensibilidad. Por ello, si se requiere mxima sensibilidad de deteccin, un reactivo fluorescente combinado con la derivatizacin pre-columna es el mtodo ms indicado. Como desventaja est la necesidad de garantizarse la completa reaccin del reactivo derivatizante y la posibilidad de interferencia con la separacin por exceso de reactivo, el medio de reaccin o la produccin de diferentes derivados de un componente. Adems, la estabilidad del derivado puede ser un importante factor durante la derivatizacin pre-columna, la demora entre la derivatizacin y la inyeccin llega a ser fundamental para los resultados obtenidos. 6. Bibliografa. David J. Holme y Hazel Peck, Bioqumica Analtica, Longman Group Limited, 1983. Hans-Dieter Belitz y Werner Grosch, Qumica de los Alimentos, Springer-Verlag GmbH & Co., 4 edicin. Adolfo Leandro Montes, Bromatologa, Editorial Universitaria de Buenos Aires, 2 edicin, 1981. Valcarcel-A. Gmez, Tcnicas Analticas de Separacin, Ed. Revert S.A., 1994. Skoog y [Link], Anlisis Instrumental, Ed. McGraw Hill Interamericana, 1994. Mtodos Oficiales de Anlisis, Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentacin, Direccin General de Poltica Alimentaria. 1986. Methods of Analysis of AOAC, Association of Official Analytical Chemist, 1995.

Autor: scar Burriel Lpez Daniel Salavera Muoz Vctor M. Gimeno Gil

Leer ms: [Link]